銀鯽魚背鰭細(xì)胞系的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生命科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，是銀側(cè)魚背罐細(xì)胞系。
【背景技術(shù)】
[000引 銀側(cè)魚（C.aura1:usgibelio)隸屬于纏型目任ercoiformes)、纏科（Sparidae)、 側(cè)屬佑3拘331113)，。3腳3化8的亞種。分布于我國的側(cè)魚包括黑側(cè)、側(cè)和銀側(cè)，其中側(cè)的染 色體數(shù)為100,屬二倍體，銀側(cè)染色體數(shù)為150 +，屬=倍體。銀側(cè)魚個體具有生長快，抗病 性強(qiáng)等良好的經(jīng)濟(jì)性狀，是我國主要的飼養(yǎng)的淡水養(yǎng)殖品種。
[0003] 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是生命科學(xué)領(lǐng)域，細(xì)胞工程、基因工程和生物醫(yī)學(xué)工程主要的研究 手段。魚類細(xì)胞系的構(gòu)建為魚類病毒性疾病的病原學(xué)研究和病毒的疫苗研究提供了基礎(chǔ)的 生物學(xué)材料具有重要的研究價值。通過細(xì)胞株來鑒定和分離敏感病毒株是世界動物衛(wèi)生組 織OfficeInternationalDesEpizooties(OI巧推薦的最有效方法，該些細(xì)胞系為魚類病 毒學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞學(xué)等方面的研究提供了良好的實驗材料。
[0004] Wolf和如imby在20世紀(jì)60年代建立了世界上第一株魚類細(xì)胞系，即虹轉(zhuǎn)魚生 殖腺細(xì)胞系RTG-2。目前，已經(jīng)報道的魚類細(xì)胞系有300余種（LakraWS，Swaminathan TR,JoyKP.Development,characterization,conservationandstorageoffish celllines:areview[J].FishPhysiologyandBiochemistry, 2011, 37(1):1-20)。 其中已經(jīng)報道的側(cè)魚的細(xì)胞株主要有異育銀側(cè)細(xì)胞系（Isogeneicginbunacrucian carp,LakeSuwa)(HasegawaS,NakayasuC,OkamotoN,etal.Fincelllinefrom isogeneicginbunacruciancarp[J].InVitroCellular&DevelopmentalBiology-Anim al，1997, 33 (4) : 232-233.)，錦纏罐條細(xì)胞系（肖藝，曾令兵，徐進(jìn)，等.錦纏罐條組織細(xì)胞 系的建立及其生物學(xué)特性[J].中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報，2012, 34巧）：767-774.)，側(cè)魚異倍體 細(xì)胞系（陳敏容，陳宏溪，易詠蘭.側(cè)魚異倍體細(xì)胞系的建立及生物學(xué)特性[J]. 1985.)， 側(cè)魚腮蓋膜細(xì)胞系（肥C-87)(李亞男，張義，毛樹堅.兩株魚類細(xì)胞系-草魚尾罐組 織細(xì)胞系（HGC-87)及側(cè)魚腮蓋膜細(xì)胞系（HCC-87)的建立[J].毛樹堅.生命科學(xué)論文 集，1992:112-119.)。目前尚無關(guān)于建立銀側(cè)魚背罐細(xì)胞系的相關(guān)報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種銀側(cè)魚背罐細(xì)胞系。
[0006] 本發(fā)明的再一的目的是，提供一種銀側(cè)魚背罐細(xì)胞系的構(gòu)建方法。
[0007] 本發(fā)明的另一的目的是，提供一種銀側(cè)魚背罐細(xì)胞系的應(yīng)用。
[000引為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：一種銀側(cè)魚背罐細(xì)胞系，所述的銀側(cè) 魚背罐細(xì)胞系的保藏編號為CCTCCN0:C201525。
[0009] 所述的銀側(cè)魚背罐細(xì)胞系是銀側(cè)魚的背罐經(jīng)過原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)得到的。
[0010] 原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)所用的細(xì)胞培養(yǎng)液為M199培養(yǎng)基制得。
[0011] 原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)所用的細(xì)胞培養(yǎng)液通過如下方法制得：取M199培養(yǎng)基，加入 占培養(yǎng)基總體積10-20%的胎牛血清，終濃度為20ng/ml的堿性成纖維生長因子，終濃度為Ing/ml的表皮生長因子。
[0012] 原代培養(yǎng)的方法為；剪下銀側(cè)魚的背罐，然后用75%酒精消毒，再用青霉素、鏈霉 素除去銀側(cè)魚背罐上的黏液，接著用含兩性霉素B的D-PBS沖洗，沖洗后，在無菌條件下用 剪刀將背罐剪成小塊后浸泡在膜蛋白酶和邸TA中；接著將剪碎的銀側(cè)魚的背罐轉(zhuǎn)移到細(xì) 胞培養(yǎng)瓶中，且保持底部溫度為25°C，然后加入含有10%胎牛的血清、青霉素、鏈霉素、兩 性霉素B、堿性成纖維生長因子和表皮生長因子的M199培養(yǎng)基。
[0013] 傳代培養(yǎng)的方法為；當(dāng)原代培養(yǎng)的銀側(cè)魚的背罐細(xì)胞單層鋪滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶后，用 吸管除去舊的培養(yǎng)液，用PBS清洗，加入膜酶消化細(xì)胞，待顯微鏡鏡下觀察細(xì)胞變圓后，加 入新鮮的完全培養(yǎng)液，反復(fù)吹打，懸起細(xì)胞，W1:2進(jìn)行傳代，放入27°C培養(yǎng)箱中進(jìn)行傳代 培養(yǎng)。
[0014] 為實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是；一種銀側(cè)魚背罐細(xì)胞系的構(gòu) 建方法，所述的構(gòu)建方法包括W下步驟：原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)。
[0015] 所述的構(gòu)建方法包括W下步驟：
[0016] a)原代培養(yǎng)
[0017] 剪下銀側(cè)魚的背罐，然后用75%酒精消毒，再用青霉素、鏈霉素除去銀側(cè)魚背罐上 的黏液，接著用含兩性霉素B的D-PBS沖洗，沖洗后，在無菌條件下用剪刀將背罐剪成小塊 后浸泡在膜蛋白酶和邸TA中；接著將剪碎的銀側(cè)魚的背罐轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，且保持底 部溫度為25°C，然后加入含有10%胎牛的血清、青霉素、鏈霉素、兩性霉素B、堿性成纖維生 長因子和表皮生長因子的M199培養(yǎng)基；
[001引b)傳代培養(yǎng)
[0019] 當(dāng)原代培養(yǎng)的銀側(cè)魚的背罐細(xì)胞單層鋪滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶后，用吸管除去舊的培養(yǎng) 液，用PBS清洗，加入膜酶消化細(xì)胞，待顯微鏡鏡下觀察細(xì)胞變圓后，加入新鮮的完全培養(yǎng) 液，反復(fù)吹打，懸起細(xì)胞，W1:2進(jìn)行傳代，放入27°C培養(yǎng)箱中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
[0020] 為實現(xiàn)上述第=個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是；所述的銀側(cè)魚背罐細(xì)胞系在 細(xì)胞工程、基因工程或生物醫(yī)學(xué)工程中的應(yīng)用。
[0021] 本發(fā)明優(yōu)點在于：
[0022] 1、本發(fā)明建立的銀側(cè)魚背罐細(xì)胞系可W連續(xù)傳代，能提供大量的銀側(cè)魚背罐細(xì)胞 系。
[0023] 2、該細(xì)胞系可W直接應(yīng)用于銀側(cè)魚免疫相關(guān)功能基因的研究，對于銀側(cè)魚的病毒 感染實驗可W應(yīng)用細(xì)胞系，節(jié)約了大量的人力，物力且效果較好。
[0024] 3、銀側(cè)魚背罐細(xì)胞系可W反復(fù)凍融，可應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、病毒學(xué)、毒理學(xué)、分子 生物學(xué)、遺傳學(xué)和免疫學(xué)等重要研究。
【附圖說明】
[0025] 附圖1是顯微鏡下的銀側(cè)魚背罐組織塊附近遷移出的細(xì)胞（3天左右）。
[0026] 附圖2是顯微鏡下穩(wěn)定傳代后的銀側(cè)魚背罐細(xì)胞系。
[0027] 附圖3是細(xì)胞感染側(cè)魚瘤疹病毒II型（切HV-2)情況.（A):正常細(xì)胞，scale bar. =100 y m.炬和C)感染側(cè)魚瘤疹病毒II型（切HV-2)，感染后6天，scale bar.=lOOand 50ym.箭頭所指為病變細(xì)胞.值）感染側(cè)魚瘤疹病毒II型（切HV-2)，感染后8天，scale bar. = 100.
[002引附圖4是側(cè)魚瘤疹病毒II型（切HV-2)感染銀側(cè)魚背罐細(xì)胞系上清中病毒的復(fù)制 曲線。
【具體實施方式】
[0029] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明提供的【具體實施方式】作詳細(xì)說明。
[0030] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種可W穩(wěn)定傳代的建立銀側(cè)魚背罐細(xì)胞系 (SCC-DF cell line, Silver crucian ca巧dorsal fin cell line),該細(xì)胞系的構(gòu)建為研 究銀側(cè)魚的免疫學(xué)和篩選未知魚類病毒提供了良好的生物材料。
[0031] 實施例1銀側(cè)魚背罐細(xì)胞系的構(gòu)建方法 [003引1、制備細(xì)胞培養(yǎng)液
[0033] 取GIBC0公司M199培養(yǎng)基，加入占培養(yǎng)基總體積10-20% (W下所述百分比若 無特別說明，均為體積百分比）的胎牛血清，終濃度為20ng/ml的堿性成纖維生長因子 化FGF)，終濃度為Ing/ml的表皮生長因子巧GF)，4°C存放，備用。
[0034] 2、原代培養(yǎng)
[003引剪下銀側(cè)魚的背罐，然后用75%酒精消毒，再用1000IUmL-i青霉素，lOOOug血-1 鏈霉素除去銀側(cè)魚背罐上的黏液，接著用含2.加gmL-i的兩性霉素B的D-PBS沖洗3次。沖 洗后，在無菌條件下用剪刀將背罐剪成約1mm3的小塊后浸泡在0. 25%膜蛋白酶和0. 02% 邸TA中。
[0036] 接著將剪碎的銀側(cè)魚的背罐轉(zhuǎn)移到底部為25cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，且保持底部溫 度為25°C。15小時后，加入2血含有10%胎牛的血清