一種淡黃色鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)薩菲菌素的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種淡黃色鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)薩菲菌素的新型培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]薩菲菌素是由鏈霉菌產(chǎn)生的一種新型大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，是目前常用的免疫抑制劑。薩菲菌素主要是由5種組分組成，分別是A、B、C、D和E組分，薩菲菌素A是其中的關(guān)鍵組分，含量較高。目前，上市的免疫抑制藥物存在一定的腎毒性和中樞毒性副作用，因此薩菲菌素作為新一代高效、低毒免疫抑制劑，具有較高的藥物開發(fā)價(jià)值和市場(chǎng)前景。
[0003]目前，國(guó)內(nèi)薩菲菌素的發(fā)酵生產(chǎn)采用二級(jí)或三級(jí)發(fā)酵模式，該方式存在的主要問(wèn)題有以下幾點(diǎn):
I薩菲菌素發(fā)酵水平較低，其發(fā)酵水平維持在5?8mg/L。
[0004]2發(fā)酵培養(yǎng)基含有葡萄糖和氨基酸，滅菌過(guò)程中以產(chǎn)生“美拉德反應(yīng)”，即產(chǎn)生抑制菌體的有毒物質(zhì)。
[0005]3發(fā)酵培養(yǎng)基中加入了吸附樹脂，增加了發(fā)酵和提取成本。
[0006]4薩菲菌素發(fā)酵生產(chǎn)所需的原材料采購(gòu)成本較高，特別是薩菲菌素培養(yǎng)基中常用的有機(jī)氮源酵母提取物市場(chǎng)價(jià)格較高，從而提高發(fā)酵成本，降低市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。
[0007]5薩菲菌素發(fā)酵培養(yǎng)后期容易出現(xiàn)菌體自溶現(xiàn)象，降低了發(fā)酵效價(jià)。
[0008]6發(fā)酵培養(yǎng)基中加入了氨基酸，發(fā)酵液容易變色，增加了提取純化的難度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的就在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種發(fā)酵工藝簡(jiǎn)單，有效提高發(fā)酵單位，同時(shí)最大限度的降低原輔料對(duì)發(fā)酵單位的影響，降低生產(chǎn)成本，且原輔料來(lái)源不受環(huán)境影響，保證其供應(yīng)充足，實(shí)現(xiàn)薩菲菌素穩(wěn)定、高效生產(chǎn)的新型培養(yǎng)基。
[0010]本發(fā)明的另一目的是提供利用上述培養(yǎng)基生產(chǎn)薩菲菌素的培養(yǎng)方法。
[0011]為實(shí)現(xiàn)上述目的所采取的技術(shù)方案為:
一種淡黃色鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)薩菲菌素的培養(yǎng)基，其特征在于包括種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基，其中
所述種子培養(yǎng)基的組成為:花生油I?5ml/L、麥芽糖5?9g/L、麥芽糖酶0.001?0.005g/L、蟲丘蟲弓丨粉11?15g/L、玉米楽10?14ml/L、生物氮素5?9g/L、硝酸錢0.5?0.9g/L、輕質(zhì)碳酸媽I?5g/L ;磷酸二氫鉀0.1?0.5g/L ；
所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為:花生油10?14ml/L、麥芽糖15?19g/L、麥芽糖酶0.003?
0.007g/L、蚯蚓粉20?24g/L、玉米漿17?21ml/L、生物氮素12?16g/L、硫酸銨0.5?0.9g/L、輕質(zhì)碳酸1? 3?7g/L、磷酸二氫鉀0.5?0.9g/L、氯化鉀0.1?0.5g/L、硫酸鎂0.03 ?0.07g/L、硫酸亞鐵 0.1 ?0.5g/L、氯化鈷 0.003 ?0.007g/L，氧載體 0.1 ?0.5g/L、堿式碳酸鎂或氧化鋁0.3?0.7g/L、聚氧丙烯甘油0.3?0.4g/L。
[0012]所述氧載體是正己烷或全氟化碳。
[0013]利用上述培養(yǎng)基生產(chǎn)薩菲菌素的培養(yǎng)方法，其特征在于其工藝步驟為:
O種子培養(yǎng):首先將種子培養(yǎng)基滅菌并冷卻至25?30°C，并用無(wú)菌空氣保壓，然后在火焰保護(hù)下，將已經(jīng)培養(yǎng)好的淡黃色鏈霉菌母瓶發(fā)酵液按照0.1?0.2L/m3的接種量接入種子培養(yǎng)基中進(jìn)行種子培養(yǎng)，至菌體濃度20?30%、pH值6?7、培養(yǎng)時(shí)間40?60h移種；
2)發(fā)酵培養(yǎng):先將發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌，冷卻至20?27°C，并用無(wú)菌空氣保壓，然后將培養(yǎng)好的種子液移入發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，至菌體濃度35?40%、總糖< 10mg/100ml、氨基氮5?15mg/100ml、化學(xué)效價(jià)> 10mg/L、pH6?7、培養(yǎng)時(shí)間140?160h終止發(fā)酵。
[0014]所述種子液的移種為:種子培養(yǎng)結(jié)束，首先移種8?10%，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)60?70h時(shí)，再次移種3?5%。
[0015]所述種子培養(yǎng)基滅菌后的的質(zhì)量要求為:氨基氮30?50mg/100ml、溶磷30?50ug/ml、總糖 10 ?20mg/100ml、pH6 ?7。
[0016]所述發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后的質(zhì)量要求為:氨基氮60?80mg/100ml、溶磷50?100ug/ml、總糖 30 ?40mg/100ml、pH6 ?7。
[0017]所述培養(yǎng)好的淡黃色鏈霉菌母瓶發(fā)酵液質(zhì)量要求為:pH6?8 ;菌體濃度25?30% ;鏡檢無(wú)雜菌。
[0018]所述種子培養(yǎng)條件為:罐壓0.03?0.05MPa ;罐溫24?26°C;空氣流量:0?10h，采用空氣攪拌代替機(jī)械攪拌；llh?移種:20?40m3/h ;攪拌轉(zhuǎn)速60?80r/min。
[0019]所述發(fā)酵培養(yǎng)條件為:
a培養(yǎng)基初始pH:發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后pH控制在6?7 ; b溫度:采用變溫控制工藝，
O?50h:培養(yǎng)溫度26?27°C，
51?120h:培養(yǎng)溫度24?25°C，
121h?發(fā)酵結(jié)束:培養(yǎng)溫度23?24°C ； c攪拌轉(zhuǎn)速:采用變頻攪拌控制工藝，
O?50h:轉(zhuǎn)速控制在80r/min，
51?120h:轉(zhuǎn)速控制在120r/min，
121h?發(fā)酵結(jié)束:轉(zhuǎn)速控制在90r/min ； d壓力控制:罐壓0.05?0.06MPa ； e pH控制:發(fā)酵過(guò)程中pH控制在5?7 ; f空氣流量:
O ?50h:150 ?200m3A ;
51 ?120h:200 ?300m3/h ；
121h?發(fā)酵結(jié)束:50?100m3/h ； h溶氧控制:
發(fā)酵前50h內(nèi)，不控制溶氧；
51?80h，溶氧控制在60%以上；
81?120h，溶氧控制在30%以上；
121?發(fā)酵結(jié)束:溶氧控制在40%以上。
[0020]所述發(fā)酵過(guò)程中采用流加法進(jìn)行補(bǔ)料，補(bǔ)料包括補(bǔ)增效劑、補(bǔ)水、補(bǔ)硝酸銨、補(bǔ)麥芽糖和pH控制，其中
a補(bǔ)增效劑工藝控制:
發(fā)酵前50h不用進(jìn)行補(bǔ)增效劑，
發(fā)酵時(shí)間在51?120h，當(dāng)脂肪含量低于lg/L，補(bǔ)入增效劑，控制脂肪含量為I?1.5g/L，每隔6?8h檢測(cè)發(fā)酵液脂肪含量，
發(fā)酵時(shí)間在121h?發(fā)酵結(jié)束，當(dāng)脂肪含量低于0.3g/L，補(bǔ)入增效劑，控制脂肪含量為
0.3?0.5g/L，每隔6?8h檢測(cè)發(fā)酵液脂肪含量； b補(bǔ)水工藝控制:
發(fā)酵前60h不用進(jìn)行補(bǔ)水，
發(fā)酵時(shí)間在61?121h，當(dāng)菌體濃度高于40%，加入滅菌水，要求控制發(fā)酵液菌體濃度在35?40%，每隔6?8h檢測(cè)發(fā)酵液菌體濃度，
發(fā)酵時(shí)間在121h?發(fā)酵結(jié)束，當(dāng)菌體濃度高于35%，加入滅菌水，要求控制發(fā)酵液菌體濃度在30?35%，每隔6?8h檢測(cè)發(fā)酵液菌體濃度；c發(fā)酵過(guò)程pH控制工藝:
發(fā)酵前60h，pH不進(jìn)行控制，
發(fā)酵時(shí)間在61?120h，若pH < 6.0，加入10?20%的氫氧化鈉，調(diào)節(jié)pH至6?7 ;若pH > 7，加入30%的硫酸溶液，調(diào)節(jié)pH至6?7，
發(fā)酵時(shí)間在121?發(fā)酵結(jié)束，若pH < 6.3，加入10?20%的氫氧化鈉，調(diào)節(jié)pH控至
6.3?6.7 ;若pH > 6.7，加入30%的硫酸溶液，調(diào)節(jié)pH至6.3?6.7 ; d補(bǔ)入麥芽糖:
發(fā)酵前60h，總糖含量不進(jìn)行控制，
發(fā)酵61h至120h:總糖含量< 15mg/100ml時(shí)，補(bǔ)入已滅菌的麥芽糖溶液，使總糖的含量控制在15?20mg/100ml.發(fā)酵121h至發(fā)酵結(jié)束:總糖含量< 5mg/100ml時(shí)，補(bǔ)入已滅菌的麥芽糖溶液，使總糖的含量控制在5?10mg/100ml。
[0021]上述補(bǔ)糖工藝中加入麥芽糖酶，其濃度控制在0.001?0.003%。
[0022]e補(bǔ)硫酸銨:
薩菲菌素發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中，分別在60h和120h補(bǔ)入30%的硫酸銨溶液，其用量控制在發(fā)酵液體積的0.01?0.03%。本發(fā)明的技術(shù)優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在:
I本發(fā)明確認(rèn)了種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)碳源、氮源和最佳配伍比例。
[0023]2本發(fā)明對(duì)種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)的工藝進(jìn)行了詳細(xì)的闡述，確認(rèn)了薩菲菌素最佳的發(fā)酵工藝和控制參數(shù)。通過(guò)本發(fā)明發(fā)酵生產(chǎn)薩菲菌素，最終使得發(fā)酵單位達(dá)到10mg/L以上，同國(guó)內(nèi)技術(shù)相比，發(fā)酵單位提高了 20%以上。
[0024]3本發(fā)明適用于規(guī)模化發(fā)酵生產(chǎn)薩菲菌素，能夠滿足年產(chǎn)1000噸薩菲菌素的生產(chǎn)需求。
[0025]4培養(yǎng)基中使用麥芽糖代替葡萄糖，避免出現(xiàn)葡萄糖碳化現(xiàn)象；培養(yǎng)基中停止使用吸附樹脂和氨基酸，降低了發(fā)酵成本，有利于薩菲菌素提取和純化。
[0026]5薩菲菌素發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中，二次補(bǔ)入種子培養(yǎng)基，有效減緩了發(fā)酵后期菌體自溶的現(xiàn)象，為提高薩菲菌素發(fā)酵水平奠定了基礎(chǔ)。
[0027]具體實(shí)施方法
下面用實(shí)例予以說(shuō)明本發(fā)明，應(yīng)該理解的是，實(shí)例是用于說(shuō)明本發(fā)明而不是對(duì)本發(fā)明的限制。本發(fā)明的范圍與核心內(nèi)容依據(jù)權(quán)利要求書加以確定。
[0028]下述實(shí)施例的菌種選用淡黃色鏈霉菌:生產(chǎn)使用的菌種來(lái)源為母瓶發(fā)酵液。母瓶發(fā)酵液質(zhì)量要求為:pH6?8 ;菌體濃度10?30% ;鏡檢無(wú)雜菌。
[0029]下述實(shí)施例的增效劑來(lái)源于四川師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院。
[0030]實(shí)施例1
種子培養(yǎng):種子培養(yǎng)基體積10m3。
[0031]種子培養(yǎng)基:花生油10L、麥芽糖50kg、麥芽糖酶10g、蚯蚓粉110kg、玉米漿100L、生物氮素50kg、硝酸錢5kg、輕質(zhì)碳酸1? 1kg ;磷酸二氫鉀1kg。
[0032]首先將種子培養(yǎng)基滅菌并冷卻至25?30°C，并用無(wú)菌空氣保壓。經(jīng)檢測(cè)，氨基氮31mg/100ml、溶磷32ug/ml、總糖llmg/100ml、pH6.2。在火焰保護(hù)下，將淡黃色鏈霉菌母瓶發(fā)酵液移入種子培養(yǎng)基，移種量為1L。種子培養(yǎng)條件為罐壓0.03?0.05MPa ;罐溫24?260C ;空氣流量:0?10h，采用空氣攪拌代替機(jī)械攪拌；llh?移種:20m3/h ;攪拌轉(zhuǎn)速60r/min。種子培養(yǎng)結(jié)束，菌體濃度20%、p