本發(fā)明涉及一種液體菌種質(zhì)量檢測的方法，尤其涉及一種食用菌工廠化栽培過程中液體菌種的質(zhì)量檢測方法，屬于微生物領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

我國食用菌工廠化產(chǎn)業(yè)經(jīng)歷了20多年的發(fā)展歷程，栽培設(shè)施硬件和技術(shù)水平均有了巨大的進(jìn)步與創(chuàng)新。菌種制備作為食用菌工廠化栽培過程的重要環(huán)節(jié)，逐漸由傳統(tǒng)的基于固體培養(yǎng)基料的二級、三級種生產(chǎn)工藝發(fā)展為具有純度高、活力強(qiáng)、周期短、成本低等優(yōu)點(diǎn)的液體菌種生產(chǎn)工藝。液體菌種的應(yīng)用大大縮短食用菌栽培周期，為食用菌工廠化高效標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)奠定了重要基礎(chǔ)，但液體菌種生產(chǎn)過程極易產(chǎn)生細(xì)菌污染，并且傳統(tǒng)固體菌種質(zhì)量檢查方法很難用來對液體菌種進(jìn)行質(zhì)控。

目前文獻(xiàn)報(bào)道的有關(guān)食用菌液體菌種細(xì)菌污染的檢測方法，主要包括感觀判斷、顯微鏡觀察、酸堿度測定以及培養(yǎng)檢測等。通過顏色、氣味以及形態(tài)等指標(biāo)的感觀判斷，雖然對于菌種發(fā)酵早期污染有較高準(zhǔn)確度，但對始于發(fā)酵后期的污染易造成失誤，同時(shí)并非所有細(xì)菌污染均會形成明顯的感官特征，并且主觀性的感官判斷缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)；顯微鏡觀察以及基于酸堿度變化的測定對液體菌種中的少量細(xì)菌污染檢測精度不夠，因此這些方法均可能形成誤判，從而可能造成生產(chǎn)上的嚴(yán)重?fù)p失。與上述檢測方法相比，培養(yǎng)方法可較為準(zhǔn)確地判斷液體菌種污染狀況，但由于培養(yǎng)時(shí)間一般需要24小時(shí)至48小時(shí)，檢測時(shí)效性較差，可能延誤液體菌種最佳接種時(shí)間，降低液體菌種發(fā)酵設(shè)備的利用效率。因此建立快速、精確的細(xì)菌污染檢測技術(shù)，是液體菌種技術(shù)安全、高效應(yīng)用的關(guān)鍵。

有關(guān)食用菌液體菌種質(zhì)量檢測的專利技術(shù)申請只有1件(CN 105087750A，“食用菌液體菌種檢測器”)，是一種用于液體菌種濃度檢測的裝置。針對液體菌種細(xì)菌污染檢測的專利申請信息幾乎未見。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種快速、精確測定食用菌液體菌種污染細(xì)菌數(shù)量的檢測方法。其基本理念是：運(yùn)用BAClight染色法對經(jīng)過了特異性分離的食用菌液體菌種中的污染細(xì)菌進(jìn)行熒光染色，通過建立細(xì)菌濃度與熒光定量指標(biāo)的數(shù)學(xué)關(guān)系模型，快速、精確測定食用菌液體菌種污染細(xì)菌數(shù)量。

為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明提供了一種食用菌液體菌種細(xì)菌污染檢測方法，包括如下步驟：

1)標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：

分別對獲得的各稀釋度的代表污染細(xì)菌稀釋菌懸液進(jìn)行NB平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)和熒光染色測定，所述的代表污染細(xì)菌為食用菌液體菌種常見污染細(xì)菌污染細(xì)菌G^-和G⁺類污染細(xì)菌中分別至少一種，如：假單胞菌(G^-)和枯草芽孢桿菌(G⁺)；隨后根據(jù)各稀釋度菌懸液平板計(jì)數(shù)結(jié)果(Bq)及相應(yīng)熒光染色測定結(jié)果(Fg)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，以明確每種代表污染細(xì)菌數(shù)量與熒光值之間線性關(guān)系范圍。

進(jìn)一步地，所述的代表污染細(xì)菌可以是兩種或者多種代表污染細(xì)菌株；優(yōu)選地，所述的標(biāo)準(zhǔn)曲線可以是所使用的代表污染細(xì)菌株標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2)根據(jù)食用菌菌絲與細(xì)菌細(xì)胞個(gè)體大小及形態(tài)的差異性，采用孔徑適宜的濾膜，即：適合過濾食用菌菌絲的濾膜，如：孔徑5μm尼龍網(wǎng)，對液體菌種進(jìn)行過濾，將食用菌絲球從液體菌種培養(yǎng)液濾除，避免其對污染細(xì)菌定量檢測產(chǎn)生干擾，優(yōu)選地，重復(fù)過濾3次；隨后，對濾液進(jìn)行離心，棄去培養(yǎng)液，并利用無菌生理鹽水對菌體沉淀物進(jìn)行洗滌，再沉淀，取無菌水對沉淀細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行再懸浮處理，并進(jìn)行梯度稀釋形成系列梯度菌懸液。

3)對步驟2)中獲得的污染細(xì)菌系列梯度菌懸液進(jìn)行染色并測定熒光值，方法同步驟1)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線制備，并依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算食用菌液體菌種中污染細(xì)菌濃度。

4)校正系數(shù)和校正公式的計(jì)算：通過待測菌種定量加入典型污染菌，形成模擬細(xì)菌污染液體菌種，并采用步驟2)及3)檢測計(jì)算其污染細(xì)菌濃度(測量值)，并與液體菌種中實(shí)際摻入污染細(xì)菌濃度比對，獲得校正系數(shù)；其校正公式為：實(shí)際值＝測量值×校正系數(shù)。其中，校正系數(shù)是考慮抽濾過程污染細(xì)菌菌體有一部分仍粘附于食用菌菌絲球中，從而使得通過上述方法獲得的污染細(xì)菌濃度低于實(shí)際濃度，因此建立了一個(gè)校正公式。

通過上述技術(shù)方案，本發(fā)明達(dá)到了如下的有益效果：

本發(fā)明提供的液體菌種細(xì)菌污染檢測方法可以把檢測時(shí)間控制在90分鐘內(nèi)，測定結(jié)果與基于培養(yǎng)的檢測結(jié)果誤差?。幌鄬τ诂F(xiàn)有技術(shù)中的感官判斷及鏡檢檢測方法具有明顯的準(zhǔn)確度優(yōu)勢，并且相對于傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測法具有便捷快速優(yōu)勢，因此是一種快捷、準(zhǔn)確的食用菌液體菌種細(xì)菌污染檢測方法；本發(fā)明方法針對液體菌種中污染細(xì)菌活細(xì)胞進(jìn)行精確的定量測定，從而為食用菌液體菌種工廠化應(yīng)用提供了快速、準(zhǔn)確、便捷的檢測手段，具有較廣泛的應(yīng)用推廣價(jià)值。

附圖說明

圖1是本發(fā)明食用菌液體菌種污染細(xì)菌數(shù)量熒光染色定量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線建立流程圖。

圖2是本發(fā)明一種食用菌液體菌種中污染細(xì)菌分離與檢測流程圖。

圖3是本發(fā)明模擬細(xì)菌污染的食用菌液體菌種中細(xì)菌數(shù)量測定及校正系數(shù)確定流程圖。

圖4是本發(fā)明中兩種典型污染細(xì)菌的熒光染色強(qiáng)度與平板計(jì)數(shù)結(jié)果的關(guān)系曲線(標(biāo)準(zhǔn)曲線)。圖中分別列出了熒光假單胞菌和枯草芽孢桿菌活菌濃度與BAClight染色綠熒光強(qiáng)度之間的數(shù)學(xué)關(guān)系以及兩者擬合后的活菌數(shù)量與綠熒光強(qiáng)度之間的數(shù)學(xué)關(guān)系。

圖5是抽濾裝置示意圖。其中，無菌環(huán)境指超凈工作臺環(huán)境，確?？諝庵须s菌對抽濾過程產(chǎn)生污染。圖中，1.濾杯，2.夾子，3.濾頭，4.錐形瓶，5.真空泵。

具體實(shí)施方式

為了闡明本發(fā)明的技術(shù)方案及技術(shù)目的，下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施方式對本發(fā)明做進(jìn)一步的介紹。

實(shí)施例1：

實(shí)施例1是本發(fā)明所提供的食用菌液體菌種細(xì)菌污染檢測方法的一種具體實(shí)施方式，包括以下步驟：

1.標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

圖1是本發(fā)明食用菌液體菌種污染細(xì)菌數(shù)量熒光染色定量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線建立流程，分別采用平板計(jì)數(shù)與熒光染色兩種方法獲得細(xì)菌濃度數(shù)值，并構(gòu)建兩者數(shù)學(xué)關(guān)系，形成標(biāo)準(zhǔn)曲線。本發(fā)明是以兩種典型污染細(xì)菌假單胞菌及枯草芽孢桿菌純菌株作為樣本的，本流程同樣適用于具體食用菌液體菌種生產(chǎn)過程中其它常見污染細(xì)菌熒光定量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建。

其具體操作步驟如下：

1.1以常見食用菌液體菌種污染細(xì)菌假單胞菌(G^-)及枯草芽孢桿菌(G⁺)作為污染細(xì)菌代表菌株，分別接種于滅菌NB液體培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：28℃恒溫，搖床轉(zhuǎn)速:180r/min，培養(yǎng)24小時(shí)后培養(yǎng)液細(xì)菌濃度(OD₆₀₀)范圍約為1.8-2.0；

1.2分別取假單胞菌、芽孢桿菌培養(yǎng)液10ml至50ml無菌離心管中，10000r/min離心5min，棄上清；

1.3用滅菌生理鹽水30ml充分洗滌菌體沉淀3次，每次均10000r/min離心5min，棄上清；

1.4取10ml無菌水對沉淀細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行再懸浮處理，利用渦旋儀使細(xì)菌沉淀在液體中分散均勻，并進(jìn)行10倍梯度稀釋形成系列梯度菌懸液；分別取200μl各梯度稀釋菌液涂布于滅菌NB平板培養(yǎng)基，28℃恒溫培養(yǎng)24小時(shí)后計(jì)數(shù)，計(jì)算各梯度稀釋液中活菌濃度(Bq)；

1.5分別對上述制備的假單胞菌、枯草芽孢桿菌梯度稀釋菌懸液(稀釋倍數(shù)為10⁰～10^-10)進(jìn)行熒光染色，染色劑分別用2.5mL滅菌去離子水溶解，實(shí)驗(yàn)時(shí)等比例混合，具體方法：于1ml系列稀釋菌懸液分別加入25μl SYTO 9+PI(1:1混合)，均勻混合，室溫避光染色15min；

1.6利用上海棱光F97Xp熒光分光光度計(jì)測定上述各稀釋度細(xì)菌染液熒光強(qiáng)度，儀器測定條件：激發(fā)波長470nm，發(fā)射波長510nm，激發(fā)、發(fā)射光譜帶寬均為5nm，測定綠光吸收波長(510nm)峰值計(jì)為Fg；

1.7依據(jù)各稀釋度菌懸液平板計(jì)數(shù)結(jié)果(Bq)及相應(yīng)熒光染色測定結(jié)果(Fg)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Fg₁＝250.7lg(Bq₁)+249.2，R²＝0.997，檢測范圍5.2×10⁰～5.2×10⁷cfu/ml；芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)曲線：Fg₂＝248.5lg(Bq₂)+216.7，R²＝0.995，檢測范圍8.5×10⁰～8.5×10⁷cfu/ml；擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線：Fg＝249.6lg(Bq)+232.9，R²＝0.996。如圖4所示?？紤]到食用菌液體菌種發(fā)酵過程細(xì)菌污染種類的復(fù)雜性可能，本發(fā)明以擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)學(xué)公式作為以下污染細(xì)菌數(shù)量的計(jì)算公式。

2.食用菌液體菌種中污染細(xì)菌的分離與檢測：

食用菌液體菌種中污染細(xì)菌分離與檢測流程可見圖2。

具體包括如下步驟：

2.1利用津騰GM-0.33II隔膜真空泵對250ml食用菌液體菌種進(jìn)行抽濾，收集菌種中污染細(xì)菌體。濾膜采用孔徑5μm尼龍網(wǎng)，壓強(qiáng)1500Pa，抽濾過程均在超凈工作臺進(jìn)行；

2.2取無菌生理鹽水30ml充分洗滌濾膜上的菌絲，并抽濾入細(xì)菌收集瓶(見圖5)，重復(fù)3次，以洗出吸附在菌絲及濾膜表面的細(xì)菌細(xì)胞；

2.3將上述細(xì)菌收集瓶中濾液(約330ml)分批裝入2只50ml無菌離心管(離心管1、離心管2)中，10000r/min離心5min，最終獲得上述濾液菌體沉淀；

2.4取滅菌生理鹽水30ml充分洗滌菌體沉淀2次，每次均10000r/min離心5min，棄上清；取滅菌生理鹽水10ml加入離心管1中，懸浮處理后將懸浮液合并入離心管2，并再取滅菌生理鹽水10ml洗滌離心管1后并入離心管2，重復(fù)洗滌1次并將洗滌液并入離心管2。對離心管2離心處理，方法同上，最終獲得食用菌液體菌種中污染細(xì)菌細(xì)胞沉淀。

2.5取10ml無菌水對沉淀細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行再懸浮處理，利用渦旋儀使菌體均勻懸浮，并進(jìn)行10倍梯度稀釋形成系列稀釋度菌懸液；

2.6取稀釋度為10^-1、10^-3、10^-5、10^-7菌懸液1ml，分別加入25μl SYTO 9+PI(1:1混合)，均勻混合，室溫避光染色15min；

2.7利用上海棱光F97Xp熒光分光光度計(jì)測定染液熒光強(qiáng)度(方法同實(shí)施例1中步驟1.6)，選擇熒光強(qiáng)度值位于標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍的樣本，依據(jù)擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線(見實(shí)施例1中步驟1.7)進(jìn)行活菌數(shù)(Bq)計(jì)算，并計(jì)算樣本活菌數(shù)平均測定值。

實(shí)施例2：

本實(shí)施例2中，使用實(shí)施例1中的方法對模擬細(xì)菌污染的金針菇菌液體菌種進(jìn)行了細(xì)菌數(shù)量的測定，其流程圖見圖3。

具體包括如下步驟：

1)培養(yǎng)基的制備：平板培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基；液體培養(yǎng)基：玉米粉5％，麥麩3％，酵母膏1％，蔗糖4％，KH₂PO₄ 0.1％，MgSO₄ 0.15％,VB1 10mg/L，pH＝5.5。

2)金針菇平板菌種制備：將配制好的PDA培養(yǎng)基于高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌(121℃，30min)處理后分裝于滅菌培養(yǎng)皿中，冷卻凝固后倒置于恒溫培養(yǎng)箱28℃培養(yǎng)過夜，剔除污染平板；將金針菇菌種接于PDA平板培養(yǎng)基上，于28℃恒溫恒濕培養(yǎng)7d；

3)金針菇液體菌種制備：將200ml液體培養(yǎng)基裝于500ml的錐形瓶，并通過高壓蒸汽滅菌鍋滅菌(121℃，30min)，冷卻后每瓶接入3塊1cm²金針菇菌種，28℃恒溫，180r/min搖培8d；搖床中放置無菌濕毛巾，以保證菌種搖培處于恒濕環(huán)境。

4)模擬細(xì)菌污染金針菇液體菌種制備：分別吸取假單胞菌菌懸液(稀釋平板計(jì)數(shù)濃度為2.9×10⁷cfu/ml)、芽孢桿菌菌懸液(稀釋平板計(jì)數(shù)濃度為8.7×10⁷cfu/ml)各10ml分別加入上述培養(yǎng)8d的金針菇液體菌種中并搖勻；

5)金針菇液體菌種污染細(xì)菌分離：利用津騰GM-0.33II隔膜真空泵分別對上述混合液進(jìn)行抽濾(見圖5)，濾膜選用孔徑5μm尼龍網(wǎng)，利用滅菌生理鹽水充分洗滌濾膜上的菌絲3次并分別抽濾，對收集的菌體離心沉淀，再懸浮，并進(jìn)行梯度稀釋獲得一系列稀釋度的菌懸液(具體操作同實(shí)施例1中步驟2.1—2.4)；

6)分別取系列稀釋度菌懸液中稀釋度為10^-1、10^-3、10^-5、10^-7菌懸液1ml，分別加入25μl SYTO 9+PI(1:1混合)，并混合均勻，室溫避光染色15min；

7)利用上海棱光F97Xp熒光分光光度計(jì)測定染液熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長470nm，發(fā)射波長510nm，激發(fā)、發(fā)射光譜帶寬均為5nm，測定綠光吸收波長(510nm)的峰值Fg；并根據(jù)擬合計(jì)算公式計(jì)算活菌濃度，假單胞菌計(jì)算值分別為1.37×10⁶cfu/ml、1.48×10⁶cfu/ml、1.54×10⁶cfu/ml、1.33×10⁶cfu/ml，與理論值相比，誤差范圍為-8.28％～+6.21％；芽孢桿菌數(shù)量分別為4.01×10⁶cfu/ml、4.78×10⁶cfu/ml、3.86×10⁶cfu/ml、4.41×10⁶cfu/ml，與理論值相比，誤差范圍為-11.26％～+9.89％。

實(shí)施例3：

本實(shí)施例3中，使用實(shí)施例1中的方法對模擬細(xì)菌污染的杏孢菇菌液體菌種進(jìn)行了細(xì)菌數(shù)量的測定，其流程圖見圖3。

1)培養(yǎng)基的制備：平板培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基；液體培養(yǎng)基：葡萄糖3％，蛋白胨0.2％，酵母膏0.5％，KH₂PO₄ 0.05％，MgSO₄ 0.05％，VB1 10mg/L，pH＝7.5。

2)杏鮑菇平板菌種制備：將PDA培養(yǎng)基于高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌(121℃，30min)，滅菌后，將培養(yǎng)基分裝入滅菌平板中，冷卻凝固后倒置于恒溫培養(yǎng)箱28℃培養(yǎng)過夜，剔除污染平板；將杏鮑菇菌種接于PDA培養(yǎng)基上，于28℃恒溫恒濕培養(yǎng)7d；

3)杏鮑菇液體菌種制備：將液體培養(yǎng)基分裝于500ml的錐形瓶中，每瓶200ml，并置于高壓蒸汽滅菌鍋中進(jìn)行滅菌，冷卻后，每瓶培養(yǎng)基接入3塊1cm²杏鮑菇菌種，28℃恒溫，180r/min搖培8d；搖床中放置無菌濕毛巾，以保證菌種搖培處于恒濕環(huán)境。

4)模擬細(xì)菌污染杏鮑菇液體菌種制備分別吸取假單胞菌菌懸液(稀釋平板計(jì)數(shù)濃度為2.9×10⁷cfu/ml)、芽孢桿菌菌懸液(稀釋平板計(jì)數(shù)濃度為8.7×10⁷cfu/ml)各10ml分別加入上述培養(yǎng)8d的杏鮑菇液體菌種中，混合均勻；

5)杏鮑菇液體菌種污染細(xì)菌分離：利用津騰GM-0.33II隔膜真空泵分別對上述混合液進(jìn)行抽濾(見圖5)，并利用滅菌生理鹽水充分洗滌濾膜上的菌絲3次并分別抽濾；濾膜選用5μm尼龍網(wǎng)，壓強(qiáng)1500Pa；利用滅菌生理鹽水充分洗滌濾膜上的菌絲3次并分別抽濾，對收集的菌體離心沉淀，再懸浮，并進(jìn)行梯度稀釋獲得一系列稀釋度的菌懸液(具體操作同實(shí)施例1中步驟2.1—2.4)；

6)分別取系列梯度菌懸液中稀釋度為10^-1、10^-3、10^-5、10^-7菌懸液1ml，分別加入25μl SYTO 9+PI(1:1混合)，并混合均勻，室溫避光染色15min；

7)利用上海棱光F97Xp熒光分光光度計(jì)測定染液熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長470nm，發(fā)射波長510nm，激發(fā)、發(fā)射光譜帶寬均為5nm，測定綠光吸收波長(510nm)的峰值Fg；并根據(jù)擬合計(jì)算公式計(jì)算活菌濃度，假單胞菌數(shù)量分別為1.34×10⁶cfu/ml、1.42×10⁶cfu/ml、1.58×10⁶cfu/ml、1.30×10⁶cfu/ml，與理論值相比，誤差范圍為-10.34％～+8.97％；芽孢桿菌數(shù)量分別為3.93×10⁶cfu/ml、4.16×10⁶cfu/ml、4.56×10⁶cfu/ml、4.81×10⁶cfu/ml，與理論值相比，誤差范圍為-9.66％～+6.89％。

實(shí)施例4：

本實(shí)施例4中，對某食用菌工廠化生產(chǎn)企業(yè)金針菇不同批次液體菌種進(jìn)行了細(xì)菌數(shù)量測定。具體包括如下步驟：

1)對某食用菌工廠金針菇液體菌種樣本進(jìn)行梯度稀釋，分別取200μl各梯度(10^-1、10^-3、10^-5、10^-7)稀釋菌液涂布于無菌NB平板28℃恒溫培養(yǎng)24小時(shí)計(jì)數(shù)，每個(gè)梯度3個(gè)重復(fù)，平板菌落數(shù)在30－300之間的樣本用于計(jì)算活菌數(shù)平均值。

2)取250ml金針菇液體菌種按前述(實(shí)施例1中步驟2.1—2.4)方法進(jìn)行抽濾、離心并制作液體菌種中污染細(xì)菌梯度稀釋菌懸液。

3)分別取1mL梯度菌懸液(10^-1、10^-3、10^-5、10^-7)，分別加入25μl SYTO 9+PI(1:1混合)，并混合均勻，室溫避光染色15min；利用上海棱光F97Xp熒光分光光度計(jì)測定染液熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長470nm，發(fā)射波長510nm，激發(fā)、發(fā)射光譜帶寬均為5nm，測定綠光吸收波長(510nm)的峰值Fg。

4)依據(jù)實(shí)施例2和3中模擬細(xì)菌污染金針菇及杏鮑菇液體菌種中細(xì)菌數(shù)量實(shí)際值與擬合公式計(jì)算值，計(jì)算出實(shí)際值與測量值間校正系數(shù)為1.869，即實(shí)際值＝測量值×1.896；并根據(jù)擬合曲線以及校正系數(shù)計(jì)算活菌數(shù)。金針菇液體菌種不同批次樣本污染細(xì)菌數(shù)量檢測結(jié)果見表1。

表1金針菇液體菌種不同批次樣本污染細(xì)菌數(shù)量檢測結(jié)果

實(shí)施例5：

本實(shí)施例5中，對某食用菌工廠化生產(chǎn)企業(yè)杏鮑菇不同批次液體菌種中細(xì)菌數(shù)量測定。

具體包括如下步驟：

1)對某食用菌工廠杏鮑菇液體菌種樣本進(jìn)行梯度稀釋，分別取200μl各梯度稀釋菌液(10^-1、10^-3、10^-5、10^-7)接種于滅菌NB平板培養(yǎng)基28℃，恒溫培養(yǎng)24小時(shí)后計(jì)數(shù)，每個(gè)稀釋度設(shè)3重復(fù)，計(jì)算方法同5.3.1；

2)取250ml杏鮑菇液體菌種按上述(實(shí)施例1中步驟2.1—2.4)方法進(jìn)行抽濾、離心、洗滌、沉淀后，制作液體菌種中污染細(xì)菌梯度稀釋菌懸液；

3)分別取系列梯度菌懸液中稀釋度為10^-1、10^-3、10^-5、10^-7的菌懸液1ml，分別加入25μl SYTO 9+PI(1:1混合)，并混合均勻，室溫避光染色15min；利用上海棱光F97Xp熒光分光光度計(jì)測定染液熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長470nm，發(fā)射波長510nm，激發(fā)、發(fā)射光譜帶寬均為5nm，測定綠光吸收波長(510nm)的峰值Fg；并根據(jù)擬合曲線及實(shí)施例4步驟4)中所述的校正系數(shù)計(jì)算活菌數(shù)。杏鮑菇液體菌種不同批次樣本污染細(xì)菌數(shù)量檢測結(jié)果見表2。

表2杏鮑菇液體菌種不同批次樣本污染細(xì)菌數(shù)量檢測結(jié)果

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進(jìn)，本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書、說明書及其等效物界定。