本發(fā)明涉及遺傳工程領(lǐng)域，尤其涉及一種高產(chǎn)乙酰氨基葡萄糖的重組枯草芽孢桿菌及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

乙酰氨基葡萄糖是生物體內(nèi)的一種單糖，廣泛存在于細(xì)菌、酵母、霉菌、植物以及動(dòng)物體內(nèi)。在人體中，乙酰氨基葡萄糖是糖胺聚糖二糖單元的合成前體，其對修復(fù)和維持軟骨及關(guān)節(jié)組織功能具有重要作用。因此，乙酰氨基葡萄糖被廣泛添加在藥物和營養(yǎng)膳食中來治療和修復(fù)關(guān)節(jié)損傷。此外，乙酰氨基葡萄糖在化妝品和制藥領(lǐng)域也具有諸多應(yīng)用。目前，乙酰氨基葡萄糖主要采用酸解蝦殼或蟹殼中甲殼素生產(chǎn)，然而，此方法產(chǎn)生的廢液對環(huán)境污染較為嚴(yán)重，而且得到的產(chǎn)品易引起過敏反應(yīng)，不適宜海鮮過敏的人群服用。

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是一種被廣泛用作食品酶制劑及重要營養(yǎng)化學(xué)品的生產(chǎn)宿主，其產(chǎn)品被FDA認(rèn)證為GRAS(Generally Regarded as Safe)安全級別。因此，運(yùn)用代謝工程手段構(gòu)建重組枯草芽孢桿菌是生產(chǎn)食品安全級乙酰氨基葡萄糖的有效途徑。啟動(dòng)子作為基因工程的工具，在菌株的代謝工程改造中具有重要作用。研究表明，關(guān)鍵基因的過量表達(dá)有時(shí)會(huì)給菌體本身帶來壓力，而基因的適度表達(dá)往往會(huì)取得更好的效果。葡萄糖激酶編碼基因glck和磷酸葡糖異構(gòu)酶編碼基因pgi是枯草芽孢桿菌中乙酰氨基葡萄糖合成途徑的關(guān)鍵基因，在枯草芽孢桿菌基因組上實(shí)現(xiàn)乙酰氨基葡萄糖合成途徑關(guān)鍵基因啟動(dòng)子的精細(xì)調(diào)控對進(jìn)一步提高乙酰氨基葡萄糖合成效率與細(xì)胞生長性能具有現(xiàn)實(shí)意義。

鑒于上述原因，本發(fā)明人人積極加以創(chuàng)新研究，以期創(chuàng)建一種高產(chǎn)乙酰氨基葡萄糖的重組枯草芽孢桿菌，使其具有產(chǎn)業(yè)上的利用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種高產(chǎn)乙酰氨基葡萄糖的重組枯草芽孢桿菌及其構(gòu)建方法。本發(fā)明的構(gòu)建方法簡單，便于操作，所構(gòu)建的重組枯草芽孢桿菌通過控制glck和pgi基因的適度表達(dá)能夠高產(chǎn)乙酰氨基葡萄糖，在代謝工程上具有良好的應(yīng)用前景。

在一方面，本發(fā)明提供了一種高產(chǎn)乙酰氨基葡萄糖的重組枯草芽孢桿菌，其由木糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子P_xylA調(diào)控枯草芽孢桿菌中的葡萄糖激酶編碼基因glck表達(dá)和磷酸葡糖異構(gòu)酶編碼基因pgi表達(dá)得到。

在一具體實(shí)施例中，本發(fā)明的高產(chǎn)乙酰氨基葡萄糖的重組枯草芽孢桿菌由木糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子P_xylA替代枯草芽孢桿菌中的葡萄糖激酶編碼基因glck啟動(dòng)子序列和磷酸葡糖異構(gòu)酶編碼基因pgi啟動(dòng)子序列而得到。

進(jìn)一步的，葡萄糖激酶編碼基因glck如NCBI-Gene ID:938206所示。

進(jìn)一步地，磷酸葡糖異構(gòu)酶編碼基因pgi如NCBI-Gene ID:937165所示。

在另一具體實(shí)施例中，木糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子P_xylA調(diào)控glck和pgi表達(dá)所使用的枯草芽孢桿菌為BSGN6，BSGN6是以B.subtilis 168ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔldhΔpta::lox72為宿主，分別以啟動(dòng)子P_xylA、P₄₃控制glmS、GNA1的重組表達(dá)而得到。枯草芽孢桿菌BSGN6的構(gòu)建方法可參閱文獻(xiàn)“Modular pathway engineering of Bacillus subtilis for improved N-acetylglucosamine production(Metabolic Engineering，23(2014)p42-52)”，在此不作進(jìn)一步描述。

在另一方面，本發(fā)明還公開了一種高產(chǎn)乙酰氨基葡萄糖的重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

(1)構(gòu)建包括木糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子P_xylA的葡萄糖激酶編碼基因glck啟動(dòng)子替換框，通過同源重組將glck啟動(dòng)子替換框中的木糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子P_xylA替換枯草芽孢桿菌中的葡萄糖激酶編碼基因glck啟動(dòng)子序列；及

(2)構(gòu)建包括木糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子P_xylA的磷酸葡糖異構(gòu)酶編碼基因pgi啟動(dòng)子替換框，通過同源重組將pgi啟動(dòng)子替換框中的木糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子P_xylA替代步驟(1)中得到的枯草芽孢桿菌中的磷酸葡糖異構(gòu)酶編碼基因pgi啟動(dòng)子序列，得到高產(chǎn)乙酰氨基葡萄糖的重組枯草芽孢桿菌。

在一具體實(shí)施例中，在步驟(1)中，葡萄糖激酶編碼基因glck啟動(dòng)子替換框還包括博來霉素抗性基因zeo，通過同源重組將glck啟動(dòng)子替換框中的博來霉素抗性基因zeo和木糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子P_xylA替換枯草芽孢桿菌中的葡萄糖激酶編碼基因glck啟動(dòng)子序列，使葡萄糖激酶編碼基因glck在木糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子P_xylA下調(diào)控表達(dá)；并向枯草芽孢桿菌中轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pDG148，促使其表達(dá)環(huán)化重組酶，以消除博來霉素抗性基因zeo。

在另一具體實(shí)施例中，在步驟(2)中，磷酸葡糖異構(gòu)酶編碼基因pgi啟動(dòng)子替換框還包括博來霉素抗性基因zeo，通過同源重組將pgi啟動(dòng)子替換框中的博來霉素抗性基因zeo和木糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子P_xylA替代步驟(1)中得到的枯草芽孢桿菌中的磷酸葡糖異構(gòu)酶編碼基因pgi啟動(dòng)子序列，使葡萄糖激酶編碼基因glck和磷酸葡糖異構(gòu)酶編碼基因pgi均在木糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子P_xylA下調(diào)控表達(dá)；并向枯草芽孢桿菌中轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pDG148，促使其表達(dá)環(huán)化重組酶，以消除所述博來霉素抗性基因zeo，得到高產(chǎn)乙酰氨基葡萄糖的重組枯草芽孢桿菌。

在又一具體實(shí)施例中，上述構(gòu)建方法中所使用的枯草芽孢桿菌為BSGN6，BSGN6是以B.subtilis 168ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔldhΔpta::lox72為宿主，分別以啟動(dòng)子P_xylA、P₄₃控制glmS、GNA1的重組表達(dá)而得到?？莶菅挎邨U菌BSGN6的構(gòu)建方法可參閱文獻(xiàn)“Modular pathway engineering of Bacillus subtilis for improved N-acetylglucosamine production(Metabolic Engineering，23(2014)p42-52)”，在此不作進(jìn)一步描述。

在又一方面，本發(fā)明還提供了一種上述高產(chǎn)乙酰氨基葡萄糖的重組枯草芽孢桿菌制備乙酰氨基葡萄糖的方法，包括以下步驟：將重組枯草芽孢桿菌在種子培養(yǎng)基中活化，然后將活化后的種子轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，加入誘導(dǎo)劑進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得到乙酰氨基葡萄糖。

在一具體實(shí)施例中，種子在35-37℃下在種子培養(yǎng)基中活化，活化后的種子在35-37℃下發(fā)酵培養(yǎng)。

進(jìn)一步地，上述種子培養(yǎng)基包括以下成分：蛋白胨，酵母粉，氯化鈉。

在一具體實(shí)施例中，種子培養(yǎng)基以其總重量為基準(zhǔn)，由以下成分配制而成：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母粉和10g/L氯化鈉。

進(jìn)一步地，上述發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下成分：葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、硫酸銨、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、碳酸鈣和微量元素溶液。

在一具體實(shí)施例中，發(fā)酵培養(yǎng)基以其總重量為基準(zhǔn)，包括以下成分：20g/L葡萄糖、6g/L蛋白胨、12g/L酵母粉、6g/L硫酸銨、12.5g/L磷酸氫二鉀、2.5g/L磷酸二氫鉀、5g/L碳酸鈣和10ml/L微量元素溶液。

進(jìn)一步的，微量元素溶液包括：硫酸錳、氯化鈷、鉬酸鈉、硫酸鋅、氯化鋁、氯化銅、硼酸和鹽酸。

更進(jìn)一步地，微量元素溶液以其總重量為基準(zhǔn)，包括以下成分：1.0g/L硫酸錳、0.4g/L氯化鈷、0.2g/L鉬酸鈉、0.2g/L硫酸鋅、0.1g/L氯化鋁、0.1g/L氯化銅、0.05g/L硼酸和5mol/L鹽酸在一具體實(shí)施例中，將活化后的種子以3％～：的接種量轉(zhuǎn)入所述發(fā)酵培養(yǎng)基。

在一具體實(shí)施例中，誘導(dǎo)劑為木糖，每升發(fā)酵培養(yǎng)基的木糖用量為5g，發(fā)酵過程中葡萄糖的濃度維持在3-7g/L。

借由上述方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明提供了一種高產(chǎn)乙酰氨基葡萄糖的重組枯草芽孢桿菌及其構(gòu)建方法，該構(gòu)建方法以枯草芽孢桿菌(BSGN6)作為出發(fā)菌株，通過基于Cre/lox系統(tǒng)PCR介導(dǎo)的基因組整合技術(shù)，以木糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子P_xylA調(diào)控葡萄糖激酶編碼基因glck表達(dá)和磷酸葡糖異構(gòu)酶編碼基因pgi表達(dá)，控制glck和pgi基因的適度表達(dá)，從而能夠提高枯草芽孢桿菌中乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)量。加強(qiáng)乙酰氨基葡萄糖合成途徑，為進(jìn)一步代謝工程改造枯草芽孢桿菌生產(chǎn)氨基葡萄糖奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明提供的重組枯草芽孢桿菌構(gòu)建方法簡單，便于使用，具有良好的應(yīng)用前景。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，對本發(fā)明的作進(jìn)一步詳細(xì)描述。然而，應(yīng)理解的是，以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。

實(shí)施例1

構(gòu)建枯草芽孢桿菌BSGN6-P_xylA-glck

根據(jù)對NCBI上公布的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis 168，購自美國典型微生物保藏中心，ATCC No.27370)葡萄糖激酶編碼基因glck進(jìn)行序列分析獲得glck啟動(dòng)子區(qū)域，根據(jù)其上下游序列設(shè)計(jì)啟動(dòng)子替換框同源臂擴(kuò)增引物，左臂上下游引物分別為：glck-L-F：5’-AGATCCTGATGTTTTTCTTGCTCGAA-3’；glck-L-R:5’-AGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGACAAAAAAGCCAGCTTCCTTTCC-3’；

右臂上下游引物分別為：glck-R-F:5’-CACTTAAATCAAAGGGGGAAATGTACAATGGACGAGATATGGTTTGCGG-3’；glck-R-R:5’-TTAACAATTTTGATGTTTCAGCCATTC-3’。

采用上述引物從枯草芽孢桿菌基因組中擴(kuò)增替換框中包含的左臂和右臂，擴(kuò)增的具體條件為：98℃預(yù)變性3min；98℃變性10s，55℃退火15s，72℃延伸1kb/1min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，12℃保溫。根據(jù)NCBI上公布的p7Z6質(zhì)粒序列(NCBI accession no.EU541492)設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增博來霉素抗性基因zeo，上下游引物分別為：glck-Z-F:5’-GGAAAGGAAGCTGGCTTTTTTGTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCT-3’；glck-Z-R:5’-AGGAACGTACAGACGGCTTAAAAGCGCTTGCATGCCTGCAGGTCGAC-3’。

根據(jù)NCBI上公布的pSTOP1622質(zhì)粒序列，設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增啟動(dòng)子序列P_xylA，上下游引物分別為：glck-P-F:5’-GTCGACCTGCAGGCATGCAAGCGCTTTTAAGCCGTCTGTACGTTCCT-3’和glck-P-R:5’-CCGCAAACCATATCTCGTCCATTGTACATTTCCCCCTTTGATTTAAGTG-3’，擴(kuò)增的具體條件：98℃預(yù)變性3min；98℃變性10s，55℃退火15s，72℃延伸1kb/1min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，12℃保溫。通過融合PCR方法，將左臂、博來霉素抗性基因、啟動(dòng)子序列和右臂融合為替換框。通過測序確認(rèn)glck啟動(dòng)子替換框構(gòu)建成功。為不影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行，向重組枯草芽孢桿菌中轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pDG148，促使其表達(dá)環(huán)化重組酶，消除博來霉素抗性基因zeo。

將構(gòu)建好的glck啟動(dòng)子替換框轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌(BSGN6)，通過博來霉素抗性平板篩選，菌落PCR驗(yàn)證，確認(rèn)葡萄糖激酶編碼基因glck啟動(dòng)子序列已整合替換為木糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子P_xylA，得到枯草芽孢桿菌BSGN6-P_xylA-glck。

實(shí)施例2

構(gòu)建重組枯草芽孢桿菌BSGN6-P_xylA-glck-P_xylA-pgi

根據(jù)對NCBI上公布的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis 168，購自美國典型微生物保藏中心，ATCC No.27370)磷酸葡糖異構(gòu)酶編碼基因pgi進(jìn)行序列分析獲得pgi啟動(dòng)子區(qū)域，根據(jù)其上下游序列設(shè)計(jì)啟動(dòng)子替換框同源臂擴(kuò)增引物，左臂上下游引物分別為：pgi-L-F：5’-ATTTGGAGGTTTTACTATGGAAAATTTCA-3’；pgi-L-R：5’-AGGATCCCCGGGTACCGAGCTCTCCTTCAAGCGCAATTTCTTTATCT-3’；右臂上下游引物分別為：pgi-R-F:5’-CACTTAAATCAAAGGGGGAAATGTACAATGACGCATGTACGCTTTGACTACTC-3’和pgi-R-R:5’-GCTTCTCTACGTTCAGGACCGTTTC-3’。運(yùn)用上述引物從枯草芽孢桿菌基因組中擴(kuò)增替換框中包含的左臂和右臂,擴(kuò)增的具體條件98℃預(yù)變性3min；98℃變性10s，55℃退火15s，72℃延伸1kb/1min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，12℃保溫。根據(jù)NCBI上公布的p7Z6質(zhì)粒序列(NCBI accession no.EU541492)，設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增博來霉素抗性基因zeo，上下游引物分別為：pgi-Z-F:5’-AGATAAAGAAATTGCGCTTGAAGGAGAGCTCGGTACCCGGGGATCCT-3’和pgi-Z-R:5’-AGGAACGTACAGACGGCTTAAAAGCGCTTGCATGCCTGCAGGTCGAC-3’。

根據(jù)NCBI上公布的pSTOP1622質(zhì)粒序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增啟動(dòng)子序列P_xylA，上下游引物分別為：pgi-P-F:5’-GTCGACCTGCAGGCATGCAAGCGCTTTTAAGCCGTCTGTACGTTCCT-3’和pgi-P-R：5’-GAGTAGTCAAAGCGTACATGCGTCATTGTACATTTCCCCCTTTGATTTAAGTG-3’，擴(kuò)增的具體條件98℃預(yù)變性3min；98℃變性10s，55℃退火15s，72℃延伸1kb/1min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，12℃保溫。通過融合PCR方法，將左臂、博來霉素抗性基因、啟動(dòng)子序列和右臂融合為pgi啟動(dòng)子替換框。為不影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行，向重組枯草芽孢桿菌中轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pDG148，促使其表達(dá)環(huán)化重組酶，消除博來霉素抗性基因zeo。

將構(gòu)建好的pgi啟動(dòng)子替換框轉(zhuǎn)化實(shí)施例1中得到的枯草芽孢桿菌BSGN6-P_xylA-glck，通過博來霉素抗性平板篩選，菌落PCR驗(yàn)證，確認(rèn)磷酸葡糖異構(gòu)酶編碼基因pgi啟動(dòng)子序列已整合替換為木糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子P_xylA，得到重組枯草芽孢桿菌BSGN6-P_xylA-glck-P_xylA-pgi。

實(shí)施例3

采用實(shí)施例2構(gòu)建的重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)乙酰氨基葡萄糖

種子培養(yǎng)基的成分包括：10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉和10g/L氯化鈉。

發(fā)酵培養(yǎng)基的成分包括：20g/L葡萄糖、6g/L蛋白胨、12g/L酵母粉、6g/L硫酸銨、12.5g/L磷酸氫二鉀、2.5g/L磷酸二氫鉀、5g/L碳酸鈣和10ml/L微量元素溶液。

其中微量元素溶液以其重量為基準(zhǔn)包括如下組份：1.0g/L硫酸錳、0.4g/L氯化鈷、0.2g/L鉬酸鈉、0.2g/L硫酸鋅、0.1g/L氯化鋁、0.1g/L氯化銅、0.05g/L硼酸和5mol/L鹽酸。

在種子培養(yǎng)基中將重組枯草芽孢桿菌BSGN6-P_xylA-glck-P_xylA-pgi于37℃、220rpm下培養(yǎng)9h，然后將種子以3％的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，于3L發(fā)酵罐中37℃、600rpm條件下發(fā)酵培養(yǎng)72h，發(fā)酵過程中，葡萄糖濃度維持在7g/L。發(fā)酵31h結(jié)束時(shí)，檢測發(fā)酵上清液中乙酰氨基葡萄糖的含量。結(jié)果表明，發(fā)酵上清液中乙酰氨基葡萄糖含量達(dá)到35.12g/L，比對照菌株BSGN6(22.86g/L)提高了52.6％，乙酰氨基葡萄糖對細(xì)胞得率和乙酰氨基葡萄糖生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到1.91g/g cell和0.49g/L/h，分別比對照菌株提高了65.4％和36.7％(對照菌株的分別為0.66g/g cell和0.31g/L/h)，實(shí)現(xiàn)了乙酰氨基葡萄糖在重組枯草芽孢桿菌胞外產(chǎn)量的提高。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，并不用于限制本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和變型，這些改進(jìn)和變型也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。