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提高乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)量的重組枯草芽孢桿菌及其構(gòu)建方法與流程

文檔序號(hào):11808662閱讀:來(lái)源:國(guó)知局

技術(shù)特征:

1.一種提高乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)量的重組枯草芽孢桿菌,其特征在于:所述重組枯草芽孢桿菌通過(guò)敲除枯草芽孢桿菌的蘋(píng)果酸脫氫酶編碼基因得到。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)量的重組枯草芽孢桿菌,其特征在于:所述蘋(píng)果酸脫氫酶編碼基因?yàn)閥tsJ、ywkA、malS和mleA中的一種或幾種。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的提高乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)量的重組枯草芽孢桿菌,其特征在于:所述蘋(píng)果酸脫氫酶編碼基因ytsJ、ywkA、malS和mleA分別如NCBI上Gene ID:937378、Gene ID:937045、Gene ID:938071、Gene ID:938725所示。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)量的重組枯草芽孢桿菌,其特征在于:所述枯草芽孢桿菌通過(guò)以B.subtilis 168ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔldhΔpta::lox72為宿主,用啟動(dòng)子PxylA、P43分別控制glmS、GNA1的重組表達(dá),并敲除葡萄糖激酶編碼基因glck、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶編碼基因pckA和丙酮酸激酶編碼基因pyk得到。

5.一種如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的提高乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)量的重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建方法,其特征在于,包括以下步驟:

(1)構(gòu)建蘋(píng)果酸脫氫酶編碼基因敲除框;

(2)經(jīng)同源重組,用步驟(1)中的敲除框敲除枯草芽孢桿菌基因組中的蘋(píng)果酸脫氫酶編碼基因,得到所述提高乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)量的重組枯草芽孢桿菌。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建方法,其特征在于:在步驟(1)中,用蘋(píng)果酸脫氫酶基因的上下游序列和博來(lái)霉素抗性基因zeo的序列,構(gòu)建蘋(píng)果酸脫氫酶編碼基因敲除框。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建方法,其特征在于:在步驟(2)中,經(jīng)同源重組將敲除框中的博來(lái)霉素抗性基因zeo替代枯草芽孢桿菌中的所述蘋(píng)果酸脫氫酶基因,得到所述重組枯草芽孢桿菌。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建方法,其特征在于:在步驟(1)中,蘋(píng)果酸脫氫酶基因的上下游序列來(lái)自枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis168,所述枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis 168購(gòu)自美國(guó)典型微生物保藏中心,編號(hào)為ATCC No.27370。

9.根據(jù)權(quán)利要求5-8中任一項(xiàng)所述的重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建方法,其特征在于:所述蘋(píng)果酸脫氫酶編碼基因?yàn)閥tsJ、ywkA、malS和mleA中的一種或幾種。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建方法,其特征在于:所述蘋(píng)果酸脫氫酶基因ytsJ、ywkA、malS和mleA的上下游序列如SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.8所示。

11.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建方法,其特征在于:在步驟(1)中,所述蘋(píng)果酸脫氫酶編碼基因ytsJ、ywkA、malS和mleA敲除框的序列如SEQ ID NO.9~SEQ ID NO.12所示。

12.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建方法,其特征在于:在步驟(2)中,所述枯草芽孢桿菌通過(guò)以B.subtilis 168ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔldhΔpta::lox72為宿主,分別以啟動(dòng)子PxylA、P43控制glmS、GNA1的重組表達(dá),并敲除葡萄糖激酶編碼基因glck、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶編碼基因pckA和丙酮酸激酶編碼基因pyk得到。

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