禽致病性大腸桿菌滅活疫苗及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明設(shè)及一種禽致病性大腸桿菌滅活疫 苗及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[000引 禽致病性大腸桿菌（AvianpathogenicEscherichiacoli，APEC)可導(dǎo)致雞、火雞 及其他禽類的腸道外疾病，如屯、包炎、肝周炎、氣囊炎、腦膜炎等，甚至引起敗血癥而急性死 亡。APEC不僅危害禽體健康，同時影響了產(chǎn)蛋量和肉用禽的上市時間，并且增加了飼養(yǎng)成 本，對養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。
[0003] 隨著我國養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展，禽大腸桿菌病已成為危害養(yǎng)禽業(yè)最嚴重的細菌性傳染病 之一。目前在世界范圍，禽大腸桿菌病每年導(dǎo)致家禽業(yè)高達數(shù)億美元的經(jīng)濟損失。APEC復(fù) 雜的血清型及廣泛的耐藥性，一直制約該病的防控。對禽大腸桿菌病的防治除加強管理外， 主要采用抗生素等藥物進行防治。由于抗生素的大量使用，導(dǎo)致耐藥性的出現(xiàn)及禽產(chǎn)品出 現(xiàn)藥物殘留，該不僅關(guān)系到養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展，更重要的是關(guān)系到食品安全和對人類生存 環(huán)境的影響。因此，研制禽致病性大腸桿菌疫苗，降低因該病造成的養(yǎng)殖風(fēng)險，減少抗生素 的使用，對于該病的防控和食品安全具有重要的公共衛(wèi)生意義和良好的社會經(jīng)濟效益。
[0004] 流行病學(xué)調(diào)查顯示國內(nèi)外APEC優(yōu)勢血清型中，078血清型占64. 29 %，為主要血清 型。據(jù)Gross、DebandHarry等研究發(fā)現(xiàn)APEC血清078型所制備的疫苗擁有很好的免疫 保護效果。為了更好的防控禽大腸桿菌病的發(fā)生，為我國家禽業(yè)健康發(fā)展提供更有效的保 障，本發(fā)明對APEC078型血清型滅活苗進行了研究。迄今國內(nèi)尚無商品化的078血清型禽 致病性大腸桿菌滅活疫苗。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決上述問題，本發(fā)明提供一株禽致病性大腸桿菌菌株，為大腸埃希氏菌 (Escherichiacoli)。
[0006] 本發(fā)明再一目的在于提供一種禽致病性大腸桿菌滅活疫苗，可用于預(yù)防078血清 型禽致病性大腸桿菌感染。
[0007] 本發(fā)明還一目的在于提供一種禽致病性大腸桿菌滅活疫苗的制備方法。
[000引本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0009] -株禽致病性大腸桿菌菌株，為大腸埃希氏菌，命名為大腸埃希氏菌Escherichia coli，已于2015年3月11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、（地 址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號），其保藏號為CGMCCNo. 10602。
[0010] 本發(fā)明所述禽致病性大腸桿菌菌株在制備疫苗中的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明提供一種包含保藏號為CGMCCNo. 10602的禽致病性大腸桿菌菌株的禽致 病性大腸桿菌滅活疫苗。
[0012] 本發(fā)明所述禽致病性大腸桿菌滅活疫苗，滅活的大腸埃希氏菌菌株的抗原含量大 于等于1Xl〇9CFU/mL。
[0013] 其中，所述疫苗還包含佐劑，所述佐劑為MontanideISA70VG佐劑或Montanide ISA71VG佐劑。
[0014] 所述禽致病性大腸桿菌滅活疫苗中大腸埃希氏菌菌株與佐劑的混合重量比例為 3 ;7。
[0015] 本發(fā)明的另一實施方面，本發(fā)明所述禽致病性大腸桿菌滅活疫苗的制備方法，包 括如下步驟：
[0016] 1)制備禽致病性大腸桿菌菌株滅活抗原
[0017] 取所述禽致病性大腸桿菌菌株APCE94接種于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并分別進行一級 和二級種子繁殖；然后轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，并進行滅活處理；
[001引。配制疫苗
[0019] 將滅活處理的菌液調(diào)至大于等于3. 33X109CFU/mL;取滅活菌液與佐劑按比例進 行混勻，攬拌并乳化處理，得所述禽致病性大腸桿菌滅活疫苗。
[0020] 其中，步驟1)中所述轉(zhuǎn)接培養(yǎng)的條件為菌液按1:100轉(zhuǎn)接，37°C震蕩培養(yǎng)lOh;所 述滅活處理采用所述菌液加入體積比0. 4%福爾馬林，37°C200巧m振蕩2化。
[0021] 步驟2)中，混勻后，進行高速攬拌并乳化處理1分鐘/次X2次。
[0022] 具體地說，本發(fā)明所述禽致病性大腸桿菌滅活疫苗的制備方法，包括如下步驟：
[0023] 1)所述禽致病性大腸桿菌滅活疫苗組成菌株滅活抗原的制備，取078血清型禽致 病性大腸桿菌制苗用菌株APCE94接種到LB中復(fù)蘇后劃線接種于LB平板上，置培養(yǎng)箱中 37°C培養(yǎng)過夜，挑選菌落邊緣整齊，表面有光澤、濕潤、光滑特征的單菌落分別進行一級和 二級種子繁殖。取新鮮菌液按1:100轉(zhuǎn)接，37°C震蕩培養(yǎng)lOh，經(jīng)純度檢驗和細菌計數(shù)后加 入體積比0. 4%福爾馬林，37°C20化pm振蕩2化進行滅活處理；分別取各滅活菌液少量接 種于LB平板37°C培養(yǎng)2化，進行無菌檢驗，應(yīng)無細菌生長。
[0024] 2)所述禽致病性大腸桿菌滅活疫苗配制與疫苗乳化，根據(jù)細菌計數(shù)結(jié)果，將 APCE94滅活菌液調(diào)至大于等于3. 33X109CFU/mL;取滅活菌液3份，加入7份MontanideISA 70VG佐劑或MontanideISA71VG佐劑中混勻，高速攬拌乳化1分鐘/次X2次，即為禽 致病性大腸桿菌滅活疫苗。
[0025] 本發(fā)明的另一方面，禽致病性大腸桿菌滅活疫苗于LB平板或LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，應(yīng) 無細菌生長，于室溫保存6個月或4°C保存1年應(yīng)無分層現(xiàn)象發(fā)生，3倍劑量疫苗接種10日 齡易感鴨安全，易感鴨分別用免疫劑量（0. 5mL)于5日齡和15日齡頸部皮下接種后，應(yīng)產(chǎn) 生1:400W上針對APCE94的血清抗體，對078血清型禽致病性大腸桿菌APCE93、APCE94、 APCE11的攻毒保護率為90%W上。
[0026] 本發(fā)明的有益效果為；
[0027] 本發(fā)明對篩選獲得的制苗用078血清型菌株APCE94(保藏號為CGMCCNo. 10602 的大腸埃希氏菌巧scherichiacoli)進行培養(yǎng)條件的優(yōu)化、最佳免疫劑量的確定、疫苗佐 劑的篩選、疫苗制備W及檢驗規(guī)程的制定。通過對上述條件進行優(yōu)化、篩選，最終獲得禽致 病性大腸桿菌滅活疫苗。
[002引本發(fā)明所述禽致病性大腸桿菌滅活疫苗可用于免疫預(yù)防078血清型禽致病性大 腸桿菌感染，對078血清型禽致病性大腸桿菌感染的免疫保護效果為90%W上；可W有效 地預(yù)防國內(nèi)養(yǎng)鴨地區(qū)流行的078血清型禽致病性大腸桿菌的感染。
[0029]