本發(fā)明涉及遺傳工程領(lǐng)域，尤其涉及一種提高乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)量的重組枯草芽孢桿菌及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

在人體中，乙酰氨基葡萄糖是糖胺聚糖二糖單元的合成前體，其對修復(fù)和維持軟骨及關(guān)節(jié)組織功能具有重要作用。因此，乙酰氨基葡萄糖被廣泛添加在藥物和營養(yǎng)膳食添加中來治療和修復(fù)關(guān)節(jié)損傷。此外，乙酰氨基葡萄糖在化妝品和制藥領(lǐng)域也具有諸多應(yīng)用。目前，乙酰氨基葡萄糖主要采用酸解蝦殼或蟹殼中甲殼素生產(chǎn)，然而，此方法產(chǎn)生的廢液對環(huán)境污染較為嚴(yán)重，而且得到的產(chǎn)品易引起過敏反應(yīng)，不適宜海鮮過敏的人群服用。

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是一種被廣泛用作食品酶制劑及重要營養(yǎng)化學(xué)品的生產(chǎn)宿主，其產(chǎn)品被FDA認證為GRAS(Generally Regarded as Safe)安全級別。申請?zhí)枮?01510761678.6的中國專利申請中構(gòu)建的枯草芽孢桿菌BSGNKAP仍然存在乙酰氨基葡萄糖/葡萄糖轉(zhuǎn)化效率低的缺點。由于BSGNKAP敲除了丙酮酸激酶編碼基因pyk和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶編碼基因pckA后，枯草芽孢桿菌胞內(nèi)的蘋果酸回補途徑會促使蘋果酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸，丙酮酸作為多條代謝途徑的代謝節(jié)點，因此蘋果酸回補生成的丙酮酸會進一步轉(zhuǎn)化為乙偶姻，進而導(dǎo)致副產(chǎn)物過多的積累，造成碳源利用效率較低。同時，由于蘋果酸通過回補途徑轉(zhuǎn)化為丙酮酸，也會造成乙酰氨糖合成前體α-酮戊二酸供應(yīng)不足。因此，如何提高葡萄糖的利用效率及乙酰氨基葡萄糖合成效率，是微生物發(fā)酵法生產(chǎn)乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)量的亟待解決問題。

鑒于上述原因，本發(fā)明人積極加以研究創(chuàng)新，以期創(chuàng)建一種提高乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)量的重組枯草芽孢桿菌及其構(gòu)建方法，使其更具有產(chǎn)業(yè)上的利用價值。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種提高乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)量的重組枯草芽孢桿菌及其構(gòu)建方法，本發(fā)明的重組枯草芽孢桿菌是在枯草芽孢桿菌(BSGNKAP)的基礎(chǔ)上，敲除蘋果酸脫氫酶編碼基因，構(gòu)建方法簡單，具有良好的應(yīng)用前景。

在一方面，本發(fā)明提供了一種提高乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)量的重組枯草芽孢桿菌，該重組枯草芽孢桿菌通過敲除枯草芽孢桿菌的蘋果酸脫氫酶編碼基因得到。

進一步地，蘋果酸脫氫酶編碼基因為ytsJ、ywkA、malS和mleA中的一種或幾種。

進一步地，蘋果酸脫氫酶編碼基因ytsJ、ywkA、malS和mleA分別為NCBI上Gene ID:937378、Gene ID:937045、Gene ID:938071、Gene ID:938725所示。

在一具體實施例中，敲除枯草芽孢桿菌BSGNKAP的蘋果酸脫氫酶編碼基因得到本發(fā)明的重組枯草芽孢桿菌。BSGNKAP通過以B.subtilis 168ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔldhΔpta::lox72為宿主，用啟動子P_xylA、P₄₃分別控制glmS、GNA1的重組表達，并敲除葡萄糖激酶編碼基因glck、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶編碼基因pckA和丙酮酸激酶編碼基因pyk得到，如申請?zhí)枮?01510761678.6的中國專利申請中所公開的。

在又一具體實施例中，通過pP43-GNA1質(zhì)粒游離表達GNA1基因，通過pM7Z6M-P_xylA-glmS質(zhì)粒整合表達glmS基因。

在另一方面，本發(fā)明一種上述提高乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)量的重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

(1)構(gòu)建蘋果酸脫氫酶編碼基因敲除框；

(2)經(jīng)同源重組，用步驟(1)中的敲除框敲除枯草芽孢桿菌基因組中的蘋果酸脫氫酶編碼基因ytsJ、ywkA、malS和mleA，分別得到提高乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)量的重組枯草芽孢桿菌。

在一具體實施例中，用蘋果酸脫氫酶基因的上下游序列和博來霉素抗性基因zeo的序列，構(gòu)建蘋果酸脫氫酶編碼基因敲除框；

在一具體實施例中，經(jīng)同源重組將蘋果酸脫氫酶編碼基因敲除框中的博來霉素抗性基因zeo替代枯草芽孢桿菌中的蘋果酸脫氫酶基因，得到本發(fā)明的重組枯草芽孢桿菌。

在一具體實施例中，在步驟(1)中，蘋果酸脫氫酶基因的上下游序列來自枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis 168，該枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis 168購自美國典型微生物保藏中心，編號為ATCC No.27370。

進一步地，蘋果酸脫氫酶編碼基因為ytsJ、ywkA、malS和mleA中的一種或幾種。

進一步地，蘋果酸脫氫酶基因ytsJ、ywkA、malS和mleA的上下游序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8所示。

在一具體實施例中，用步驟(1)中的敲除框依次敲除枯草芽孢桿菌基因組中的蘋果酸脫氫酶編碼基因ytsJ、ywkA、malS和mleA，得到提高乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)量的重組枯草芽孢桿菌BSGNKAPM1、BSGNKAPM2、BSGNKAPM3、BSGNKAPM4。

進一步地，在步驟(1)中，蘋果酸脫氫酶編碼基因ytsJ、ywkA、malS和mleA敲除框的序列如SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.12所示。

在一具體實施例中，在步驟(2)中，枯草芽孢桿菌為BSGNKAP，其是以B.subtilis 168ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔldhΔpta::lox72為宿主，分別以啟動子P_xylA、P₄₃控制glmS、GNA1的重組表達，并敲除葡萄糖激酶編碼基因glck、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶編碼基因pckA和丙酮酸激酶編碼基因pyk得到，如申請?zhí)?01510761678.6中構(gòu)建的枯草芽孢桿菌。

在另一方面，本發(fā)明還提供了一種上述重組枯草芽孢桿菌制備乙酰氨基葡萄糖的方法，包括以下步驟：將重組枯草芽孢桿菌在種子培養(yǎng)基中活化，然后將活化后的種子轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，加入誘導(dǎo)劑進行發(fā)酵培養(yǎng)，得到乙酰氨基葡萄糖。

進一步地，種子在35℃-37℃下在種子培養(yǎng)基中活化，活化后的種子在35-37℃發(fā)酵培養(yǎng)。

進一步的，種子培養(yǎng)基包括以下成分：蛋白胨、酵母粉和氯化鈉；

在一具體實施例中，種子培養(yǎng)基以其重量為基準(zhǔn)，包括以下成分：10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉和10g/L氯化鈉。

進一步地，發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下成分：葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、硫酸銨、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、碳酸鈣和微量元素溶液。

在一具體實施例中，發(fā)酵培養(yǎng)基以其重量為基準(zhǔn)，包括以下成分：20g/L葡萄糖、6g/L蛋白胨、12g/L酵母粉、6g/L硫酸銨、12.5g/L磷酸氫二鉀、2.5g/L磷酸二氫鉀、5g/L碳酸鈣和10ml/L微量元素溶液。

進一步地，微量元素溶液包括：硫酸錳、氯化鈷、鉬酸鈉、硫酸鋅、氯化鋁、氯化銅、硼酸和鹽酸。

在一具體實施例中，微量元素溶液以其重量為基準(zhǔn)，包括以下成分：1.0g/L硫酸錳、0.4g/L氯化鈷、0.2g/L鉬酸鈉、0.2g/L硫酸鋅、0.1g/L氯化鋁、0.1g/L氯化銅、0.05g/L硼酸和5mol/L鹽酸。

在一具體實施例中，將活化后的種子以5％-6％的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。

在一具體實施例中，誘導(dǎo)劑為木糖，每升發(fā)酵培養(yǎng)基的木糖用量為4.5g～5.5g。

借由上述技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

本發(fā)明提供了提高乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)量的重組枯草芽孢桿菌BSGNKAPM1、BSGNKAPM2、BSGNKAPM3、BSGNKAPM4，是在枯草芽孢桿菌BSGNKAP的基礎(chǔ)上依次敲除蘋果酸脫氫酶基因(ytsJ、ywkA、malS和mleA)得到的，與出發(fā)菌株BSGNKAP相比，其乙酰氨基葡萄糖胞外積累量得到提高，且減少了副產(chǎn)物乙偶姻的產(chǎn)量。本發(fā)明通過敲除ytsJ、ywkA、malS和mleA基因，可以有效的減少副產(chǎn)物生成，提高乙酰氨基葡萄糖的積累。本發(fā)明通過阻斷宿主菌胞內(nèi)蘋果酸通過回補途徑轉(zhuǎn)化為丙酮酸的反應(yīng)，防止了TCA循環(huán)中的碳再次流向乙偶姻、乙酸合成途徑，同時阻斷蘋果酸回補途徑可以有效增加乙酰氨基葡萄糖合成前體α-酮戊二酸含量，進一步促進了乙酰氨基葡萄糖積累。本發(fā)明的重組枯草芽孢桿菌構(gòu)建方法簡單，便于使用，具有很好地應(yīng)用前景。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步詳細描述。以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

實施例1

構(gòu)建枯草芽孢桿菌BSGNKAP

根據(jù)中國專利申請201510761678.6中所公開的內(nèi)容，以B.subtilis168ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔldhΔpta::lox72為宿主，分別以啟動子P_xylA、P₄₃控制glmS、GNA1的重組表達，以pP43-GNA1質(zhì)粒游離表達GNA1基因，pM7Z6M-P_xylA-glmS質(zhì)粒整合表達glmS基因，然后在此基礎(chǔ)上敲除葡萄糖激酶編碼基因glck、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶編碼基因pckA和丙酮酸激酶編碼基因pyk，得到枯草芽孢桿菌BSGNKAP。

實施例2

構(gòu)建重組枯草芽孢桿菌BSGNKAPM1

根據(jù)NCBI上公布的購買自美國典型微生物保藏中心，編號為ATCC No.27370的Bacillus subtilis 168的蘋果酸脫氫酶基因ytsJ的上下游序列(如序列表SEQ ID NO.1所示)，以及博來霉素抗性基因zeo的序列，構(gòu)建序列如SEQ ID NO.2所示的蘋果酸脫氫酶編碼基因敲除框。

將構(gòu)建好的蘋果酸脫氫酶編碼基因敲除框轉(zhuǎn)化實施例1中得到的枯草芽孢桿菌BSGNKAP，經(jīng)同源重組，將蘋果酸脫氫酶編碼基因敲除框中的博來霉素抗性基因zeo替代枯草芽孢桿菌BSGNKAP中蘋果酸脫氫酶基因ytsJ，阻斷了宿主菌胞內(nèi)蘋果酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸的反應(yīng)，通過博來霉素抗性平板篩選、菌落PCR驗證，確認蘋果酸脫氫酶基因ytsJ敲除成功，得到重組枯草芽孢桿菌BSGNKAPM1。

實施例3

構(gòu)建重組枯草芽孢桿菌BSGNKAPM2

根據(jù)NCBI上公布的購買自美國典型微生物保藏中心，編號為ATCC No.27370的Bacillus subtilis 168的蘋果酸脫氫酶基因ywkA的上下游序列(如序列表SEQ ID NO.1所示)，以及博來霉素抗性基因zeo的序列，構(gòu)建序列如SEQ ID NO.2所示的蘋果酸脫氫酶編碼基因敲除框。

將構(gòu)建好的蘋果酸脫氫酶編碼基因敲除框轉(zhuǎn)化實施例2中得到的枯草芽孢桿菌BSGNKAPM1，經(jīng)同源重組，將蘋果酸脫氫酶編碼基因敲除框中的博來霉素抗性基因zeo替代枯草芽孢桿菌BSGNKAPM1中蘋果酸脫氫酶基因ywkA，阻斷了宿主菌胞內(nèi)蘋果酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸的反應(yīng)，通過博來霉素抗性平板篩選、菌落PCR驗證，確認蘋果酸脫氫酶基因ywkA敲除成功，得到重組枯草芽孢桿菌BSGNKAPM2。

實施例4

構(gòu)建重組枯草芽孢桿菌BSGNKAPM3

根據(jù)NCBI上公布的購買自美國典型微生物保藏中心，編號為ATCC No.27370的Bacillus subtilis 168的蘋果酸脫氫酶基因mleA的上下游序列(如序列表SEQ ID NO.1所示)，以及博來霉素抗性基因zeo的序列，構(gòu)建序列如SEQ ID NO.2所示的蘋果酸脫氫酶編碼基因敲除框。

將構(gòu)建好的蘋果酸脫氫酶編碼基因敲除框轉(zhuǎn)化實施例3中得到的枯草芽孢桿菌BSGNKAPM2，經(jīng)同源重組，將蘋果酸脫氫酶編碼基因敲除框中的博來霉素抗性基因zeo替代枯草芽孢桿菌BSGNKAPM2中蘋果酸脫氫酶基因mleA，阻斷了宿主菌胞內(nèi)蘋果酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸的反應(yīng)，通過博來霉素抗性平板篩選、菌落PCR驗證，確認蘋果酸脫氫酶基因mleA敲除成功，得到重組枯草芽孢桿菌BSGNKAPM3。

實施例5

構(gòu)建重組枯草芽孢桿菌BSGNKAPM4

根據(jù)NCBI上公布的購買自美國典型微生物保藏中心，編號為ATCC No.27370的Bacillus subtilis 168的蘋果酸脫氫酶基因malS的上下游序列(如序列表SEQ ID NO.1所示)，以及博來霉素抗性基因zeo的序列，構(gòu)建序列如SEQ ID NO.2所示的蘋果酸脫氫酶編碼基因敲除框。

將構(gòu)建好的蘋果酸脫氫酶編碼基因敲除框轉(zhuǎn)化實施例1中得到的枯草芽孢桿菌BSGNKAPM3，經(jīng)同源重組，將蘋果酸脫氫酶編碼基因敲除框中的博來霉素抗性基因zeo替代枯草芽孢桿菌BSGNKAPM3中蘋果酸脫氫酶基因malS，阻斷了宿主菌胞內(nèi)蘋果酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸的反應(yīng)，通過博來霉素抗性平板篩選、菌落PCR驗證，確認蘋果酸脫氫酶基因malS敲除成功，得到重組枯草芽孢桿菌BSGNKAPM4。

實施例6

重組枯草芽孢桿菌BSGNKAPM1、BSGNKAPM2、BSGNKAPM3、BSGNKAPM4發(fā)酵生產(chǎn)乙酰氨基葡萄糖

種子培養(yǎng)基的成分包括：10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉和10g/L氯化鈉。

發(fā)酵培養(yǎng)基的成分包括：20g/L葡萄糖、6g/L蛋白胨、12g/L酵母粉、6g/L硫酸銨、12.5g/L磷酸氫二鉀、2.5g/L磷酸二氫鉀、5g/L碳酸鈣和10ml/L微量元素溶液。

其中微量元素溶液以其重量為基準(zhǔn)，包括如下成分：1.0g/L硫酸錳、0.4g/L氯化鈷、0.2g/L鉬酸鈉、0.2g/L硫酸鋅、0.1g/L氯化鋁、0.1g/L氯化銅、0.05g/L硼酸和5mol/L鹽酸。

使用高效液相色譜法檢測乙酰氨基葡萄糖的含量，高效液相色譜法測試條件：儀器型號Agilent 1200，RID檢測器，柱子：NH₂柱(250×4.6mm，5μm)，流動相：70％乙腈，流速0.75mL/min，柱溫30℃，進樣體積為10μL。

發(fā)酵液中葡萄糖濃度的檢測：SBA生物傳感分析儀。

在種子培養(yǎng)基中將重組枯草芽孢桿菌BSGNKAP1于37℃、220rpm下培養(yǎng)8h，然后將種子以5％的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，于500mL搖瓶中37℃、220rpm條件下發(fā)酵培養(yǎng)48h。發(fā)酵結(jié)束時，檢測發(fā)酵上清液中乙酰氨基葡萄糖的含量。

BSGNKAPM4發(fā)酵上清液中乙酰氨基葡萄糖的含量達到12.09g/L，與對照菌株BSGNKAP相比，其產(chǎn)量提高了13.8％，發(fā)酵上清液中乙偶姻的產(chǎn)量為9.63g/L，而出發(fā)菌株中的乙偶姻的產(chǎn)量為11.75g/L，副產(chǎn)物乙偶姻的產(chǎn)量僅為對照菌株的81.9％。此外，本發(fā)明的BSGNKAP菌株的乙酰氨基葡萄糖比合成速率達到0.054g/g DCW/h，與對照菌株BSGNKAP相比，提高了10.2％。實驗結(jié)果如表1所示。因此通過敲除蘋果酸酶基因(ytsJ、ywkA、malS和mleA)，可以有效提高乙酰氨基葡萄糖的積累。本發(fā)明實現(xiàn)了乙酰氨基葡萄糖在重組枯草芽孢桿菌胞外產(chǎn)量的提高，降低了副產(chǎn)物的產(chǎn)量。

表1改造重組菌株各參數(shù)比較

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，并不用于限制本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進和變型，這些改進和變型也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。