專利名稱：微生物同步發(fā)酵正十六烷生產(chǎn)十六碳二元酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是利用微生物發(fā)酵正烷烴生產(chǎn)長鏈α，ω-二羧酸的方法，特別是高產(chǎn) 十六碳二羧酸的方法。
背景技術(shù)：
長鏈二羧酸是一類重要的化工原料，可用來制造高性能尼龍工程塑料，高檔熱熔 膠，長效降糖藥，樹脂，涂料以及香料等。特別是十六碳二羧酸，是制造環(huán)十五酮的重要原 料，前者具有純麝香香味，是一種高級麝香香料；后者可以代替人工合成胰島素，治療糖尿 病。從上世紀七十年代起，各國利用微生物氧化正烷烴生產(chǎn)長鏈二元羧酸的研究取 得突破性進展，1972年日本的內(nèi)尾良鋪等人在《農(nóng)業(yè)·生物化學(xué)》雜志(Agr.biol.chem. Vol. 36) “微生物利用正烷烴產(chǎn)生長鏈二羧酸”的文章中，報道了他們用一株陰溝假絲酵母 MR-12菌株在1立升發(fā)酵罐中，用醋酸鈉作生長碳源，加入15% (ν/ν)的正十六烷發(fā)酵72 小時，得到63. 3克/升的十六碳二羧酸，正十六烷的轉(zhuǎn)化率為54%。1978年內(nèi)尾又在《石 油和微生物》雜志報道了擴大試驗的結(jié)果，在300立升罐里，醋酸作為生長碳源，正十六烷作 為發(fā)酵碳源發(fā)酵68小時，得到54克/升的十六碳二羧酸，正十六烷轉(zhuǎn)化率70%。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的微生物菌種，以及利用該微生物菌種同步發(fā)酵正 烷烴生產(chǎn)Cltl-C18長鏈α，ω-二元酸的方法，尤其是同步發(fā)酵正十六烷烴，高產(chǎn)α，ω-十六 碳二元酸的方法。本發(fā)明所用的微生物菌株為熱帶假絲酵母(Candida tropicalis) ly_6，是以一株 氧化正烷烴生產(chǎn)混合二羧酸的熱帶假絲酵母(參見《微生物學(xué)報》20(1) =88-93,1980)為出 發(fā)菌株，經(jīng)過硝基胍和N+注入誘變，選育出來生產(chǎn)DC16的優(yōu)良菌株。將出發(fā)菌株經(jīng)過一次硝基胍和2次N+注入方法處理兩變的微生物菌種液，用生理 鹽水分別稀釋為10_2-10_4，吸取0. Iml稀釋好的菌液，涂布于10波林糖度的麥芽汁瓊脂培 養(yǎng)平板上，每個稀釋度涂布5個平板，用黑紙包好，置于30°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)46小時，統(tǒng)計 致死率。菌種篩選以出發(fā)菌株為對照，對誘變后的菌株進行發(fā)酵產(chǎn)酸試驗及產(chǎn)酸量檢測， 篩選培育出來的一株ω-氧化能力更強，同化正烷烴能力和β-氧化能力更弱，并能高產(chǎn) α, ω-十六碳二羧酸的菌株，即為熱帶假絲酵母(Candida tropicalis) ly_6，該菌種能以 Cltl-C18的各種單一正烷烴和混合正烷烴，尤其是正十六烷為基質(zhì)原料，發(fā)酵生產(chǎn)出相應(yīng)的 長鏈二羧酸。本發(fā)明熱帶假絲酵母(Candida tropicalis) ly-6已于2009年10月14日在中國 典型培養(yǎng)物保藏中心進行保藏，地址為中國武漢武漢大學(xué)，保藏號為CCTCC NO =M 209224。熱帶假絲酵母(Candida tropicalis) ly-6的生理特性如下
糖類的發(fā)酵葡萄糖+，半乳糖+，蔗糖+，麥芽糖+，乳糖-。
同化葡萄糖+，半乳糖+，山梨糖-，蔗糖+，麥芽糖+，纖維二糖+，海藻糖+，乳糖-， 密二糖-，棉子糖-，松三糖+，菊芋糖-，可溶性淀粉+，木糖+，L-阿戊糖+，D-阿戊糖_，核 糖_，鼠李糖_，α -甲基葡萄糖苷+，甘油+，乙醇+，赤蘚醇_，露醇+，肌醇_，核糠醇+，半乳 糖醇_，葡萄糖醇+，檸檬酸鈉_，丁二酸鈉+，乳酸鈣_。生長素的需要生物素++，維生素 B1++,維生素B2+,維生素B6+,維生素B12+,葉酸+，煙酸+，泛酸+，肌醇+，對氨基苯甲酸+。其 他硝酸鹽_，凍化牛奶_，熊果酸分解_，凝固牛奶_，油脂酶_。熱帶假絲酵母(Candida tropicalis) ly_6形態(tài)特征奶油白他，皺褶型，菌落為 蛋糕狀和桃酥狀。培養(yǎng)特征在麥芽汁液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，假菌絲多而長；在烷烴種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，有一 定數(shù)量的短假菌絲；而在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵時，大部分是單個橢圓細胞。本發(fā)明所述同步發(fā)酵生產(chǎn)長鏈二羧酸，特別是十六碳二羧酸的方法是以熱帶假絲 酵母(Candida tropicalis) ly_6為發(fā)酵菌種，在以正十六烷為發(fā)酵基質(zhì)的培養(yǎng)基中同步發(fā) 酵，生產(chǎn)α，ω-十六碳二元酸。同步發(fā)酵生產(chǎn)二元酸過程中所使用的熱帶假絲酵母(Candida tropicalis) ly-6 的種子培養(yǎng)方法如下種子培養(yǎng)基(1). 10個巴林糖度的麥芽汁加2%瓊脂制成的固體斜面；(2). 10個巴林的麥芽汁液體培養(yǎng)基；(3).液體種子培養(yǎng)基包含KH2PO4 6-8克/升，蔗糖20_40克/升，酵母膏24克/ 升，玉米漿2-4克/升，尿素2-4克/升，消泡劑400PPM，自來水配置，PH值5左右。培養(yǎng)種子的過程為取一接種環(huán)ly-6酵母菌體，涂布在麥芽汁固體斜面上，于 28-30°C培養(yǎng)兩天。取一支上述斜面菌種，接入30ml/250ml三角瓶的麥芽汁液體培養(yǎng)基或 25ml/500ml三角瓶的液體種子培養(yǎng)基，于28_30°C在200轉(zhuǎn)/分的旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng)36-48 小時，菌株生長光密度OD達到0. 6，作為發(fā)酵種子。同步發(fā)酵生產(chǎn)二元酸的方法如下發(fā)酵培養(yǎng)基的主要組分為堿金屬磷酸鹽4-10克/升，氯化鈉0. 5-2. 0克/升，尿 素0. 5-2. 0克/升，丙烯酸0. 5-2. 0毫升/升，表面活性劑吐溫60 0. 1-2. 0克/升以及一些 其他公知的營養(yǎng)源。其中堿金屬磷酸鹽可從KH2P04、NaH2PO4, K2HPO4和Na2HPO4中選一種。發(fā)酵基質(zhì)正烷烴和發(fā)酵培養(yǎng)基在混合發(fā)酵液中的用量比例為含有10-40% (ν/ ν)的正烷烴和90-60% (ν/ν)發(fā)酵培養(yǎng)基，最好為15-25% (ν/ν)的正烷烴和75-85% (V/ V)發(fā)酵培養(yǎng)基。具體發(fā)酵過程如下將前述制備的發(fā)酵種子，按發(fā)酵培養(yǎng)基量的15-25% (V/V)的用量，按入PH值為 6. 5-8. 5含有10-40% (ν/ν)，最好為15-25% (ν/ν) 10-18個碳原子的正烷烴和90-60 % (ν/ν)，最好為85-75% (ν/ν)發(fā)酵培養(yǎng)基的混合液中在24-34°C，最好是26-32°C下通氣發(fā) 酵48-164小時。發(fā)酵28小時以前，PH控制在7. 1以下，28-60小時PH控制在7. 5以下， 60-120小時，PH控制在8. 0以下，120小時后PH控制在8. 5以下，在60,90,120小時，分別補加正十六烷，使發(fā)酵液中正烷烴濃度始終≥5% (V/V)。發(fā)酵結(jié)束后的液體加熱至75-80°C，加入NaOH把PH調(diào)至10_12，用膜分離方法除 去菌體，收集含有殘烴的清液，靜置分離，在20°C以下靜置過夜，殘存IiC16回收再用，大量大 顆粒的十六碳二羧酸鈉鹽結(jié)晶沉于底部，收集鈉鹽結(jié)晶，清液直接加硫酸酸化結(jié)晶，把十六 碳二羧酸鈉鹽溶解于80-90°C熱水中，加入濃硫酸，調(diào)節(jié)PH2-3，靜置冷卻結(jié)晶過夜，最后 收集白色二羧酸結(jié)晶固體，在60°C烘烤至干。用本發(fā)明的ly-6菌株和方法，可生產(chǎn)10-18個碳原子的α ω-二元羧酸。特別是 十六碳二羧酸。在3000升發(fā)酵罐中，正十六烷投入量為20%，在適宜條件下發(fā)酵65小時，產(chǎn) 酸最高達到78. 5克/升，補加正十六烷和混合營養(yǎng)液延長發(fā)酵時間到165小時，產(chǎn)酸量高 達170. 5克/升，轉(zhuǎn)化率為88. 1 %，明顯優(yōu)于日本用陰溝假絲酵母突變株MR-12產(chǎn)生的十六 碳二羧酸產(chǎn)量。而且在發(fā)酵規(guī)模和產(chǎn)酸水平上也高于陳遠童自己在專利號為87105545. 0 專利中所達到的水平的100多倍和1. 4倍。在陳遠童1987年的專利中，發(fā)酵罐體積只有16 升，產(chǎn)DC16只達到123g/l。
具體實施例方式實施例1(1)取一接種環(huán)ly-6菌體，涂布在15 X 180大試管麥芽汁固體斜面上，共16支，在 28°C培養(yǎng)2天。(2)取上述菌種一支，接入裝有25ml烷烴種子培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，于29°C 在220轉(zhuǎn)/分的旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng)48小時，烷烴種子培養(yǎng)基含KH2PO4 8g/l，酵母膏5g/l，玉 米漿4g/l，蔗糖25g/l，尿素3. 5g/l，重蠟20ml/l,自來水配置，PH5. 0。(3)、在裝有15ml發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，接入3ml上述種子液，于29°C， 在220轉(zhuǎn)/分的旋轉(zhuǎn)搖床上發(fā)酵4天，每24小時用NaOH調(diào)一次PH值至7. 5-8. 0。發(fā)酵培 養(yǎng)基的組成為=KH2PO4 8g/l，NaCl lg/1，酵母膏3g/l，玉米漿2. 5g/l，尿素1. 2g/l，氯化鈉 lg/1，KN03 7g/l，青霉素130單位/ml，泡敵0.6g/l，以及正十六烷200ml/l，自來水配置， PH7. 2，110°C滅菌30分鐘。發(fā)酵結(jié)束后，用6mol的HCl調(diào)節(jié)PH至3，用IOOml乙醚抽提，除 去乙醚得白色結(jié)晶。用標準NaOH滴定，計算二元羧酸含量。結(jié)果DC16產(chǎn)量為90.3g/l，氣 相色譜分析，DC16純度為98. 2。實施例2按照實施例1的方法，只是發(fā)酵基質(zhì)正烷烴用IiC11結(jié)果DC11產(chǎn)量為43. 5g/l，純度 為 95. 8%。實施例3按照實施例1的方法，只是發(fā)酵基質(zhì)正烷烴用IiC13，結(jié)果DC13產(chǎn)量為55g/l，純度 96. 5%。實施例4按照實施例1的方法，只是發(fā)酵基質(zhì)正烷烴用IiC18，結(jié)果DC18產(chǎn)量為65g/l，純度為 91. 5%。實施例5(1)、取一接種環(huán)ly-6菌體，涂布在15 X 180大試管麥芽汁固體斜面上，共8支，在28°C培養(yǎng)2天，作為三角瓶種子。(2)、把(1)中培養(yǎng)好的2支斜面種子，全部刮入裝有500ml麥芽汁液體培養(yǎng)基的 5L三角瓶中，2支/瓶，共4瓶，于28°C在220轉(zhuǎn)/分的旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng)2天，作為一級種子 罐的種子。(3)、把(2)中的培養(yǎng)好的麥芽汁種子，共2L，接入一個裝有40L烷烴種子培養(yǎng)基的 70L種子罐中。于29 士 1°C，攪拌速度500轉(zhuǎn)/分，罐壓lKg，通氣量1 1，培養(yǎng)36小時，作 為二級種子罐的種子。烷烴種子培養(yǎng)基含有(％ ) =KH2PO4 0. 8，酵母膏0. 5，玉米漿0. 4，蔗糖3. 0，尿素 0.35g，消泡劑0.06，自來水配置，自然PH。在121°C下滅菌40分鐘。(4)把(3)中培養(yǎng)好的40L種子液，接入裝有3. 5m3烷烴種子培養(yǎng)基(成分同(3) 的5m3種子罐中，于29 士 1°C，攪拌速度250轉(zhuǎn)/分，罐壓為lKg，通氣量1 1，培養(yǎng)48小時， OD 0.72-0. 8，鏡檢無雜菌，作為發(fā)酵罐種子。(5)把(4)培養(yǎng)好的3. 5m3種子液，接入裝有20m3發(fā)酵培養(yǎng)基的30m3發(fā)酵罐中，調(diào) 節(jié)PH到7.1，29 士 1°C，攪拌速度170轉(zhuǎn)/分，罐壓lKg，通氣量1 0.8，開始發(fā)酵。發(fā)酵培 養(yǎng)基中含有(% ) =KH2PO4 0.8, NaCl 0. 1，青霉素GNal60單位/ml，吐溫60 0.04，正十六烷 15. 0(v/v)，12rC滅菌40分鐘。發(fā)酵28小時以前，PH控制在7. 1以下，28-60小時PH控制 在7. 5以下，60-120小時，PH控制在8.0以下，120小時后，PH控制在8.5以下，在60、90、 120小時，分別補加正十六烷，使發(fā)酵液中正烷烴濃度始終> 5% (V/V)，發(fā)酵165小時，產(chǎn) DC16 達到 170. 5g/l，轉(zhuǎn)化率為 90. 1%。(6)、發(fā)酵結(jié)束以后，加熱加減至80-90°C，PHlO以上，破乳分層，降溫，同收殘存 nC16，用甩干機收集二元酸鹽。母液中含DC16 18g/l，直接加熱、酸化、結(jié)晶過濾、收集粗品 DC16 二元酸鹽和粗品二元酸加水加堿，達到70-80°C，PH9-10后，加入適量活性炭，脫色，壓 濾，脫色清液加熱至60-70°C后，加濃硫酸酸化結(jié)晶，PH調(diào)至3. 5左右。冷卻結(jié)晶，壓濾、洗 滌、吹干烘干，得到DC16精制品。后處理總收率為88. 4%, DC16純度為97. 5%。
權(quán)利要求
1.一種微生物同步發(fā)酵正十六烷生產(chǎn)十六碳二羧酸方法，其特征在于所用的微生物為 熱帶假絲酵母(Candida tropicalis) ly_6，該菌種已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保 藏號為CCTCC NO :M209224o
2.如權(quán)利要求1所述微生物同步發(fā)酵正十六烷生產(chǎn)十六碳二羧酸方法，其特征在于以 熱帶假絲酵母(Candida tropicalis) ly_6為發(fā)酵種子，在以正十六烷為基質(zhì)的培養(yǎng)基中同 步發(fā)酵，生產(chǎn)α，ω-十六碳二元酸。
3.如權(quán)利要求2所述微生物同步發(fā)酵正十六烷生產(chǎn)十六碳二羧酸方法，其特征在于所 說的發(fā)酵種子是由熱帶假絲酵母(Candida tropicalis) ly_6菌株經(jīng)斜面培養(yǎng)、液體種子培 養(yǎng)基培養(yǎng)，獲得一級種子罐的種子；所使用的固體斜面培養(yǎng)基為10個巴林糖度的麥芽汁加 2%瓊脂制成；麥芽汁液體培養(yǎng)基為10個巴林的麥芽汁；液體種子培養(yǎng)基包含KH2P046-8 克/升，蔗糖20-40克/升，酵母膏2-4克/升，玉米漿2-4克/升，尿素2-4克/升，消泡 劑400PPM，自來水配置，PH值5左右。
4.如權(quán)利要求2所述微生物同步發(fā)酵正十六烷生產(chǎn)十六碳二羧酸方法，其特征在于所 說的同步發(fā)酵過程如下發(fā)酵培養(yǎng)基的主要組分為堿金屬磷酸鹽4-10克/升，氯化鈉0. 5-2. 0克/升，尿素 0. 5-2. 0克/升，丙烯酸0. 5-2. 0毫升/升，表面活性劑吐溫600. 1-2. 0克/升；其中堿金 屬磷酸鹽可從Iffl2P04、NaH2PO4, K2HPO4和Na2HPO4中選一種；發(fā)酵基質(zhì)正烷烴和發(fā)酵培養(yǎng)基在混合發(fā)酵液中的用量比例為含有10-40% (ν/ν)的 正烷烴和90-60% (ν/ν)發(fā)酵培養(yǎng)基。具體發(fā)酵過程如下將前述制備的發(fā)酵種子，按發(fā)酵培養(yǎng)基量的15-25% (V/V)的用量，接入PH值為 6. 5-8. 5含有10-40% (ν/ν)的正烷烴和90-60% (ν/ν)發(fā)酵培養(yǎng)基的混合液中，在M_34°C 下通氣發(fā)酵48-164小時；發(fā)酵28小時以前，PH控制在7. 1以下，28-60小時PH控制在7.5 以下，60-120小時，PH控制在8.0以下，120小時后PH控制在8. 5以下，在60、90、120小時， 分別補加正十六烷，使發(fā)酵液中正烷烴濃度始終> 5% (V/V)。
5.如權(quán)利要求2所述微生物同步發(fā)酵正十六烷生產(chǎn)十六碳二羧酸方法，其特征在于所 說的同步發(fā)酵過程如下發(fā)酵培養(yǎng)基的主要組分為堿金屬磷酸鹽4-10克/升，氯化鈉0. 5-2. 0克/升，尿素 0. 5-2. 0克/升，丙烯酸0. 5-2. 0毫升/升，表面活性劑吐溫600. 1-2. 0克/升以及一些其 他公知的營養(yǎng)源；其中堿金屬磷酸鹽可從KH2P04、NaH2PO4, K2HPO4和Na2HPO4中選一種；發(fā)酵基質(zhì)正烷烴和發(fā)酵培養(yǎng)基在混合發(fā)酵液中的用量比例為15-25% (ν/ν)的正烷 烴和75-85% (V/V)發(fā)酵培養(yǎng)基。具體發(fā)酵過程如下將前述制備的發(fā)酵種子，按發(fā)酵培養(yǎng)基量的15-25% (V/V)的用量，接入PH值為 6. 5-8. 5含有15-25% (ν/ν)的正烷烴和85-75% (ν/ν)發(fā)酵培養(yǎng)基的混合液中，26_32°C下 通氣發(fā)酵48-164小時；發(fā)酵洲小時以前，PH控制在7. 1以下，28-60小時PH控制在7. 5以 下，60-120小時，PH控制在8.0以下，120小時后PH控制在8.5以下，在60、90、120小時， 分別補加正十六烷，使發(fā)酵液中正烷烴濃度始終> 5% (V/V)。
6.如權(quán)利要求2所述微生物同步發(fā)酵正十六烷生產(chǎn)十六碳二羧酸方法，其特征在于發(fā)酵結(jié)束后的液體加熱至75-80°C，加入NaOH把PH調(diào)至10-12，用膜分離方法除去菌體，收集 含有殘烴的清液，靜置分離，在20°C以下靜置過夜，殘存IiQ6回收再用，大量大顆粒的十六 碳二羧酸鈉鹽結(jié)晶沉于底部，收集鈉鹽結(jié)晶，清液直接加硫酸酸化結(jié)晶，把十六碳二羧酸鈉 鹽溶解于80-90°C熱水中，加入濃硫酸，調(diào)節(jié)PH2-3，靜置冷卻結(jié)晶過夜，最后收集白色二羧 酸結(jié)晶固體，在60°C烘烤至干。
7.應(yīng)用權(quán)利要求2 6所述微生物同步發(fā)酵正十一烷生產(chǎn)十一碳二羧酸方法，其特征 在于在以Cltl-C18的單一或混合正烷烴為基質(zhì)的培養(yǎng)基中同步發(fā)酵，生產(chǎn)相應(yīng)的Cltl-C18Ci， ω- 二元酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用微生物同步發(fā)酵正十六烷烴高產(chǎn)十六碳二元酸的方法。所用微生物為一株新培育出來的熱帶假絲酵母(candida tropicalis)優(yōu)良生產(chǎn)突變株ly-6。其特點是在微生物菌種ly-6突變株接入含有C10-C18各種正烷烴為基質(zhì)的培養(yǎng)基后，28小時以內(nèi)，pH控制在7.1以下，以菌體生長為主，產(chǎn)生一定量的二元酸；28-60小時，pH控制在7.5以內(nèi)，以產(chǎn)酸為主，也增長一定量的菌體；pH控制在8.0以下，迅速生產(chǎn)二元酸；120小時以后，pH控制在8.5以下，連續(xù)生產(chǎn)二元酸、當本方法用于nC16發(fā)酵生產(chǎn)DC16時，在30m3發(fā)酵罐內(nèi)，發(fā)酵165小時，DC16產(chǎn)量達到170.5g/l。
文檔編號C12R1/74GK102115768SQ200910256589
公開日2011年7月6日 申請日期2009年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月30日
發(fā)明者曹務(wù)波, 曹荀梅子, 陳遠童 申請人:曹務(wù)波