新的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)體系及胚胎干細(xì)胞建系方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及新的用于胚胎干細(xì)胞的新的培養(yǎng)體系W及 采用所述培養(yǎng)體系提高胚胎干細(xì)胞建系效率的方法。
【背景技術(shù)】
[000引1981年，英國(guó)科學(xué)家馬了 ?埃文斯首次建立了小鼠胚胎干細(xì)胞系，開(kāi)啟了胚胎干 細(xì)胞領(lǐng)域的研究工作巧vansandKaufman, 1981)。此后，NicholasM.Gou曲等發(fā)現(xiàn)一種被 稱之為白血病抑制因子（LeukemiaInhibito巧化ctors,LI巧的化合物，它能夠維持小鼠 胚胎干細(xì)胞保持未分化狀態(tài)，使得小鼠ESCs能夠在體外長(zhǎng)期穩(wěn)定地傳代培養(yǎng)（Williamset al.，1988)。隨著研究的愈發(fā)深入，科學(xué)家們對(duì)小鼠ESCs的多能性調(diào)控機(jī)制的研究也越來(lái) 越透徹（Niwaetal. ,2009)，該樣也推進(jìn)了小鼠培養(yǎng)體系的跟進(jìn)和發(fā)展。從最初的胎牛血 清培養(yǎng)基，到Invitrogen公司推出KoSR替代胎牛血清，再到應(yīng)用最為廣泛的"代胎體系"， 培養(yǎng)基的發(fā)展實(shí)現(xiàn)了從有血清到無(wú)血清、從成分不明確到確定化學(xué)成分的過(guò)程；而且通過(guò) 培養(yǎng)基的不斷更新和發(fā)展，具有不同遺傳背景的小鼠品系，如巧7BL/ 6、DBA2、CBA、N0D等， 均在體外成功地得到了ESC細(xì)胞系，該對(duì)于疾病模型的建立、轉(zhuǎn)基因及胚學(xué)研究都具有重 要意義。
[0003] 然而，具有不同遺傳背景的小鼠胚胎體外建立ESCs細(xì)胞系的能力是不一樣的 (Hannaetal. ,2009)。遠(yuǎn)交封閉群來(lái)源的ESCs體外建系能力是最容易的，如129Sv、CD-l 等，利用傳統(tǒng)的胎牛血清培養(yǎng)體系，就可W高效率建立ESCs細(xì)胞系，但是近交品系來(lái)源的 小鼠ESCs在此培養(yǎng)條件下建系則十分困難，如巧7BL/6、NOD等，其建系效率幾乎為零。 隨著KoSR血清替代品的出現(xiàn)，近交系小鼠ESCs的建系效率得到了極大的提高，但是其不同 細(xì)胞系的生長(zhǎng)狀態(tài)差異較大，不是特別穩(wěn)定。
[0004] Evans，M.J等人（'Establishmentincultureofpluripotentialcellsfrom mouseembiyos'，化1:腳6(1981)292(5819) ;154-6;Williams,R.L.等人（'Myeloid leukaemiainhibitoryfactormaintainsthedevelopmentalpotentialofembryonic stemcells'，化Uire(1988)336(6200) ;684-7)公開(kāi)了"FBS(15%)的培養(yǎng)體系，但是該體 系只限于特殊背景（如封閉群品系小鼠）的胚胎干細(xì)胞建系，而對(duì)于其他背景（如近交系 小鼠）的胚胎干細(xì)胞建系則無(wú)法實(shí)現(xiàn)，且在"FBS(15% )"體系內(nèi)，胚胎干細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)一 般，克隆集落相對(duì)較小。
[0005] Cheng,J等人（'ImprovedgenerationofC57BL/6Jmouseembryonic stemcellsinadefinedserum-freemedia'，Genesis(2004) 39(2) ;100-4)介紹了 "K〇SR(20% )的培養(yǎng)體系，從成分上看，"K〇SR(20% )"體系與"FBS(15% )"體系相比較， 只是用KoSR代替FBS而已，其余成分和濃度均一致。KoSR的使用實(shí)現(xiàn)了不同遺傳背景的胚 胎干細(xì)胞均能建系的目的，尤其是對(duì)近交系小鼠的胚胎干細(xì)胞建系起到了很大的推動(dòng)作用 (化engetal.，2004)。但是該培養(yǎng)體系培養(yǎng)出的胚胎干細(xì)胞的狀態(tài)不穩(wěn)定，該主要體現(xiàn)在 細(xì)胞集落表面不光滑、易出現(xiàn)"白點(diǎn)"（由死細(xì)胞產(chǎn)生的），部分細(xì)胞成扁平狀生長(zhǎng)（表明細(xì) 胞開(kāi)始分化）及細(xì)胞集落的立體感不強(qiáng)等。
[0006] Ying QL等人（The ground state of embryonic stem cell self-renewal'， 化1:腳6(2008)453(7194) ;519-23) ;Hanna，J.等提出 了胚胎干細(xì)胞"GroundState"的概念， 首次提出利用在N2B27基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加MEK抑制劑PD032590UGSK3目抑制劑CHIR99021 和LIF(又稱"2i體系"）的方法建立小鼠ESCs細(xì)胞系，取得了突破性的成果，該體系對(duì)于穩(wěn) 定ESCs多能性狀態(tài)是非常重要的（Theunissen et al. ,2011)。但是其對(duì)于近交品系ESCs 的建系效率并無(wú)顯著性提高，細(xì)胞增殖較慢，細(xì)胞集落在"2i"體系中一般都很小，而且對(duì)于 近交系背景的胚胎干細(xì)胞，其建系效率也不是很高。
[0007] 所W目前仍需研究出一種新的培養(yǎng)體系W達(dá)到支持不同遺傳背景的胚胎干細(xì)胞 建系和培養(yǎng)的目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的現(xiàn)狀，本發(fā)明提供了用于胚胎干細(xì)胞的新的培養(yǎng)體系、W 及采用本發(fā)明所述培養(yǎng)體系提高胚胎干細(xì)胞建系效率的方法。本發(fā)明新型培養(yǎng)體系及其方 法的意義在于既能保證得到穩(wěn)定的胚胎干細(xì)胞系，又能夠顯著性提高胚胎干細(xì)胞的建系效 率，從而更好地推動(dòng)胚胎干細(xì)胞在轉(zhuǎn)基因和疾病模型領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明所述培養(yǎng)體系包括；DMEMF12、N-2Supplement、B-27Supplement、目-琉基 己醇、谷氨醜胺、膜島素、牛血清白蛋白、雙抗（青霉素+鏈霉素）、P加325901、化ir99021、 白血病抑制因子（LIF)、KnockoutSerumR巧lacement化oSR)、P53inhibitor、Y-27632、 P38MAPKinhibitor和化rskolin。
[0010] 作為本發(fā)明實(shí)施方式之一，所述培養(yǎng)體系中W培養(yǎng)體系的總量為基礎(chǔ)計(jì)、DMEMF12 為90%~97%，優(yōu)選為92%~96%;N-2Supplement為l:50~l:200，優(yōu)選為l:80~ 1 : 120;b-27Supplement為1 : 25~1 : 100,優(yōu)選為1 : 25~1 : 75;目-琉基己醇 為0. 05mM~0. 2mM,優(yōu)選為0. 07mM~0. 15mM ;谷氨醜胺為ImM~5mM,優(yōu)選為2mM~4mM ; 膜島素為10 yg/血~50 yg/血，優(yōu)選為10 yg/血-30 yg/血；牛血清白蛋白為 0.001%~0.005%，優(yōu)選為0.002%~0.004%;雙抗（青霉素+鏈霉素）為1 : 50~ 1 : 100,優(yōu)選為1 : 70~1:100;P加325901為0. 8uM~2uM，優(yōu)選為0. 8uM~1.5UM; Chir99021為3uM~lOuM，優(yōu)選為3uM~6uM;白血病抑制因子（LI巧為1000U~ 10000U,優(yōu)選為1000U~6000U;Knockout SerumR巧lacement化oSR)為 3%~10%,優(yōu)選 為 3%~8% ;P53inhibitor為 2yM~50yM，優(yōu)選為 2yM~10yM;Y-27632為 5yM~ 10yM，優(yōu)選為 5yM~8yM;P38MAPK inhibitor為5uM~20yM優(yōu)選為yM5-8yM;和 ForskOlin為lOuM~20yM，優(yōu)選為lOuM~15uM。所述體系中涉及比例的及百分比的 組分，其均W質(zhì)量為計(jì)量單位。
[0011] 作為本發(fā)明實(shí)施方式之一，所述培養(yǎng)體系中，DMEMF12包括但不限于例如由GIBC0 公司提供；N-2Supplement包括但不限于例如由GIBC0公司提；B-27Supplement包括但 不限于例如由GIBC0公司提供；目-琉基己醇包括但不限于例如由Sigma公司提供；谷氨 醜胺包括但不限于例如由GIBC0公司提供；膜島素包括但不限于例如由Roche Applied Sciences公司提供；牛血清白蛋白包括但不限于例如由Sigma公司提供；雙抗（青霉素+ 鏈霉素）包括但不限于例如由GIBC0公司提供；Pd0325901包括但不限于例如由Stemgent 公司提供；化ir99021包括但不限于例如由Stemgent公司提供；白血病抑制因子（LI巧包 括但不限于例如由Millipore公司提供；KnockoutSerumReplacement化oSR)包括但不 限于例如由GIBC0公司提供；P53inhibitor包括但不限于例如由化化iochem公司提供； Y-27632包括但不限于例如由化化iochem公司提供；P38MAPKinhibitor包括但不限于例如 由化化iochem公司提供；Forskolin包括但不限于例如由Stemgent公司提供。
[0012] 作為本發(fā)明進(jìn)一步實(shí)施方式之一，所述培養(yǎng)體系W總?cè)芤旱牧繛榛A(chǔ)計(jì)為：
【主權(quán)項(xiàng)】
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