本發(fā)明屬于微生態(tài)應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株沼澤紅假單胞菌的微生態(tài)制劑以及在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

在養(yǎng)殖業(yè)中，水體的清、富、美是衡量養(yǎng)殖環(huán)境優(yōu)劣的重要指標。清，要使水體保持自然清澈；富，指水體中含有豐富的藻類及浮游動物，以此為水產(chǎn)類動物提供充足的餌料；美即指水體環(huán)境與水產(chǎn)動物形成生態(tài)平衡。而目前由于池塘的高密度養(yǎng)殖，養(yǎng)殖動物糞便及殘餌不斷堆積，有害微生物和藻類大量繁殖，水體嚴重缺氧，導(dǎo)致魚蝦浮頭、偷死的現(xiàn)象十分嚴重，在這樣的情況下大量抗生素的使用又會造成養(yǎng)殖動物抗生素含量超標，進而影響人類的身體健康。因此，利用生物修復(fù)的方法使養(yǎng)殖水體達到自然、和諧的狀態(tài)迫在眉睫。

光合細菌(Photosynthetic bacteria，簡稱PSB)是地球上最早出現(xiàn)具有原始光能合成體系的原核生物，是一大類在厭氧條件下進行不放氧光合作用的細菌的總稱，為革蘭氏陰性菌，廣泛存在于地球生物圈的各處。光合細菌菌體無毒，蛋白質(zhì)含量高達60％，含B族維生素、輔酶Q和類胡蘿卜素。因其特有的固氮、吸氫、固碳、利用硫化物等的新陳代謝方式在很多方面具有重要的實用和經(jīng)濟價值。在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中光合細菌不僅可用于凈化水質(zhì)，還因其營養(yǎng)價值高，可作為餌料添加劑，在防治魚蝦疾病、促進生長、提高孵化率等方面均表現(xiàn)出良好的性能。目前市場上充斥著各色各樣的光合細菌制劑，以液態(tài)和粉狀存在的居多，根據(jù)實驗室對市場上多種產(chǎn)品的分析，其質(zhì)量不盡人意，主要表現(xiàn)為液體菌劑顏色不鮮艷，菌體穩(wěn)定性差，活菌數(shù)較少，甚至有的未發(fā)現(xiàn)有光合細菌存在，市場的迫切需求與目前市面上光合 細菌產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊的混亂狀態(tài)為我們提供了大好的機遇，因此，研制出優(yōu)良的光合細菌制劑意義重大。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種光合細菌菌劑及其應(yīng)用。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方式方案實現(xiàn)的：

本發(fā)明提供一株沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)新菌株，其保藏號為CGMCC No.9136。

本發(fā)明的沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)的分離鑒定過程如下：

1.配制光合細菌培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基(/L)：NaHCO₃2g，酵母粉1g，K₂HPO₄·3H₂O 0.2g，NH₄Cl 1g，NaAc·3H₂O 0.3g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，NaCl 0.2g，Na₂S₂O₃·5H₂O 1g，pH7.0，121℃高壓滅菌20min。

分離培養(yǎng)基在富集培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加瓊脂，最終質(zhì)量分為1.5％，121℃高壓滅菌20min。

2.富集：

將采集來的泥水樣品放于已加有富集培養(yǎng)基的帶螺口的厭氧管中，其中厭氧管盛有15mL培養(yǎng)基及10mL池塘水+底泥，每個覆蓋2-3cm石蠟油。光照強度1000lx～2000lx，30℃厭氧培養(yǎng)。

3.分離純化

富集一周后，從培養(yǎng)基變紅的厭氧管中取出1mL液體，取稀釋度為10^-3、10^-4，10^-5的液體100μL涂板，10天左右觀察到有紅色菌落長出；挑出紅色菌落平板畫線至純。

4.鑒定

挑取單菌落進行16S rRNA菌落PCR，送Invitrogen測序，序列如SEQ ID No.1所示。測得序列在NCBI上進行Blast比對，初步鑒定為沼澤紅假單胞菌Rhodopseudomonas palustris，與沼澤紅假單胞菌 R.palustrisATCC 17003的16S rRNA基因相似性距離為100％。該菌生長緩慢，5天可出現(xiàn)單菌落，大小0.5mm～1mm；厭氧狀態(tài)下為暗紅色菌落，革蘭氏染色為陰性短桿狀，固體平板培養(yǎng)為短桿狀(圖1)。

將分離到沼澤紅假單胞菌Rhodopseudomonas palustris保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，保藏日期為2014年5月8日，保藏編號分別為：CGMCC No.9136。

本發(fā)明還提供了包含該沼澤紅假單胞菌的微生態(tài)制劑。該制劑由沼澤紅假單胞菌Rhodopseudomonas palustris CGMCC No.9136發(fā)酵而成。

本發(fā)明還提供所述微生態(tài)制劑的制備方法，其包括如下步驟：沼澤紅假單胞菌CGMCC No.9136種子液以體積比1-10％的接種量接種到發(fā)酵液中，光照培養(yǎng)2-5天。

本發(fā)明中的光合細菌菌劑對水體亞硝酸鹽含量有很明顯的降解效果，即使在黑暗條件下，也有很好的降解效果。使用本發(fā)明CGMCC No.9136的微生態(tài)制劑，在24小時之內(nèi)亞硝酸鹽含量可被降解98％，無同行類產(chǎn)品能達到此效果。

附圖說明

圖1沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)的菌落圖。

圖2亞酸鈉含量標準曲線圖。

圖3兩種條件下光合細菌對亞硝酸鹽的降解效果。左邊為無光條件下CGMCC No.9136對亞硝酸鹽的降解，右邊為光照條件下CGMCC No.9136對亞硝酸鹽的降解。

圖4所示為自然光照下對蝦養(yǎng)殖池亞硝降解效果對比。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

實施例1沼澤紅假單胞菌菌液制備

1.沼澤紅假單胞菌擴大培養(yǎng)基的配方(/L)：

CaCl₂0.1g，KH₂PO₄0.5g，NH₄Cl 1g，MgCl₂·6H₂O 0.5g，NaCl 1g，NaAc·3H₂O 1g，二水合丁二酸鈉1g，酵母粉0.3g，蛋白胨0.3g

2.擴大培養(yǎng)基培養(yǎng)步驟

(1)按照培養(yǎng)基配方稱取各個組分，用水溶解，將培養(yǎng)基分裝至5L已用酒精消毒的PET塑料桶中，每桶4.5L，接種沼澤紅假單胞菌CGMCC No.9136500mL，封蓋。置于紙箱中白熾燈光照培養(yǎng)4天，可以作為下一步大規(guī)模培養(yǎng)的種子液。

(3)稱量1噸培養(yǎng)液所需要的各個成分，先用少量自來水完全溶解，再與剩下的自來水充分混合于大桶中，接種10桶光合細菌種子液，混勻后分裝于5L透明PET塑料桶中封蓋。光照培養(yǎng)5天，待培養(yǎng)至紅棕色，即得到高純度的光合細菌菌液。

實施例2沼澤紅假單胞菌CGMCC No.9136對亞硝酸鹽的降解能力測試

1.實驗方法

(1)做亞硝酸鹽標準曲線：配制不同濃度的亞硝酸鹽溶液，置于酶標儀下測量OD₅₅₀，做成鹽濃度與OD₅₅₀的對應(yīng)性標準曲線。

(2)降亞硝實驗用的培養(yǎng)基：配制3°鹽水分裝于150mL小三角瓶中，50mL/瓶，每瓶加入0.05g池塘底泥。121℃，高壓蒸汽滅菌20min。

(3)設(shè)置黑暗條件和光照條件，每個條件下設(shè)置實驗組和對照組，每株菌3個重復(fù)，實驗組加入光合細菌種子液50μL，分別放置于黑暗和光照條件下，30℃放置培養(yǎng)。

(4)每24小時測量一次亞硝酸鹽含量，具體方法為：在超凈工作臺內(nèi)取1mL液體于1.5mL的離心管中，12,000rpm離心2分鐘，吸取上清200μL于96孔板中，先后加入格利斯試劑Ⅰ、Ⅱ各20μL，靜 置5min使其完全反應(yīng)，然后置于酶標儀下測量OD₅₅₀。

(5)根據(jù)標準曲線計算實驗組和對照組的亞硝酸鹽濃度，測量2天，記錄實驗數(shù)據(jù)并分析。

2.實驗結(jié)果

(1)亞硝含量與OD₅₅₀標準曲線制作

如圖2所示為亞硝含量標準曲線圖，得到的線性相關(guān)系數(shù)為0.998，表明此次制做的標準曲線反應(yīng)的亞硝酸鈉濃度與OD₅₅₀有很強的相關(guān)性。

(2)如圖3所示，黑暗和光照條件下所述澤紅假單胞菌CGMCC No.9136菌劑均有較明顯的亞硝酸鹽降解效果。無光照條件下，亞硝含量從2.5mg/L降解到最低0.05mg/L；在光照條件下，亞硝酸鈉從2.3mg/L降解到0.005mg/L的水平。

對比例1沼澤紅假單胞菌CGMCC No.9136與市售同類產(chǎn)品應(yīng)用效果對比

選取同一養(yǎng)殖廠的三口養(yǎng)殖池塘做效果對比，面積1畝，養(yǎng)殖密度8萬偉每畝，水溫26攝氏度，蝦體長4厘米。下午16：00全池潑灑光合細菌，每畝潑灑1桶(5L)，每隔24小時測量一次水體亞硝酸鹽濃度，連續(xù)測三天。結(jié)果表明(圖4)，使用CGMCC No.9136，在24小時之內(nèi)亞硝酸鹽含量可被降解98％，而同行類產(chǎn)品不能達到此效果。