技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物發(fā)酵
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其是涉及一種用于生物纖維素發(fā)酵的混合發(fā)酵菌劑及用其發(fā)酵制備生物纖維素的方法。
背景技術(shù)：
：生物纖維素（Biocellulose），又被稱為細(xì)菌纖維素（Bacterialcellulose，BC），其是由醋酸菌屬的微生物，如木醋桿菌等發(fā)酵制成的纖維素產(chǎn)品。目前多以廢棄物，如椰子水、菠蘿皮汁等作為原料，因此其成本低廉。得到的產(chǎn)品中含有高達(dá)95%以上的水分，因此又被稱為生物纖維素凝膠。生物纖維素凝膠的制備方法是本領(lǐng)域已知的，如CN101671708、CN1840677A、CN101319242A中均有所公開。生物纖維素與植物纖維素相比無木質(zhì)素、果膠和半纖維素等伴生產(chǎn)物，具有高結(jié)晶度（可達(dá)95%，植物纖維素的為65%）和高的聚合度(DP值2000～8000)；其具有超精細(xì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，生物纖維素纖維是由直徑3～4納米的微纖組合成40～60納米粗的纖維束，并相互交織形成發(fā)達(dá)的超精細(xì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)；其彈性模量為一般植物纖維的數(shù)倍至十倍以上，并且抗張強(qiáng)度高；生物纖維素有很強(qiáng)的持水能力，同時(shí)具有較高的生物相容性、適應(yīng)性和良好的生物可降解性。生物纖維素凝膠現(xiàn)有的產(chǎn)品主要用于食品、化妝品中，如用于制作果凍、酸奶，增加膳食纖維的攝入；或者用于制作面膜產(chǎn)品的載體。現(xiàn)有的生物纖維素發(fā)酵生產(chǎn)都是采用單一菌種發(fā)酵，如木醋桿菌、葡糖桿菌等；但是這些菌種在發(fā)酵時(shí)，通常具有發(fā)酵水平較低，產(chǎn)量低、成本高、成品價(jià)格不抵普通植物纖維素等缺陷。生物纖維素產(chǎn)量一般維持在4-8g/L。還原糖轉(zhuǎn)化率也僅僅在20%以下，發(fā)酵水平非常低。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是提供一種用于生物纖維素發(fā)酵的混合發(fā)酵菌劑，包含木葡糖酸醋桿菌、運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌、以及雙歧桿菌和/或嗜酸乳桿菌。其中所述木葡糖酸醋桿菌、運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌、以及雙歧桿菌和/或嗜酸乳桿菌之間的比例為10-20:7-15:3-8。優(yōu)選為17:11:5。其中所述菌株使用前經(jīng)過活化培養(yǎng)。所述菌株之間的比例為活化后再擴(kuò)培得到的種子液的體積比。本發(fā)明是將上述菌株在使用前提前活化，然后經(jīng)擴(kuò)培后得到其相應(yīng)的種子液，然后按照上述比例（種子液體積比）接種入生物纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基中，在適當(dāng)條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。所述發(fā)酵溫度優(yōu)選為25-35度，發(fā)酵時(shí)間為3-10天。所述發(fā)酵為淺盤靜態(tài)發(fā)酵或搖瓶或發(fā)酵罐動(dòng)態(tài)發(fā)酵。所述發(fā)酵時(shí)pH值控制在6.2-7.2之間。所述發(fā)酵用培養(yǎng)基中含有供所述菌株分解的碳源。本發(fā)明采用的混合菌株，尤為適用于生物纖維素淺盤靜態(tài)發(fā)酵。一般情況下，采用木醋桿菌或葡糖桿菌單一菌種發(fā)酵時(shí)，淺盤靜態(tài)發(fā)酵容器在接種發(fā)酵1天后即會(huì)在容器表面形成透明膜狀纖維凝膠，此凝膠的形成會(huì)大大阻礙發(fā)酵培養(yǎng)基表面與空氣的接觸，從而使得培養(yǎng)基中的含氧量大幅降低。這對(duì)于后續(xù)的發(fā)酵過程中發(fā)酵菌種對(duì)于碳源如葡萄糖或果糖的利用程度會(huì)大幅降低，從而降低最終的生物纖維素膜產(chǎn)量。而本發(fā)明采用至少三種菌株混合發(fā)酵培養(yǎng)，其中的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌屬革蘭氏陰性細(xì)菌，微好氧生長(zhǎng)，可以通過ED代謝途徑將葡萄糖和果糖轉(zhuǎn)化為乙醇。且其高度耐酸、高度耐受酒精、高度耐受葡萄糖，能在pH3.5～7.5之間生長(zhǎng)，在乙醇濃度5.5%條件下可以無影響生長(zhǎng)，在含有20%濃度葡萄糖環(huán)境中可以正常生長(zhǎng)；同時(shí)運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)需求相對(duì)簡(jiǎn)單。故而在本發(fā)明的混合菌株初始發(fā)酵時(shí)，木葡糖酸醋桿菌和運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌同時(shí)分解利用葡萄糖、果糖或蔗糖等碳源，但運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌利用還原糖能力強(qiáng)，營(yíng)養(yǎng)需求簡(jiǎn)單，快速增值，可以把培養(yǎng)基中初始含量較高的碳源如葡萄糖、果糖等分解成乙醇，乙醇和剩余的葡萄糖等又可以同時(shí)供木葡糖酸醋桿菌發(fā)酵使用，此時(shí)木葡糖酸醋桿菌為優(yōu)勢(shì)菌株，成膜階段開始。培養(yǎng)基中會(huì)積累一定含量的醋酸，pH值降低。此時(shí)雙歧桿菌或嗜酸乳桿菌或者兩者的結(jié)合可以在一定程度上分解醋酸，調(diào)節(jié)pH值；故而混合菌株之間互惠互利，形成共生的局面?？梢匝娱L(zhǎng)生物纖維素凝膠膜形成的時(shí)間，提高碳源還原糖轉(zhuǎn)化率，從而大大提高生物纖維素發(fā)酵產(chǎn)膜的能力。同時(shí)，由于本發(fā)明的菌株中含有雙歧桿菌或嗜酸乳桿菌等益生菌，制備得到的生物纖維素膜中也會(huì)含有少量的益生菌，經(jīng)水洗后，可以得到含有益生菌的生物纖維素凝膠，更為適用于食品、保健品中添加使用。本發(fā)明所述的混合菌株同樣適用于生物纖維素動(dòng)態(tài)發(fā)酵，比常規(guī)單一菌株的動(dòng)態(tài)發(fā)酵產(chǎn)膜能力也有所提高。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式和對(duì)比實(shí)驗(yàn)來對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但是下文中的具體實(shí)施方法不應(yīng)當(dāng)被理解為對(duì)本發(fā)明的限制。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠在本發(fā)明基礎(chǔ)上顯而易見地作出的各種改變和變化，應(yīng)該均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。實(shí)施例1：一種用于生物纖維素發(fā)酵的混合發(fā)酵菌劑，包含木葡糖酸醋桿菌、運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌、以及雙歧桿菌和/或嗜酸乳桿菌。其中的雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌可以只含其中的一種，也可以兩種都含有。菌劑制備步驟：1、菌種活化木葡糖酸醋桿菌、運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌、雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌分別在活化培養(yǎng)基上培養(yǎng)活化；2、種子液培養(yǎng)木葡糖酸醋桿菌、運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌、雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌分別接種入種子培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)培，培養(yǎng)至其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；3、接種發(fā)酵木葡糖酸醋桿菌、運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌、以及雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌的種子液按照體積比17:11:5（其中雙歧桿菌加入量為2嗜酸乳桿菌加入量為3）的比例依次接種入靜態(tài)淺盤發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。上述步驟中的活化培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基以及發(fā)酵培養(yǎng)基可以采用已有的菌株培養(yǎng)的常規(guī)培養(yǎng)基，也可以采用特殊配制的培養(yǎng)基，以得到更高產(chǎn)量的生物纖維素凝膠。實(shí)施例2：其他都與實(shí)施例1相同，混合發(fā)酵菌劑為15:8:6的木葡糖酸醋桿菌、運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌、雙歧桿菌。實(shí)施例3：其他都與實(shí)施例1相同，混合發(fā)酵菌劑為20:15:8的木葡糖酸醋桿菌、運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌、嗜酸乳桿菌。實(shí)施例4：其他都與實(shí)施例1相同，混合發(fā)酵菌劑為10:7:3:3的木葡糖酸醋桿菌、運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌、雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌。對(duì)照實(shí)驗(yàn)及結(jié)果：按照實(shí)施例1的方式，采用不同的菌種發(fā)酵生產(chǎn)生物纖維素，其余培養(yǎng)條件均完全相同，菌種分別采用單獨(dú)使用木葡糖酸醋桿菌、和實(shí)施例1-4的混合發(fā)酵菌株，考察相同發(fā)酵時(shí)間后獲得的生物纖維素含量以及發(fā)酵培養(yǎng)基中還原糖的轉(zhuǎn)化率，結(jié)果如下表所示：發(fā)酵菌種生物纖維素產(chǎn)量發(fā)酵培養(yǎng)基中還原糖的轉(zhuǎn)化率木葡糖酸醋桿菌8.2g/L19%實(shí)施例1的混合發(fā)酵菌株14.9g/L37%實(shí)施例2的混合發(fā)酵菌株12.7g/L28%實(shí)施例3的混合發(fā)酵菌株13.4g/L31%實(shí)施例4的混合發(fā)酵菌株14.5g/L34%由上表可以得出，本發(fā)明的混合發(fā)酵菌株可以有效提高生物纖維素發(fā)酵產(chǎn)量，提高還原糖轉(zhuǎn)化率。以上所述的實(shí)施例僅僅是對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行描述，并非對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計(jì)精神的前提下，本領(lǐng)域普通工程技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作出的各種變形和改進(jìn)，均應(yīng)落入本發(fā)明的權(quán)利要求書確定的保護(hù)范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3