本發(fā)明涉及一株糞腸球菌，尤其涉及一株對擬穴青蟹具有益生活性的糞腸球菌Y17及其篩選培養(yǎng)與應用。

背景技術：

擬穴青蟹(Scylla paramamosain) ，簡稱青蟹，屬廣鹽廣溫性的海水經(jīng)濟甲殼動物, 主要分布于我國東南沿海地區(qū), 是粵東特別是汕頭主要的海水養(yǎng)殖品種，具有生長快、個體大、適應性和抗病能力強、耐干露、易運輸、肉味鮮美獨特、營養(yǎng)豐富等特點, 頗受國內外生產(chǎn)者和消費者的青睞。近年來青蟹病害特別是病毒性?。ㄈ缜嘈窏U狀病毒病，呼腸孤樣病毒?。?、細菌性病和寄生蟲病等給我省乃至全國青蟹養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。如自2004年秋冬以來，廣東青蟹養(yǎng)殖發(fā)生了前所未有的突發(fā)性病害，尤其是育肥過程中，膏蟹的死亡率在70 %以上。2005～2006年廣東南水青蟹育肥死亡率在90 %以上。2006、2007年的病害仍然嚴重，發(fā)病情況和發(fā)病時間與前2年基本相同。4年來，僅汕頭牛田洋圍墾區(qū)群眾青蟹養(yǎng)殖就減產(chǎn)了60％，估計每年經(jīng)濟損失達5000萬元以上。汕頭市青蟹養(yǎng)殖面積10萬余畝；其中牛田洋圍墾區(qū)3萬多畝。青蟹病害發(fā)病迅速、范圍廣，主要爆發(fā)于每年的9-11月份。

一般認為，青蟹屬甲殼類無脊椎動物，不具備特異性免疫系統(tǒng)，其免疫以非特異性免疫為主，故運用疫苗防治青蟹病害的可靠性和廣泛性目前尚存在爭論。迄今為止，國內外許多學者從青蟹病原、青蟹免疫防御機制和養(yǎng)殖環(huán)境等多方面進行了大量的研究和探索，在青蟹病害治療方面取得了許多進展，但是這些研究很難從根本上解決青蟹的病害問題。因此，尋找“以防為主”的生態(tài)學防治方法，被認為是解決目前青蟹養(yǎng)殖疾病，提高青蟹品質的一條有效途徑。

使用益生菌進行青蟹的生態(tài)健康養(yǎng)殖，是提高青蟹免疫力，預防青蟹病害特別是細菌性病害的有效途徑之一。目前已有報道的水產(chǎn)益生茵有乳酸茵屬、雙歧桿菌屬、弧茵屬、假單胞茵屬、芽孢桿菌、硝化茵、光合茵等。乳酸茵、芽孢桿菌、酵母茵等已作為餌料添加劑應用于水產(chǎn)動物，起到很好的防治疾病和增進健康的作用。為陸生生物設計的微生態(tài)制劑應用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中，不一定能盡快成為優(yōu)勢菌而進行微生態(tài)調節(jié)，而且，這些微生物很容易隨著時間而逐漸消亡。益生菌目前已應用在對蝦、貝類及其他海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖動物上，但是適用于蝦貝的益生菌并不一定在青蟹養(yǎng)殖中起作用或作用效果不明顯。開發(fā)針對青蟹的益生菌種，對青蟹高密度及健康生態(tài)養(yǎng)殖模式意義重大。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明實施例所要解決的技術問題在于，提供一株糞腸球菌Y17及其篩選培養(yǎng)與應用解決現(xiàn)有技術存在的問題。

為了實現(xiàn)上述的目的，采用如下的技術方案：

一株糞腸球菌Y17 Enterococcus faecalis Y17，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏單位地址為中國武漢大學，保藏日期為2016年5月5日， 其保藏編號為CCTCC NO：M2016249，分類命名為糞腸球菌Y17 Enterococcus faecalis Y17。

進一步的，所述糞腸球菌Y17對絕大多數(shù)抗生素均沒有耐受性；所述糞腸球菌Y17對副溶血弧菌有顯著抑菌效果。嗜水氣單胞菌、溶藻弧菌、金黃色葡萄球菌均有抑菌活性。具備一定的抗逆性、拮抗致病菌能力，無血細胞溶解性，安全性高，分泌卵黃卵磷脂酶及酸性物質（有機酸），革蘭氏陽性，pH耐受性高，在pH=2時仍有17%的活菌率。對絕大多數(shù)抗生素無耐藥性，經(jīng)浸浴試驗驗證對宿主無害,經(jīng)過養(yǎng)殖試驗驗證它還能夠提高機體的免疫力。Y17對復方新諾明、丁胺卡那霉素、新霉素、麥迪霉素、多粘菌素B、頭孢呋辛、慶大霉素、苯唑青霉素和頭孢他啶耐受性高。

一種糞腸球菌Y17的篩選方法，主要包括以下步驟：

（1）在包含糞腸球菌Y17的剪碎的腸道加入含有無菌玻璃珠的0.85%NaCl中，置于搖床，28℃恒溫2~4h，搖床轉速為180rpm；

（2）取上清液涂布MRS 平板，于MRS液體培養(yǎng)基28℃恒溫培養(yǎng)48h；

（3）搖菌液并保種，將保種菌液劃線，待長出菌落后，用無菌牙簽挑取單菌落，接種于已經(jīng)涂布致病菌Vp的MRS平板，28℃恒溫培養(yǎng)48h；

（4）重新劃平板，分離純化，加甘油后保種于-80℃。

MRS平板是乳酸菌專用篩選平板，和其他平板比更有利于乳酸菌的生長。無菌玻璃珠有利于腸道研磨得更充分，這樣液體中的菌濃度更高，有利于篩選到更多有利微生物。重新劃板有利于挑選活性更好的菌落，優(yōu)化菌種。

進一步的，所述糞腸球菌Y17接種量為1%，pH 值為7.0。

一種糞腸球菌Y17在抑制副溶血弧菌生長中的用途。

一種糞腸球菌Y17在制備益生菌制劑中的用途。

一種益生菌制劑，含有上述的糞腸球菌Y17。

一種菌粉，采用上述糞腸球菌Y17制備的。

上述菌粉作為飼料添加劑的用途。

一種青蟹飼料，含有上述糞腸球菌Y17，所述糞腸球菌Y17的活菌數(shù)為1×10⁸ - 1×10⁹cfu/g。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明提供了一株糞腸球菌Y17，該糞腸球菌Y17對復方新諾明、丁胺卡那霉素、新霉素、麥迪霉素、多粘菌素B、頭孢呋辛、慶大霉素、苯唑青霉素和頭孢他啶具有較高的耐受性，對副溶血弧菌有顯著抑菌效果，而且還能夠提高機體的免疫力，其應用前景廣泛，可以將其應用于益生菌制劑，也可以將其制成菌粉，作為飼料添加劑添加到飼料中，用來抑制動物體內致病菌生長，降低動物尤其是青蟹的死亡率，是一株值得開發(fā)的益生菌株。

附圖說明

圖1為本發(fā)明菌株Y17的掃描電鏡照片；

圖2為本發(fā)明菌株Y17的系統(tǒng)進化樹；

圖3為本發(fā)明菌株Y17對青蟹病原菌副溶血弧菌的抑菌效果圖片；

圖4為Y17對嗜水氣單胞菌，溶藻弧菌，金黃色葡萄球菌牛津杯抑菌實驗圖；

圖5為本發(fā)明菌株Y17在青蟹副溶血弧菌刺激時血液中ALF基因的表達情況；

圖6為本發(fā)明菌株Y17在青蟹副溶血弧菌刺激時血液中CAT基因的表達情況；

圖7為飼料中添加本發(fā)明菌株Y17接受副溶血弧菌刺激后3天內的累積成活率。

具體實施方式

為使本發(fā)明的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結合附圖對本發(fā)明作進一步地詳細描述。

實施例

1、糞腸球菌Y17的分離篩選和鑒定。

菌株分離于養(yǎng)殖的擬穴青蟹腸道，養(yǎng)殖青蟹為病害爆發(fā)后幸存的“耐病蟹”。蒸餾水沖洗擬穴青蟹表面的污泥等雜物，酒精噴灑之后，于超凈臺下解剖并取腸道內容物，完成青蟹腸道內容物樣品的采集。剪碎的腸道加入0.85%NaCl中，其中含有無菌玻璃珠，28℃，搖床轉速180rpm，2~4h后，取上清液涂布MRS 平板，28℃恒溫培養(yǎng)48h，后挑單菌落。搖菌液并保種，將保種菌液劃線，待長出菌落后，用無菌牙簽挑取單菌落，接種于已經(jīng)涂布致病菌Vp的MRS平板，28℃恒溫培養(yǎng)48h 后，選擇其中具有抑菌活性的菌種進行牛津杯實驗，挑選抑菌圈最大的幾株菌，進行消化酶，溶血性檢測，發(fā)現(xiàn)Y17效果最好且無溶血性，將其重新劃平板，分離純化，并加甘油后保種于-80℃。

為鑒定菌株，先采用掃描電鏡觀察細胞形態(tài)以及測試菌株的部分生理生化反應，掃描電鏡圖如圖1所示，可以初步判斷該菌株為糞腸球菌。

再通過16SrDNA序列分析，采用的引物為通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') 和1492R(5'-TACCTTGTTACGACTT-3')進行PCR，克隆并測序。NCBI網(wǎng)站中Blast比對發(fā)現(xiàn)，該菌株與Enterococcus faecalis ATCC19433同源性最高（99.97%），確定為Enterococcus faecalis Y17（以下簡稱Y17）。其系統(tǒng)進化樹如圖2所示。

2、菌株的抑菌試驗。

抑菌實驗：將菌株用MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)，采用牛津杯法，檢測對擬穴青蟹養(yǎng)殖的常見弧菌的抗菌效果。按照抑菌圈的大小評估其抑菌效果。如圖3所示，Y17對副溶血弧菌有抑菌效果。

糞腸球菌Y17對嗜水氣單胞菌、溶藻弧菌、金黃色葡萄球菌進行牛津杯抑菌實驗，實驗結果如圖4所示，Y17對嗜水氣單胞菌、溶藻弧菌、金黃色葡萄球菌均有抑菌活性。

藥敏性試驗：所選的抗生素包含阿莫西林、青霉素、四環(huán)素、奧格門汀、恩諾沙星、萬古霉素、頭孢唑啉、米洛環(huán)素、多粘菌素B、頭孢芐氨、新霉素、復方新諾明、氯霉素、頭孢他啶、丁胺卡那霉素、頭孢呋辛、麥迪霉素、氨芐西林、慶大霉素、紅霉素、苯唑西林。實驗發(fā)現(xiàn)Y17對復方新諾明、丁胺卡那霉素、新霉素、麥迪霉素、多粘菌素B、頭孢呋辛、慶大霉素、苯唑青霉素和對頭孢他啶耐受性高。

3、飼料中添加Y17飼養(yǎng)幼蟹實驗。

青蟹養(yǎng)殖選用25±1g的幼蟹240只，暫養(yǎng)一段時間后，將青蟹分為三類（一類為喂養(yǎng)添加糞腸球菌Y17 約1×10⁸ - 1×10⁹cfu/g的飼料，一類為添加糞腸球菌Y17和芽孢桿菌E8的飼料，另一類為無菌添加的飼料），每類設4組，每組20只幼蟹。分別飼喂飼料14天后，投喂添加了副溶血弧菌的飼料（濃度為1.99×10¹⁰ cfu/g；從牛田洋青蟹養(yǎng)殖區(qū)分離，本實驗室保存）3天。（添加糞腸球菌Y17和芽孢桿菌E8的飼料組簡稱Y17+ E8）

1)利用實時熒光PCR(real time PCR)方法檢測飼喂添加益生菌14天后受副溶血弧菌刺激的免疫應激情況，如圖5和圖6所示，發(fā)現(xiàn)Y17+ E8處理組免疫基因抗脂多糖因子(anti-lipopolysaccharide factor Precursor, ALF, FJ013272.1)、過氧化氫酶（catalase, CAT, FJ774660.1）的表達顯著高于對照組。

2)記錄3天內的死亡情況，結果如圖7所示，與對照組（正常飼料組）相比，Y17+E8飼料的青蟹組的3天內的累積存活率高于對照組（比對照組高11.11%）。

上述結果顯示，糞腸球菌Y17在擬穴青蟹的養(yǎng)殖中具有顯著的益生效應，對青蟹養(yǎng)殖常見的副溶血弧菌預防效果顯著，是一株值得開發(fā)的益生菌株。

以上所揭露的僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，當然不能以此來限定本發(fā)明之權利范圍，因此依本發(fā)明權利要求所作的等同變化，仍屬本發(fā)明所涵蓋的范圍。

<120> 一株糞腸球菌Y17及其篩選培養(yǎng)與應用

<130> 2016

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1651

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggaggtacga cgccagtgat tcgagctcgg tacccgggga tcctctagag attagagttt 60

gatcctggct caggacgaac gctggcggcg tgcctaatac atgcaagtcg aacgcttctt 120

tcctcccgag tgcttgcact caattggaaa gaggagtggc ggacgggtga gtaacacgtg 180

ggtaacctac ccatcagagg gggataacac ttggaaacag gtgctaatac cgcataacag 240

tttatgccgc atggcataag agtgaaaggc gctttcgggt gtcgctgatg gatggacccg 300

cggtgcatta gctagttggt gaggtaacgg ctcaccaagg ccacgatgca tagccgacct 360

gagagggtga tcggccacac tgggactgag acacggccca gactcctacg ggaggcagca 420

gtagggaatc ttcggcaatg gacgaaagtc tgaccgagca acgccgcgtg agtgaagaag 480

gttttcggat cgtaaaactc tgttgttaga gaagaacaag gacgttagta actgaacgtc 540

ccctgacggt atctaaccag aaagccacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac 600

gtaggtggca agcgttgtcc ggatttattg ggcgtaaagc gagcgcaggc ggtttcttaa 660

gtctgatgtg aaagcccccg gctcaaccgg ggagggtcat tggaaactgg gagacttgag 720

tgcagaagag gagagtggaa ttccatgtgt agcggtgaaa tgcgtagata tatggaggaa 780

caccagtggc gaaggcggct ctctggtctg taactgacgc tgaggctcga aagcgtgggg 840

agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgagtgc taagtgttgg 900

agggtttccg cccttcagtg ctgcagcaaa cgcattaagc actccgcctg gggagtacga 960

ccgcaaggtt gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt 1020

ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac atcctttgac cactctagag 1080

atagagcttt cccttcgggg acaaagtgac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt 1140

cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tattgttagt tgccatcatt 1200

tagttgggca ctctagcgag actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca 1260

aatcatcatg ccccttatga cctgggctac acacgtgcta caatgggaag tacaacgagt 1320

cgctagaccg cgaggtcatg caaatctctt aaagcttctc tcagttcgga ttgcaggctg 1380

caactcgcct gcatgaagcc ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcacgc cgcggtgaat 1440

acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccacga gagtttgtaa cacccgaagt 1500

cggtgaggta acctttttgg agccagccgc ctaaggtggg atagatgatt ggggtgaagt 1560

cgtaacaagg tagccgtatc ggaaggtgcg gctggatcac ctccttaatc gtcgacctgc 1620

aggcatgcaa gctggcgtaa tcatgtcacg c 1651

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<211> 20

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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