本發(fā)明涉及乙酰氨基葡萄糖苷酶檢測試劑領(lǐng)域，具體涉及一種乙酰氨基葡萄糖苷酶檢測試劑、反應(yīng)墊、其制備方法及試劑盒。
背景技術(shù)：
陰道炎是陰道黏膜及黏膜下結(jié)締組織的炎癥，是婦科門診常見的疾病。正常健康婦女，由于解剖學(xué)及生物化學(xué)特點，陰道對病原體的侵入有自然防御功能，當(dāng)陰道的自然防御功能遭到破壞，則病原體易于侵入，導(dǎo)致陰道炎癥。常見的陰道炎有細(xì)菌性陰道炎(BV/AV)、霉菌性陰道炎(VVC)及滴蟲性陰道炎(TV)三大類。其中，霉菌性陰道炎又稱念珠菌性陰道炎，是以念珠菌特別是白色念珠菌為病原體產(chǎn)生的一類陰道炎癥。滴蟲性陰道炎是以陰道毛滴蟲為主要病原體產(chǎn)生的一類陰道疾病，是全球性、十分常見的公共衛(wèi)生性傳播疾病。
研究表明，滴蟲、念珠菌具有N-乙酰氨基葡萄糖苷酶特異性酶，因此可以通過檢測N-乙酰氨基葡萄糖苷酶檢測滴蟲和念珠菌。但目前用于檢測乙酰氨基葡萄糖苷酶的檢測試劑其精確度有所欠缺。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的第一個目的在于提供一種乙酰氨基葡萄糖苷酶檢測試劑，該試劑可使用生理鹽水作為樣品稀釋液，使用條件簡單方便，精確性高。
實現(xiàn)本發(fā)明的目的可以通過采取如下技術(shù)方案達(dá)到：一種乙酰氨基葡萄糖苷酶檢測試劑，包括反應(yīng)劑和顯色劑；所述反應(yīng)劑包括：無水甲醇、對硝基苯-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、聚乙烯吡咯烷酮、TritonX-100、EDTA和檸檬酸。
作為優(yōu)選，所述反應(yīng)劑的成分按重量份計包括：
所述Triton X-10占乙酰氨基葡萄糖苷酶檢測試劑的體積百分比為0.01～0.5％。
再優(yōu)選地，所述反應(yīng)劑的成分按重量份計包括：
所述Triton X-10占乙酰氨基葡萄糖苷酶檢測試劑的體積百分比為0.2％。
作為優(yōu)選，所述顯色劑為氫氧化鈉溶液；再優(yōu)選地，所述氫氧化鈉溶液的濃度為0.004～0.04g/mL。
作為優(yōu)選，所述聚乙烯吡咯烷酮為聚乙烯吡咯烷酮-K90。
作為優(yōu)選，使用所述乙酰氨基葡萄糖苷酶檢測試劑進(jìn)行檢測的樣品的稀釋液為生理鹽水。
本發(fā)明的第二個目的是為了提供一種反應(yīng)墊，該反應(yīng)墊使用方便快捷，精確性高。
實現(xiàn)本發(fā)明的目的可以通過采取如下技術(shù)方案達(dá)到：一種反應(yīng)墊，包括載體和如上所述的反應(yīng)劑的成分；所述反應(yīng)劑的成分包被在載體上；所述反應(yīng)墊用于檢測乙酰氨基葡萄糖苷酶。
作為優(yōu)選，使用所述反應(yīng)墊進(jìn)行檢測的樣品的稀釋液為生理鹽水。
本發(fā)明的第三個目的是為了提供一種反應(yīng)墊的制備方法，通過該制備方法結(jié)合檢測試劑的成分獲得一種靈敏度高、精確度高的反應(yīng)墊。
實現(xiàn)本發(fā)明的目的可以通過采取如下技術(shù)方案達(dá)到：一種如上所述的反應(yīng)墊的制備方法，包括以下步驟：
1)制備浸泡液A：將對硝基苯-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶充分溶于無水甲醇中，得到浸泡液A；
2)制備浸泡液B：將聚乙烯吡咯烷酮、Triton X-10、EDTA和檸檬酸溶于純水中，得到浸泡液B；
3)浸泡液A處理：將載體置于浸泡液A中充分浸泡后取出，然后進(jìn)行干燥，得到浸泡液A載體；
4)浸泡液B處理：將浸泡液A載體置于浸泡液B中充分浸泡后取出，然后進(jìn)行干燥，得到反應(yīng)墊。
作為優(yōu)選，步驟3)中，所述載體置于浸泡液A中充分浸泡10～20s；步驟4)中，所述載體置于浸泡液B中充分浸泡10～20s。
作為優(yōu)選，步驟3)中，所述干燥的溫度為20～70℃，時間為30～40min；步驟4)中，所述干燥的溫度為20～75℃，時間為30～40min。
作為優(yōu)選，步驟3)中，所述載體為濾紙。
本發(fā)明的第四個目的是為了提供一種試劑盒，該試劑盒用于檢測乙酰氨基葡萄糖苷酶，使用方便靈活。
實現(xiàn)本發(fā)明的目的可以通過采取如下技術(shù)方案達(dá)到：
一種試劑盒，包括如上所述的反應(yīng)墊，以及顯色劑；所述試劑盒用于檢測乙酰氨基葡萄糖苷酶。
作為優(yōu)選，所述試劑盒通過以下步驟得到：
1)放置反應(yīng)墊：將反應(yīng)墊置于反應(yīng)孔中，然后將反應(yīng)孔密封；
2)制備顯色劑：配制氫氧化鈉溶液作為顯色劑；所述顯色劑配合反應(yīng)墊，得到試劑盒。
本發(fā)明的設(shè)計原理如下：
滴蟲、念珠菌具有特異性酶：N-乙酰氨基葡萄糖苷酶，因此可以通過檢測N-乙酰氨基葡萄糖苷酶檢測滴蟲和念珠菌。當(dāng)陰道分泌物中存在N-乙酰氨基葡萄糖苷酶時，水解對硝基苯-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶，在顯色劑的作用下顯黃色。其中，念珠菌白帶pH≤4.6，而滴蟲白帶pH≥4.8，還可將本發(fā)明的檢測試劑盒結(jié)合pH檢測結(jié)果進(jìn)一步判別滴蟲性陰道炎還是念珠菌性陰道炎。
相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：
1、本發(fā)明的反應(yīng)墊可使用生理鹽水作為檢測樣品稀釋液，使用條件簡單方便，并可結(jié)合使用條件相同的其他菌種預(yù)成酶的檢測反應(yīng)墊同時對樣品進(jìn)行檢測，效率更高；
2、本發(fā)明的反應(yīng)墊制備方法最大限度地將檢測試劑的成分包被在反應(yīng)墊中，獲得的反應(yīng)墊靈敏度高，精確性好。
具體實施方式
下面，結(jié)合具體實施方式，對本發(fā)明做進(jìn)一步描述：
一種乙酰氨基葡萄糖苷酶檢測試劑，包括：反應(yīng)劑和顯色劑；反應(yīng)劑按重量份計包括以下成分：
所述Triton X-10占乙酰氨基葡萄糖苷酶檢測試劑的體積百分比為0.01～0.5％。
聚乙烯吡咯烷酮(PVP)-K90，在25℃下，體積百分?jǐn)?shù)為5％的水溶液(aq)，其粘度為39.5～45.8mPas。
其中反應(yīng)劑通過以下制備方法制得：
將無水甲醇、對硝基苯-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、聚乙烯吡咯烷酮、Triton X-10、EDTA和檸檬酸依次溶于純水中，得到反應(yīng)劑；
顯色劑為濃度0.004～0.04g/mL的氫氧化鈉溶液；顯色劑配合反應(yīng)劑，得到乙酰氨基葡萄糖苷酶檢測試劑。
一種反應(yīng)墊，包括載體和如上所述的反應(yīng)劑的成分；所述反應(yīng)劑的成分包被在載體上；所述反應(yīng)墊用于檢測乙酰氨基葡萄糖苷酶；使用該反應(yīng)墊進(jìn)行樣品檢測時，樣品的稀釋液為生理鹽水。
該反應(yīng)墊的制備方法包括以下步驟：
1)備料：按以上重量份準(zhǔn)備無水甲醇、對硝基苯-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、聚乙烯吡咯烷酮、Triton X-100、EDTA和檸檬酸；
2)制備浸泡液A：將對硝基苯-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶充分溶于無水甲醇中，得到浸泡液A；
3)制備浸泡液B：將聚乙烯吡咯烷酮、Triton X-10、EDTA和檸檬酸溶于純水中，得到浸泡液B；
4)浸泡液A處理：將濾紙置于浸泡液A中充分浸泡10～20s后取出，然后在溫度為20～70℃，時間為30～40min的條件下進(jìn)行干燥，得到浸泡液A濾紙；
5)浸泡液B處理：將浸泡液A濾紙置于浸泡液B中充分浸泡10～20s后取出，然后在溫度20～75℃，時間為30～40min的條件下進(jìn)行干燥，得到反應(yīng)墊。
更具體地，所述濾紙可以是Whatman玻璃纖維濾紙、GF/A Whatman的纖維濾紙Grade3或普通定量濾紙。
應(yīng)用反應(yīng)墊制備試劑盒：試劑盒包括反應(yīng)墊和顯色劑；試劑盒通過以下步驟得到：
1)放置反應(yīng)墊：將反應(yīng)墊置于反應(yīng)孔中，然后將反應(yīng)孔密封；
2)制備顯色劑：配制氫氧化鈉溶液作為顯色劑；顯色劑為濃度0.004～0.04g/mL的氫氧化鈉溶液；
所述顯色劑配合反應(yīng)墊，得到試劑盒；試劑盒置于2～8℃中保存。
實施例1～3
實施例1～3公開了一種乙酰氨基葡萄糖苷酶檢測試劑，按表1分別準(zhǔn)備三組原料成分，按表2準(zhǔn)備濃度不同的氫氧化鈉溶液作為顯色劑；A組用于實施例1，B組用于實施例2，C組用于實施例3。
將無水甲醇、對硝基苯-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、聚乙烯吡咯烷酮、Triton X-10、EDTA和檸檬酸依次溶于100mL的純水中，得到反應(yīng)劑；顯色劑配合反應(yīng)劑，得到凝固酶檢測試劑。
表1反應(yīng)劑的成分及含量
表2顯色劑的配制參數(shù)
對實施例1～3中獲得的檢測試劑進(jìn)行檢測：分別制備酶活性濃度不同的乙酰氨基葡萄糖苷酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液，乙酰氨基葡萄糖苷酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液以生理鹽水作為溶劑，檢測實施例1～3的靈敏度。
分別取實施例1～3的乙酰氨基葡萄糖苷酶檢測試劑各1mL，然后分別滴加標(biāo)準(zhǔn)品溶液35uL，在溫度為37±2℃的條件下水浴17～20min，然后滴入顯色劑，觀察溶液中的顏色變化，溶液顯色為黃色表示陽性，無顯色表示陰性；結(jié)果如表3所示：
表3實施例1～3的檢測結(jié)果
+表示陽性，-表示陰性。
實施例1～3均可檢測乙酰氨基葡萄糖苷酶，且當(dāng)乙酰氨基葡萄糖苷酶活性較低時仍然能夠檢測到乙酰氨基葡萄糖苷酶；其中在酶活性濃度為3.75U/mL時，實施例1仍可檢測得到少量的乙酰氨基葡萄糖苷酶，實施例1的檢測試劑靈敏度最高。
實施例4～6
實施例4～6公開了一種試劑盒：
1)按表1和表2進(jìn)行備料；A組用于實施例4，B組用于實施例5，C組用于實施例6；
2)制備浸泡液A：將對硝基苯-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶充分溶于無水甲醇中，得到浸泡液A；
3)制備浸泡液B：將聚乙烯吡咯烷酮、Triton X-10、EDTA和檸檬酸溶于純水中，得到浸泡液B；
4)浸泡液A處理：將濾紙置于浸泡液A中充分浸泡10～20s后取出，然后在溫度為40℃，時間為40min的條件下進(jìn)行干燥，得到浸泡液A濾紙；
5)浸泡液B處理：將浸泡液A濾紙置于浸泡液B中充分浸泡10～20s后取出，然后在溫度為45℃，時間為30min的條件下進(jìn)行干燥，得到反應(yīng)墊；
6)放置反應(yīng)墊：將反應(yīng)墊置于反應(yīng)孔中，然后將反應(yīng)孔密封；
7)制備顯色劑：配制氫氧化鈉溶液作為顯色劑；所述顯色劑配合反應(yīng)墊，得到試劑盒。
對實施例4～6中獲得的試劑盒進(jìn)行檢測：分別制備酶活性濃度不同的乙酰氨基葡萄糖苷酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液，乙酰氨基葡萄糖苷酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液以生理鹽水作為溶劑，檢測實施例4～6的靈敏度；在實施例4～6的試劑盒反應(yīng)孔中分別滴加標(biāo)準(zhǔn)品溶液35uL，在溫度為37±2℃的條件下水浴17～20min，然后滴入顯色劑，觀察試劑盒中的顏色變化，顯色為黃色表示陽性，無顯色表示陰性；結(jié)果如表4所示：
表4實施例4～6的檢測結(jié)果
+表示陽性，-表示陰性。
實施例4～6的試劑盒均可檢測乙酰氨基葡萄糖苷酶，且當(dāng)乙酰氨基葡萄糖苷酶活性較低時仍然能夠檢測到乙酰氨基葡萄糖苷酶；其中在酶活性濃度為3.75U/mL時，實施例4仍可檢測得到少量的乙酰氨基葡萄糖苷酶，實施例4的檢測試劑靈敏度最高。
對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，可根據(jù)以上描述的技術(shù)方案以及構(gòu)思，做出其它各種相應(yīng)的改變以及變形，而所有的這些改變以及變形都應(yīng)該屬于本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。