生產(chǎn)奧利萬(wàn)星前體a82846b的方法及培養(yǎng)基的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于生產(chǎn)奧利萬(wàn)星前體A82846B的方法及培養(yǎng)基。
【背景技術(shù)】
[0002]A82846B是一種天然的糖肽，是從諾卡氏土分離的東方擬無(wú)枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)的培養(yǎng)基中分離的發(fā)酵產(chǎn)物,該糖肽的化學(xué)結(jié)構(gòu)除多含一個(gè)4-表-萬(wàn)古胺(4-ep1-Vancosamine)外與萬(wàn)古霉素相似,分子式是C73H88NltlO26Cl2,其抗菌活性比萬(wàn)古霉素大4?8倍，其阻斷細(xì)胞壁合成的作用機(jī)理與其他糖肽如萬(wàn)古霉素和Teicoplanin 相同。
[0003]奧利萬(wàn)星(oritavancin)是以A82846B為前體的半合成糖肽類(lèi)抗生素。奧利萬(wàn)星是最初由美國(guó)禮來(lái)公司研發(fā)，后轉(zhuǎn)讓給美國(guó)Targanta Therapeutics生物制藥公司，對(duì)革蘭陽(yáng)性菌有廣譜抗菌效果(包括耐萬(wàn)古霉素細(xì)菌)，用于治療皮膚感染、肺炎球菌感染和全身感染的適應(yīng)征，目前均處于III期臨床研究階段。同時(shí)，奧利萬(wàn)星是第一個(gè)進(jìn)入大規(guī)模臨床試驗(yàn)的二代半合成糖肽類(lèi)抗生素，作用機(jī)制與萬(wàn)古霉素、達(dá)巴萬(wàn)星和替考拉寧相似，但是，因其生物活性更強(qiáng)，半衰期更長(zhǎng)，從而具有誘人的開(kāi)發(fā)前景。隨著耐藥菌的不斷出現(xiàn)，具有良好抗MRSA (耐甲氧西林金黃色葡萄球菌)和VRE (耐萬(wàn)古霉素腸球菌)作用的抗生素的開(kāi)發(fā)速度卻十分的緩慢。因此，奧利萬(wàn)星的出現(xiàn)給臨床治療耐藥菌帶來(lái)了新的希望和突破，而其前體A82846B的微生物發(fā)酵工藝也倍受業(yè)內(nèi)人士的矚目。目前，A82846B主要由美國(guó)Targanta Therapeutics生物制藥公司通過(guò)發(fā)酵進(jìn)行生產(chǎn),其報(bào)道的發(fā)酵培養(yǎng)基中的組分和含量為:10.0g/L的葡萄糖、20.0g/L的土豆糊精、10.0g/L的胰蛋白胨、2.0g/L的CaCO3和20.0g/L的糖蜜，發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為30°C，發(fā)酵培養(yǎng)的時(shí)間為260h，但是，上述發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵后菌體活力較差，發(fā)酵單位較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是為了克服現(xiàn)有的培養(yǎng)基用于生產(chǎn)奧利萬(wàn)星前體A82846B的發(fā)酵單位低以及菌體活力差的缺陷，而提供了一種用于生產(chǎn)奧利萬(wàn)星前體A82846B的方法及其種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基。本發(fā)明的種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基及生產(chǎn)方法可以大大提聞A82846B的發(fā)酵單位，提聞生廣效率，適用于奧利萬(wàn)星如體A82846B的大規(guī)模生產(chǎn)。
[0005]本發(fā)明提供了一種用于生產(chǎn)奧利萬(wàn)星前體A82846B的種子培養(yǎng)基，所述的種子培養(yǎng)基包含酵母粉、聚合蛋白胨、麥芽浸粉和葡萄糖；所述的種子培養(yǎng)基的pH值為6.5?7.5。
[0006]所述的酵母粉的含量較佳地為3g/L?5g/L。所述的聚合蛋白胨的含量較佳地為10g/L?15g/L，更佳地為llg/L?13g/L。所述的麥芽浸粉的含量較佳地為3g/L?5g/L。所述的葡萄糖的含量較佳地為15g/L?20g/L，更佳地為15g/L?17g/L。以上含量是指IL發(fā)酵培養(yǎng)基中各組分的質(zhì)量。
[0007]本發(fā)明還提供了一種用于生產(chǎn)奧利萬(wàn)星前體A82846B的發(fā)酵培養(yǎng)基，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包含碳源、氮源和礦物質(zhì)；所述的碳源的含量為30g/L?180g/L ;所述的氮源的含量為5g/L?60g/L ;所述的礦物質(zhì)的含量為2g/L?5g/L ;所述的碳源包含葡萄糖、糊精和紅糖；所述的氮源包含蛋白胨和/或水解酪蛋白；所述的礦物質(zhì)包含碳酸鈣(CaCO3);以上含量是指IL發(fā)酵培養(yǎng)基中各組分的質(zhì)量；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的PH值為6.5?7.5。
[0008]所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中，所述的碳源的含量較佳地為50g/L?105g/L。所述的氮源的含量較佳地為5g/L?30g/L。所述的礦物質(zhì)的含量較佳地為2g/L?4g/L。
[0009]所述的發(fā)酵培養(yǎng)基還可按照本領(lǐng)域常規(guī)的酸堿調(diào)節(jié)劑進(jìn)行調(diào)節(jié)，使得發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值在6.5?7.5之間。
[0010]所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中，所述的葡萄糖的含量較佳地為10g/L?20g/L。所述的糊精的含量較佳地為10g/L?50g/L。所述的紅糖的含量較佳地為10g/L?60g/L，更佳地為40g/L?60g/L。所述的蛋白胨的含量較佳地為5g/L?30g/L。所述的水解酪蛋白的含量較佳地為5g/L?10g/L。所述的碳酸鈣的含量較佳地為lg/L?5g/L。
[0011]所述的糊精可為本領(lǐng)域常規(guī)使用的糊精，較佳地包含土豆糊精和/或麥芽糊精。其中，所述的土豆糊精的含量較佳地為O?40g/L ;所述的麥芽糊精的含量較佳地為O?50g/L，且土豆糊精和麥芽糊精的含量不同時(shí)為O。
[0012]當(dāng)糊精包含土豆糊精時(shí)，所述的土豆糊精的含量較佳地為20g/L?40g/L。當(dāng)糊精包含麥芽糊精時(shí)，所述的麥芽糊精的含量較佳地為10g/L?50g/L。
[0013]所述的蛋白胨可為本領(lǐng)域常規(guī)使用的蛋白胨，較佳地包含魚(yú)粉蛋白胨、肉胨、大豆蛋白胨和胰蛋白胨中的一種或多種；更佳地為魚(yú)粉蛋白胨。其中，所述的魚(yú)粉蛋白胨的含量較佳地為O?30g/L ;所述的肉胨的含量較佳地為O?15g/L ;所述的大豆蛋白胨的含量較佳地為O?15g/L ;所述的胰蛋白胨的含量較佳地為O?30g/L，且魚(yú)粉蛋白胨、肉胨、大豆蛋白胨和胰蛋白胨的含量不同時(shí)為O。
[0014]當(dāng)?shù)鞍纂税~(yú)粉蛋白胨時(shí)，所述的魚(yú)粉蛋白胨的含量較佳地為5g/L?30g/L，更佳地為10g/L?15g/L。當(dāng)?shù)鞍纂税怆藭r(shí)，所述的肉胨的含量較佳地為10g/L?15g/L0當(dāng)?shù)鞍纂税蠖沟鞍纂藭r(shí)，所述的大豆蛋白胨的含量較佳地為5g/L?15g/L。當(dāng)?shù)鞍纂税鹊鞍纂藭r(shí)，所述的胰蛋白胨的含量較佳地為10g/L?30g/L。
[0015]較佳地，所述的碳源還可進(jìn)一步包含糖蜜、甘油和玉米淀粉中的一種或多種。其中，所述的糖蜜的含量較佳地為O?20g/L ;所述的甘油的含量較佳地為O?30g/L ;所述的玉米淀粉的含量較佳地為O?30g/L，且糖蜜、甘油和玉米淀粉的含量不同時(shí)為O。
[0016]當(dāng)碳源包含糖蜜時(shí)，所述的糖蜜的含量較佳地為3g/L?20g/L。當(dāng)碳源包含甘油時(shí)，所述的甘油的含量較佳地為15g/L?30g/L。當(dāng)碳源包含玉米淀粉時(shí),所述的玉米淀粉的含量較佳地為20g/L?30g/L。
[0017]較佳地，所述的氮源還可進(jìn)一步包含麩質(zhì)粉、豆柏、烤黃豆粉和酵母粉中的一種或多種，更佳地為麩質(zhì)粉。其中，所述的麩質(zhì)粉的含量較佳地為O?20g/L ;所述的烤黃豆粉的含量較佳地為O?15g/L ;所述的豆柏的含量較佳地為O?10g/L ;所述的酵母粉的含量較佳地為O?10g/L，且麩質(zhì)粉、豆柏、烤黃豆粉和酵母粉的含量不同時(shí)為O。
[0018]當(dāng)?shù)窗熧|(zhì)粉時(shí)，所述的麩質(zhì)粉的含量較佳地為10g/L?20g/L。當(dāng)?shù)窗军S豆粉時(shí)，所述的烤黃豆粉的含量較佳地為5g/L?15g/L。當(dāng)?shù)窗拱貢r(shí)，所述的豆柏的含量較佳地為5g/L?10g/L。當(dāng)?shù)窗湍阜蹠r(shí)，所述的酵母粉的含量較佳地為5g/L ?10g/Lo
[0019]所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中，所述的礦物質(zhì)一般作為滲透壓調(diào)節(jié)劑，所述的礦物質(zhì)還可進(jìn)一步包含KH2P04、MgS04和Mg3 (PO4) 2中的一種或多種。其中，所述的KH2PO4的含量較佳地為O?1.25g/L ;所述的MgSO4含量較佳地為O?1.0g/L ;所述的Mg3(PO4)2的含量較佳地為O?1.5g/L，且KH2P04、MgS04和Mg3 (PO4)2的含量不同時(shí)為O。
[0020]當(dāng)?shù)V物質(zhì)包含KH2PO4時(shí)，所述的KH2PO4的含量較佳地為0.25g/L?1.25g/L。當(dāng)?shù)V物質(zhì)包含MgSO4時(shí)，所述的MgSO4含量較佳地為0.5g/L?lg/L。當(dāng)?shù)V物質(zhì)包含Mg3 (PO4) 2時(shí)，所述的Mg3(PO4)2的含量較佳地為lg/L?1.5g/L。
[0021]在本發(fā)明的一較佳實(shí)施例中，所述的碳源為葡萄糖、糊精和紅糖，以及下述物質(zhì)中的一種或多種:糖蜜、甘油和玉米淀粉。
[0022]在本發(fā)明的另一較佳實(shí)施例中，所述的氮源為蛋白胨和/或水解酪蛋白，以及下述物質(zhì)中的一種或多種:麩質(zhì)粉、豆柏、烤黃豆粉和酵母粉。
[0023]在本發(fā)明的另一較佳實(shí)施例中，所述的礦物質(zhì)為碳酸鈣，以及下述物質(zhì)中的一種或多種:KH2P04、MgSO4 和 Mg3 (PO4) 2。
[0024]所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中，較佳地還可以進(jìn)一步包含氨基酸。所述的氨基酸一般作為前體物質(zhì)，其含量較佳地為lg/L?5g/L。所述的氨基酸可為本領(lǐng)域培養(yǎng)基中常規(guī)使用的氨基酸，所述的氨基酸較佳地為亮氨酸。
[0025]所述的發(fā)酵培養(yǎng)基較佳地包含10g/L?20g/L的葡萄糖、10g/L?50g/L的麥芽糊精或土豆糊精、5g/L?40g/L的麩質(zhì)粉、O?15g/L的烤黃豆粉、10g/L?20g/L的紅糖、O?60g/L的糖蜜、10g/L?60g/L的蛋白胨中的一種或多種、lg/L?5g/L的CaCO3,以及0.25g/L ?1.5g/L 的 KH2PO4'MgSO4 和 Mg3 (PO4)2 中的一種或多種。
[0026]所述的發(fā)酵培養(yǎng)基更佳地包含10g/L?20g/L的葡萄糖、20g/L?40g/L的土豆糊精、10g/L?30g/L的麩質(zhì)粉、40g/L?60g/L的紅糖、5g/L?15g/L的魚(yú)粉蛋白胨、2.0g/L ?4.0g/L 的 CaCO3 和 0.lg/L ?0.2g/L 的 Mg3 (PO4) 2。
[0027]所述的發(fā)酵培養(yǎng)基更佳地包含10g/L?20g/L的葡萄糖、20g/L?40g/L的土豆糊精、10g/L?30g/L的麩質(zhì)粉、40g/L?60g/L的紅糖、5g/L?15g/L的魚(yú)粉蛋白胨、2.0g/L ?4.0g/L 的 CaCO3 和 0.25g/L ?1.25g/L 的 KH2PO4。
[0028]本發(fā)明還提供了一種用于生產(chǎn)奧利萬(wàn)星前體A82846B的方法，其包含下列步驟:
[0029](I)將東方擬無(wú)枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)活化后接種于上述種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得種子液；所述的培養(yǎng)的溫度為20°C?40°C ;所述的培養(yǎng)的時(shí)間為24?48小時(shí)；
[0030](2)將所述的種子液接種于上述發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，即得含有奧利萬(wàn)星前體A82846B的發(fā)酵液；所述的發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為20°C?40°C ;所述的發(fā)酵培養(yǎng)的時(shí)間為5?15天。
[0031]步驟(I)中，所述的東方擬無(wú)枝酸菌可為本領(lǐng)域常規(guī)使用的東方擬無(wú)枝酸菌菌株，只要能產(chǎn)生奧利萬(wàn)星前體A82846B即可，較佳地為從諾卡氏土分離的東方擬無(wú)枝酸菌NRRL18099ο該菌株已在US005843437A中公開(kāi)。
[0032]步驟(I)中，所述的東方擬無(wú)枝酸菌活化的方法和條件可為本領(lǐng)域常規(guī)的方法和條件，本發(fā)明優(yōu)選將東方擬無(wú)枝酸菌劃線(xiàn)于種子斜面培養(yǎng)基，在28?30°C的條件下培養(yǎng)5?8天，即可。其中，所述的斜面培養(yǎng)基可為本領(lǐng)域常規(guī)使用的斜面培養(yǎng)基。
[0033]步驟(2)中，所述的東方擬無(wú)枝酸菌的種子液的用量較佳地為5%?15%，所述的百分比是指種子液的體積與發(fā)酵培養(yǎng)基的體積百分比。所述的發(fā)酵培養(yǎng)的溫度較佳地為25°〇?321:，更佳地為28°C?30°C。所述的發(fā)酵培養(yǎng)的時(shí)間較佳地為6?8天。所述的含有奧利萬(wàn)星前體A82846B的發(fā)酵液可按照本領(lǐng)域常規(guī)的方法將奧利萬(wàn)星前體A82846B分離出來(lái)，較佳地為將所述的含有奧利萬(wàn)星前體A82846B的發(fā)酵液進(jìn)行離心處理，取上清液，即可。
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