. 一種胚胎干細胞培養(yǎng)體系，其特征在于，所述培養(yǎng)體系包括：DMEMF12、 N-2Supplement、B-27Supplement、0 -巰基乙醇、谷氨酰胺、胰島素、牛血清白蛋白、雙 抗（青霉素 + 鏈霉素）、Pd〇325901、Chir99021、白血病抑制因子（LIF)、KnockoutSerum Replacement(KoSR)、P53inhibitor、Y-27632、P38MAPKinhibitor和Forskolin。
2. 根據(jù)權利要求1所述的培養(yǎng)體系，其特征在于，所述培養(yǎng)體系以總溶液為計算基礎、 DMEMF12*90%~97%;N-2Supplement*l:50~l:200;B-27Supplement*l:25~ 1 : 100 ;P-巰基乙醇為0? 05~0? 2mM;谷氨酰胺為ImM~5mM;胰島素為10yg/mL~ 50iig/mL;牛血清白蛋白為0.001%~0.005%;雙抗（青霉素+鏈霉素）為1 : 50~ 1 : 100;Pd0325901 為 0.8iiM~2iiM;Chir99021 為 3iiM~10iiM;白血病抑制因子為 1000U~10000U;KnockoutSerumReplacement為 3 % ~10 % ;P53inhibitor為 2uM~ 50iiM;Y-27632 為 5iiM~10iiM;P38MAPKinhibitor為 5iiM~20iiM;和Forskolin為 10UM~20uM〇
3. 根據(jù)權利要求2所述的培養(yǎng)體系，其特征在于，所述培養(yǎng)體系為：DMEMF12為92%~ 96% ;N-2Supplement為 1 : 80 ~1 : 120 ;B-27Supplement為 1 : 25 ~1 : 75 ; 3 -巰 基乙醇為0. 07mM~0. 15mM;谷氨酰胺為2mM~4mM;胰島素為10yg/mL-30yg/mL;牛血 清白蛋白為0.002%~0.004%;雙抗（青霉素+鏈霉素）為1 : 70~1 : 100;Pd0325901 為 0.8iiM~1.5iiM;Chir99021 為 3iiM~6iiM;白血病抑制因子（LIF)為 1000U~6000U; KnockoutSerumReplacement為 3%~8% ;P53inhibitor為 2uM~10uM; Y-27632 為 5iiM~8iiM;P38MAPKinhibitor為 5iiM-SiiM;和Forskolin為 10iiM~ 15uM。
4. 根據(jù)權利要求3所述的培養(yǎng)體系，其特征在于，所述培養(yǎng)體系為：

5. -種胚胎干細胞系的建系方法，其特征在于，所述方法包括： 1) 取囊胚，接種在鋪有飼養(yǎng)層的孔板內，放置在37°C、5%C02的培養(yǎng)箱內，用權利要求 1-4任一所述的培養(yǎng)體系進行孵育培養(yǎng)； 2) 培養(yǎng)至囊胚貼壁后形成生長暈（outgrowths),用口吸管調取生長暈（outgrowths), 放置在事先37°C預熱的0. 25%胰酶滴中，37°C消化；然后用口吸管將生長暈（outgrowths) 吸出，并直接吹入到含有權利要求1-4任一所述培養(yǎng)體系的新孔內并吹散生長暈 (outgrowths)，放置于37°C、5%C02的培養(yǎng)箱內繼續(xù)培養(yǎng)，記為P1代； 3) 培養(yǎng)至克隆集落長大后，棄上清液，用0. 25 %的胰酶消化整個孔；然后用含10 %的 血清的培養(yǎng)液終止胰酶消化，可選擇地并反復吹吸；之后將細胞和液體統(tǒng)一轉移到離心管 內，離心； 4) 離心完畢后，棄上清，用培養(yǎng)液重懸沉淀，并按照合適的比例將細胞接種在新的培養(yǎng) 皿內，記為P2代； 5) 重復3)和4)步驟，直至形成穩(wěn)定的胚胎干細胞系。
6. 根據(jù)權利要求5所述的建系方法，其特征在于，所述方法包括： 1) 取囊胚，接種在鋪有飼養(yǎng)層的四孔板內，每孔5~6枚胚胎， 放置在37°C、5%C02的培養(yǎng)箱內，用權利要求1-4任一所述的培養(yǎng)體系孵育培養(yǎng)； 2) 培養(yǎng)6~7天后，囊胚貼壁后形成生長暈（outgrowths)，用口吸管調取生長暈 (outgrowths)，放置在事先37°C預熱的0. 25 %胰酶滴中，37°C消化5分鐘；用口吸管將生長 暈（outgrowths)吸出，并直接吹入到含有權利要求1-4任一所述的培養(yǎng)系的新孔內并吹散 生長暈（outgrowths)，放置于37°C5%C02的培養(yǎng)箱內繼續(xù)培養(yǎng)，記為P1代； 3) 培養(yǎng)3~4天后，待克隆集落長大后，棄上清，然后直接用0. 25%胰酶消化整個孔， 消化2分鐘左右；然后用含有10%血-清的培養(yǎng)液終止胰酶消化，并反復吹吸3~4次；之 后，將細胞和液體統(tǒng)一轉移到15毫升離心管內，lOOOrpm離心5分鐘； 4) 離心完畢后，棄上清，用培養(yǎng)液重懸沉淀，并按照合適的比例將細胞接種在新的培養(yǎng) 皿內，記為P2代； 5) 重復3)和4)步驟，直至形成穩(wěn)定的胚胎干細胞系。
7. 根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于，所述胚胎包括但不限于小鼠胚胎細胞、大 鼠胚胎細胞或兔子胚胎細胞。
8. 根據(jù)權利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法包括： 1) 取E3. 5天的小鼠囊胚，接種在鋪有飼養(yǎng)層的四孔板內，每孔5~6枚胚胎， 放置在37°C5%C02的培養(yǎng)箱內，用相應地的培養(yǎng)體系孵育培養(yǎng)； 2) 培養(yǎng)6~7天后，囊胚貼壁后形生長暈（outgrowths)，用口吸管調取生長暈 (outgrowths)，放置在事先37°C預熱的0. 25 %胰酶滴中，37°C消化5分鐘；用口吸管將生長 暈（outgrowths)吸出，并直接吹入到含有培養(yǎng)基的新孔內并吹散生長暈（outgrowths),放 置于37°C5%C02的培養(yǎng)箱內繼續(xù)培養(yǎng)，記為P1代； 3) 培養(yǎng)3~4天后，待克隆集落長大后，棄上清，然后直接用0. 25%胰酶消化整個孔， 消化2分鐘左右；然后用含有10%血清的培養(yǎng)液終止胰酶消化，并反復吹吸3~4次；之后， 將細胞和液體統(tǒng)一轉移到15毫升離心管內，lOOOrpm離心5分鐘； 4) 離心完畢后，棄上清，用培養(yǎng)液重懸沉淀，并按照合適的比例將細胞接種在新的培養(yǎng) 皿內，記為P2 ; 5) 重復3)和4)步驟，直至形成穩(wěn)定的胚胎干細胞系。
9. 一種擬胚體體外分化的方法，其特征在于，所述方法包括： a) 取權利要求5-8任一方法所得的長滿的小鼠胚胎干細胞，0.25%胰酶消化后，將細 胞懸浮于鋪有〇. 2 %明膠的培養(yǎng)皿上培養(yǎng)30分鐘，以便去掉飼養(yǎng)細胞（feeder); b) 收集懸浮細胞，用分化培養(yǎng)液懸浮培養(yǎng)小鼠胚胎干細胞，使其形成聚集體 (aggregates)，記為第 0 天（dayO); c) 分化培養(yǎng)2~3天之后，顯微鏡下可觀察到已形成球狀體的擬胚體（EB); d) 分化培養(yǎng)6天之后，收集擬胚體（EB)，并將擬胚體（EB)貼附于培養(yǎng)上生長，此時培 養(yǎng)液換為N-2培養(yǎng)液； e) 分化培養(yǎng)10天之后，從擬胚體（EB) "爬"出的細胞中可以看到神經細胞、內皮樣細 胞、及成纖維等各種類型的細胞。
10. 根據(jù)權利要求9所述的方法，其特征在于，所述步驟b)中的分化培養(yǎng)液包括： DMEM/F12(GIBC0)，10%Knock-out血清（GIBC0)和IX雙抗溶液；所述步驟d)中的N2 培養(yǎng)液包括DMEM/F12 (GIBC0)，1XN2 (GIBC0)，2mM谷氨酰胺和IX雙抗溶液。
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物技術領域、具體涉及新的胚胎干細胞培養(yǎng)體系以及采用本發(fā)明所述培養(yǎng)體系提高胚胎干細胞建系效率的方法。本發(fā)明所述培養(yǎng)體系包括：DMEMF12、N-2supplement、B-27supplement、β-巰基乙醇、谷氨酰胺、胰島素、牛血清白蛋白、雙抗(青霉素+鏈霉素)、Pd0325901、Chir99021、白血病抑制因子(LIF)、Knockout Serum Replacement(KoSR)、P53inhibitor、Y-27632、P38MAPK inhibitor和Forskolin。本發(fā)明新型的培養(yǎng)體系及其方法既能保證得到穩(wěn)定的胚胎干細胞系，又能夠顯著性提高胚胎干細胞的建系效率，同時還能維持胚胎干細胞的多能性，使其始終處于優(yōu)良的生長狀態(tài)，從而更好地推動胚胎干細胞在轉基因和疾病模型領域的廣泛應用。
【IPC分類】C12N5-0735, C12R1-91, C12N5-073
【公開號】CN104774803
【申請?zhí)枴緾N201410010363
【發(fā)明人】董明珠, 李英驥, 閆勵
【申請人】北京愛思益普生物科技股份有限公司
【公開日】2015年7月15日
【申請日】2014年1月10日