本發(fā)明涉及一種天山堇菜中具有二聚哌啶類ⅲ型和ⅳ型骨架的生物堿化合物及制備方法。

背景技術(shù)：

天山堇菜為堇菜科(violaceae)堇菜屬(viola)植物天山堇菜(violatianshanica)的干燥全草?！侗＝∷巿@》中也稱比乃非謝吉。分布于我國(guó)新疆天山、昆侖山、帕米爾高原，云南、四川、西藏，中亞地區(qū)亦有分布，是維吾醫(yī)藥中常用藥物。天山堇菜為多年生草本；其形態(tài)特征：根莖多粗短，主根圓柱狀或倒長(zhǎng)圓錐形，黃白或淡棕色；葉基生，葉片卵狀或長(zhǎng)圓狀卵形，先端鈍，全緣或具圓齒，具短腺毛；花單生于花梗頂端，花梗稍超出根生葉或等長(zhǎng)，花瓣5枚，倒卵形，白色具淡紫色條紋。干燥藥材多皺縮；粗短根莖(2-4mm)具環(huán)紋及葉柄殘基；粗壯主根(0.5-2cm)灰白色至淺黃褐色；花灰藍(lán)色。天山堇菜收錄于：《中華本草》、《維吾爾藥志》、《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·維吾爾藥分冊(cè)》、《維吾爾藥材標(biāo)準(zhǔn)》?！吨腥A本草》中記載的功能與主治：生濕生寒，清熱解毒，消炎退燒，潤(rùn)肺消腫，潤(rùn)喉止咳，通利二便；主治干熱性或膽液質(zhì)性疾病，如發(fā)熱發(fā)燒，干熱性頭痛及急性胸膜炎，肺炎，咽干咳嗽，二便不利等?！栋咨珜m殿》中記載用于治療血液性質(zhì)頭痛、眼病，熱性咳嗽，胸膜炎、肺炎，尿少便秘等。《拜地依藥書》中記載用于治療體外熱性炎腫，熱性胃炎、肝炎，白喉，小兒癲癇，熱性頭痛，皮膚瘙癢等。

天山堇菜的藥理學(xué)研究較少，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明天山堇菜具有抗炎作用，抗氧化活性，抗菌活性。同屬的其他植物研究比較多，有抗乙型肝炎活性，免疫抑制活性，抗炎活性，抑制哮喘作用，細(xì)胞毒活性，抗飲食性肥胖，抗凝血活性，抗瘧原蟲活性，殺菌活性，降壓降脂活性，肌松弛及鎮(zhèn)靜催眠活性，膠原酶抑制活性，促胃腸運(yùn)動(dòng)及瀉下作用，退燒及抗驚厥活性，抗氧化活性，改善慢性失眠作用，酪氨酸酶及膽堿酯酶抑制活性等。

天山堇菜的化學(xué)成分研究較少，已報(bào)道了4個(gè)苯丙素類化合物；同屬其他植物的化學(xué)成分報(bào)道較多，有三萜及其皂苷，倍半萜，香豆素，雙香豆素，黃酮，水楊酸衍生物，苯丙素類，醌類，環(huán)多肽等。

本發(fā)明對(duì)天山堇菜的生物堿成分進(jìn)行的充分的分析分離研究，從中獲得了全新的二聚哌啶類的新骨架(ⅲ)及其對(duì)應(yīng)的生物堿化合物1天山堇寧a，化合物2天山堇寧b，以及二聚哌啶類的新骨架(ⅳ)其對(duì)應(yīng)的生物堿化合物3天山堇啶。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于，提供一種天山堇菜中具有二聚哌啶類ⅲ和ⅳ型骨架的生物堿化合物及制備方法，該化合物1為天山堇寧a，化合物2為天山堇寧b，化合物3為天山堇啶；該方法采用甲醇溶劑進(jìn)行提取，通過(guò)酸溶堿沉法制得總堿，通過(guò)兩相溶劑分配法得到上相部位，再利用葡聚糖凝膠色譜法以及正反相色譜法分離得到ⅲ和ⅳ型新骨架生物堿化合物1為天山堇寧a，化合物2為天山堇寧b，化合物3為天山堇啶。

本發(fā)明所述的一種天山堇菜中具有二聚哌啶類ⅲ和ⅳ型骨架的化合物，該化合物為天山堇寧a、天山堇寧b和天山堇啶，結(jié)構(gòu)式為：

其中式ⅲ為二聚哌啶類ⅲ型骨架；1為二聚哌啶類骨架ⅲ型所對(duì)應(yīng)的化合物天山堇寧a；2為二聚哌啶類骨架ⅲ型所對(duì)應(yīng)的化合物天山堇寧b；式ⅳ為二聚哌啶類ⅳ型骨架；3為二聚哌啶類骨架ⅳ型所對(duì)應(yīng)的化合物天山堇啶。

所述天山堇菜中具二聚哌啶ⅲ和ⅳ型骨架的化合物的制備方法，按下列步驟進(jìn)行：

a、將天山堇菜全草粉碎，用無(wú)水甲醇溶劑冷浸回流、滲漉、超聲或微波提取2-10次，合并提取液并干燥，得到總提取物；

b、將步驟a中的總提取物用氯仿溶解，用水進(jìn)行萃取，收集氯仿層并干燥得氯仿部位，再將氯仿部位用0.5n的硫酸溶解過(guò)濾，收集濾液，濾液用乙酸乙酯萃取以去除非生物堿雜質(zhì)，去雜質(zhì)的濾液用飽和碳酸氫鈉水溶液調(diào)ph至10-14，得到堿化液；

c、將步驟b中的堿化液用二氯甲烷充分萃取并干燥，得到總生物堿；

d、將步驟c中的總生物堿用體積比5:5:5:5-1:5:1:5的正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水的兩相溶劑系統(tǒng)進(jìn)行分配，收集上相有機(jī)相，干燥得到上相部位，再將上相部位進(jìn)行正相硅膠柱層析分段分離，以體積比100:0，85:15，70:30，55:45的環(huán)己烷:乙酸乙酯為洗脫溶劑進(jìn)行梯度洗脫，得到4個(gè)部位為v100，v85，v70和v55；

e、將步驟d中的v70部位以無(wú)水甲醇為溶劑，經(jīng)葡聚糖凝膠lh-20分離得到v70-1組分，將v70-1組分利用反相色譜柱：ymcpydrospherec185μm10×250mm；溶劑：濃度為34％的乙腈水溶液；流速：4.0ml/min進(jìn)行分離，分別收集并干燥2.5分鐘至6.5分鐘的流份(v70-1-1)，18.5分鐘至19.5分鐘的流份(v70-1-6)，以及20分鐘至21分鐘的流份(v70-1-7)，再將流份v70-1-1繼續(xù)用反相色譜柱：ymcpydrospherec185μm10×250mm；溶劑：濃度為37％的甲醇水溶液；流速：3.1ml/min進(jìn)行純化，收集50至53分鐘的流份，干燥即得化合物3天山堇啶；將流份v70-1-6繼續(xù)用反相色譜柱：ymcpydrospherec185μm10×250mm；溶劑：濃度為59％的甲醇水溶液；流速：2.8ml/min進(jìn)行純化，收集21.5至23分鐘的流份，干燥即得化合物2天山堇寧b，將流份v70-1-7繼續(xù)用反相色譜柱：ymcpydrospherec185μm10×250mm；溶劑：濃度為52.8％的甲醇水溶液；流速：4.0ml/min進(jìn)行純化，收集31.5至33.5分鐘的流份，干燥即得化合物1天山堇寧a。

本發(fā)明所述的天山堇菜中具有二聚哌啶類ⅲ和ⅳ型骨架的生物堿化合物及制備方法，其中具有二聚哌啶類ⅲ型骨架的生物堿化合物1和化合物2的結(jié)構(gòu)鑒定：

化合物1：命名為天山堇寧a；白色無(wú)定形粉末，uv(meoh)λmax(logε)305(2.08)nm，200(3.95)nm；hr-esi(+)ms：[m+h]⁺331.2038；分子式：c19h26n2o3；¹h和¹³c核磁數(shù)據(jù)見表1；經(jīng)hmbc相關(guān)譜解析確定化合物結(jié)構(gòu)如圖1所示。

化合物2：命名為天山堇寧b；白色無(wú)定形粉末，uv(meoh)λmax(logε)295(4.28)nm；hr-esi(+)ms：[m+h]⁺315.2084；分子式：c19h26n2o2；¹h和¹³c核磁數(shù)據(jù)見表1；經(jīng)hmbc相關(guān)譜解析確定化合物結(jié)構(gòu)如圖1所示。

具有二聚哌啶類ⅳ型骨架的生物堿化合物3的結(jié)構(gòu)鑒定：

化合物3：命名為天山堇啶；黃色無(wú)定形粉末，uv(meoh)λmax(logε)461(2.20)nm，255(3.56)nm；hr-esi(+)ms：[m+h]⁺356.2344；分子式：c21h29n3o2；¹h和¹³c核磁數(shù)據(jù)見表1；經(jīng)hmbc相關(guān)譜解析確定化合物結(jié)構(gòu)如圖1所示。

表1.生物堿化合物1，2和3的氫碳核磁數(shù)據(jù)

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明生物堿化合物1，2和3的hmbc相關(guān)解析圖；

圖2為本發(fā)明生物堿化合物1的¹h-nmr圖；

圖3為本發(fā)明生物堿化合物1的¹³c-nmr圖；

圖4為本發(fā)明生物堿化合物1的hmbc核磁圖；

圖5為本發(fā)明生物堿化合物1的高分辨質(zhì)譜圖；

圖6為本發(fā)明生物堿化合物2的¹h-nmr圖；

圖7為本發(fā)明生物堿化合物2的¹³c-nmr圖；

圖8為本發(fā)明生物堿化合物2的hmbc核磁圖；

圖9為本發(fā)明生物堿化合物2的高分辨質(zhì)譜圖；

圖10為本發(fā)明生物堿化合物3的¹h-nmr圖；

圖11為本發(fā)明生物堿化合物3的¹³c-nmr圖。

圖12為本發(fā)明生物堿化合物3的hmbc核磁圖；

圖13為本發(fā)明生物堿化合物3的高分辨質(zhì)譜圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

a、將粉碎的天山堇菜全草粉末9.5kg，加入20升無(wú)水甲醇溶液室溫浸泡24小時(shí)，重復(fù)提取10次，合并提取液并干燥，得到總提物1.5kg；

b、將步驟a中的總提物用4升氯仿溶解，加入4升水萃取，收集氯仿層并干燥得到氯仿部位，再將氯仿部位用2升0.5n的硫酸溶解，過(guò)濾，收集濾液，濾液用乙酸乙酯萃取去除非生物堿雜質(zhì)，去雜質(zhì)后的酸水液用飽和碳酸氫鈉水溶液調(diào)ph10，得到堿化液；

c、將步驟b中的堿化液用二氯甲烷充分萃取并干燥得到總生物堿70克；

d、將步驟c中的總生物堿用體積比3:5:3:5的正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水的兩相溶劑系統(tǒng)進(jìn)行分配，收集上相有機(jī)相，干燥得到上相部位47克，再將上相部位進(jìn)行正相硅膠(100-200目)柱層析分段分離，以體積比100:0，85:15，70:30，55:45的環(huán)己烷:乙酸乙酯為洗脫溶劑進(jìn)行梯度洗脫，得到4個(gè)部位為v100，v85，v70和v55；

e、將步驟d中的v70部位以無(wú)水甲醇為溶劑，經(jīng)葡聚糖凝膠lh-20分離得到v70-1組分，將v70-1組分利用反相色譜柱：ymcpydrospherec185μm10×250mm；溶劑：濃度為34％的乙腈水溶液；流速：4.0ml/min進(jìn)行分離，分別收集并干燥2.5分鐘至6.5分鐘的流份(v70-1-1)，18.5分鐘至19.5分鐘的流份(v70-1-6)，以及20分鐘至21分鐘的流份(v70-1-7)，將流份v70-1-1繼續(xù)用反相色譜柱：ymcpydrospherec185μm10×250mm；溶劑：濃度為37％的甲醇水溶液；流速：3.1ml/min進(jìn)行純化，收集50至53分鐘的流份，干燥即得化合物3天山堇啶；將流份v70-1-6繼續(xù)用反相色譜柱：ymcpydrospherec185μm10×250mm；溶劑：濃度為59％的甲醇水溶液；流速：2.8ml/min進(jìn)行純化，收集21.5至23分鐘的流份，干燥既得化合物2天山堇寧b；再將流份v70-1-7繼續(xù)用反相色譜柱：ymcpydrospherec185μm10×250mm；溶劑：濃度為52.8％的甲醇水溶液；流速：4.0ml/min進(jìn)行純化，收集31.5至33.5分鐘的流份，干燥既得化合物1天山堇寧a。

實(shí)施例2

a、將粉碎的天山堇菜全草粉末9.5kg，加入20升無(wú)水甲醇回流4小時(shí)，重復(fù)提取6次，合并提取液并干燥，得到總提物2.0kg；

b、將步驟a中的總提物用4升氯仿溶解，加入4升水萃取，收集氯仿層并干燥得到氯仿部位，再將氯仿部位用2升0.5n的硫酸溶解，過(guò)濾，收集濾液，濾液用乙酸乙酯萃取去除非生物堿雜質(zhì)，去雜質(zhì)后的酸水液用飽和碳酸氫鈉水溶液調(diào)ph至11，得到堿化液；

c、將步驟b中的堿化液用二氯甲烷充分萃取并干燥得到總生物堿77克；

d、將步驟c中的總生物堿用體積比5:5:5:5的正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水的兩相溶劑系統(tǒng)進(jìn)行分配，收集上相有機(jī)相，干燥得到上相部位32克，再將上相部位進(jìn)行正相硅膠(100-200目)柱層析分段分離，以體積比100:0，85:15，70:30，55:45的環(huán)己烷:乙酸乙酯為洗脫溶劑進(jìn)行梯度洗脫，得到4個(gè)部位為v100，v85，v70和v55；

e、將步驟d中的v70部位以無(wú)水甲醇為溶劑，經(jīng)葡聚糖凝膠lh-20分離得到v70-1組分，將v70-1組分利用反相色譜柱：ymcpydrospherec185μm10×250mm；溶劑：濃度為34％的乙腈水溶液；流速：4.0ml/min進(jìn)行分離，分別收集并干燥2.5分鐘至6.5分鐘的流份(v70-1-1)，18.5分鐘至19.5分鐘的流份(v70-1-6)，以及20分鐘至21分鐘的流份(v70-1-7)，將流份v70-1-1繼續(xù)用反相色譜柱：ymcpydrospherec185μm10×250mm；溶劑：濃度為37％的甲醇水溶液；流速：3.1ml/min進(jìn)行純化，收集50至53分鐘的流份，干燥即得化合物3天山堇啶；將流份v70-1-6繼續(xù)用反相色譜柱：ymcpydrospherec185μm10×250mm；溶劑：濃度為59％的甲醇水溶液；流速：2.8ml/min進(jìn)行純化，收集21.5至23分鐘的流份，干燥既得化合物2天山堇寧b；再將流份v70-1-7繼續(xù)用反相色譜柱：ymcpydrospherec185μm10×250mm；溶劑：濃度為52.8％的甲醇水溶液；流速：4.0ml/min進(jìn)行純化，收集31.5至33.5分鐘的流份，干燥既得化合物1天山堇寧a。

實(shí)施例3

a、將粉碎的天山堇菜全草粉末9.5kg，加入20升無(wú)水甲醇溶液滲漉24小時(shí)，重復(fù)提取8次，合并提取液并干燥，得到總提物1.7kg；

b、將步驟a中的總提取物用4升氯仿溶解，加入4升水進(jìn)行萃取，收集氯仿層并干燥得氯仿部位，再將氯仿部位用0.5n的硫酸溶解，過(guò)濾，收集濾液，濾液用乙酸乙酯萃取以去除非生物堿雜質(zhì)，去雜質(zhì)的濾液用飽和碳酸氫鈉水溶液調(diào)ph至12，得到堿化液；

c、將步驟b中的堿化液用二氯甲烷充分萃取并干燥，得到總生物堿72克；

d、將步驟c中的總生物堿用體積比1:5:1:5的正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水的兩相溶劑系統(tǒng)進(jìn)行分配，收集上相有機(jī)相，干燥得到上相部位55克，再將上相部位進(jìn)行正相硅膠(100-200目)柱層析分段分離，以體積比100:0，85:15，70:30，55:45的環(huán)己烷:乙酸乙酯為洗脫溶劑進(jìn)行梯度洗脫，得到4個(gè)部位為v100，v85，v70和v55；

e、將步驟d中的v70部位以無(wú)水甲醇為溶劑，經(jīng)葡聚糖凝膠lh-20分離得到v70-1組分，將v70-1組分利用反相色譜柱：ymcpydrospherec185μm10×250mm；溶劑：濃度為34％的乙腈水溶液；流速：4.0ml/min進(jìn)行分離，分別收集并干燥2.5分鐘至6.5分鐘的流份(v70-1-1)，18.5分鐘至19.5分鐘的流份(v70-1-6)，以及20分鐘至21分鐘的流份(v70-1-7)，將流份v70-1-1繼續(xù)用反相色譜柱：ymcpydrospherec185μm10×250mm；溶劑：濃度為37％的甲醇水溶液；流速：3.1ml/min進(jìn)行純化，收集50至53分鐘的流份，干燥即得化合物3天山堇啶；將流份v70-1-6繼續(xù)用反相色譜柱：ymcpydrospherec185μm10×250mm；溶劑：濃度為59％的甲醇水溶液；流速：2.8ml/min進(jìn)行純化，收集21.5至23分鐘的流份，干燥既得化合物2天山堇寧b；再將流份v70-1-7繼續(xù)用反相色譜柱：ymcpydrospherec185μm10×250mm；溶劑：濃度為52.8％的甲醇水溶液；流速：4.0ml/min進(jìn)行純化，收集31.5至33.5分鐘的流份，干燥既得化合物1天山堇寧a。

實(shí)施例4

a、將粉碎的天山堇菜全草粉末9.5kg，加入20升無(wú)水甲醇超聲3小時(shí)，重復(fù)提取4次，合并提取液并干燥，得到總提物1.55kg；

b、將步驟a中的總提取物用4升氯仿溶解，加入4升水進(jìn)行萃取，收集氯仿層并干燥得氯仿部位，再將氯仿部位用0.5n的硫酸溶解過(guò)濾，收集濾液，濾液用乙酸乙酯萃取以去除非生物堿雜質(zhì)，去雜質(zhì)的濾液用飽和碳酸氫鈉水溶液調(diào)ph至13，得到堿化液；

c、將步驟b中的堿化液用二氯甲烷充分萃取并干燥，得到總生物堿64克；

d、將步驟c中的總生物堿用體積比2:5:2:5的正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水的兩相溶劑系統(tǒng)進(jìn)行分配，收集上相有機(jī)相，干燥得到上相部位49克，再將上相部位進(jìn)行正相硅膠(100-200目)柱層析分段分離，以體積比100:0，85:15，70:30，55:45的環(huán)己烷:乙酸乙酯為洗脫溶劑進(jìn)行梯度洗脫，得到4個(gè)部位為v100，v85，v70和v55；

e、將步驟d中的v70部位以無(wú)水甲醇為溶劑，經(jīng)葡聚糖凝膠lh-20分離得到v70-1組分，將v70-1組分利用反相色譜柱：ymcpydrospherec185μm10×250mm；溶劑：濃度為34％的乙腈水溶液；流速：4.0ml/min進(jìn)行分離，分別收集并干燥2.5分鐘至6.5分鐘的流份(v70-1-1)，18.5分鐘至19.5分鐘的流份(v70-1-6)，以及20分鐘至21分鐘的流份(v70-1-7)，將流份v70-1-1繼續(xù)用反相色譜柱：ymcpydrospherec185μm10×250mm；溶劑：濃度為37％的甲醇水溶液；流速：3.1ml/min進(jìn)行純化，收集50至53分鐘的流份，干燥即得化合物3天山堇啶；將流份v70-1-6繼續(xù)用反相色譜柱：ymcpydrospherec185μm10×250mm；溶劑：濃度為59％的甲醇水溶液；流速：2.8ml/min進(jìn)行純化，收集21.5至23分鐘的流份，干燥既得化合物2天山堇寧b；再將流份v70-1-7繼續(xù)用反相色譜柱：ymcpydrospherec185μm10×250mm；溶劑：濃度為52.8％的甲醇水溶液；流速：4.0ml/min進(jìn)行純化，收集31.5至33.5分鐘的流份，干燥既得化合物1天山堇寧a。

實(shí)施例5

a、將粉碎的天山堇菜全草粉末9.5kg，加入20升無(wú)水甲醇微波1小時(shí)，重復(fù)提取2次，合并提取液并干燥，得到總提物1.1kg；

b、將步驟a中的總提取物用4升氯仿溶解，加入4升水進(jìn)行萃取，收集氯仿層并干燥得氯仿部位，再將氯仿部位用0.5n的硫酸溶解過(guò)濾，收集濾液，濾液用乙酸乙酯萃取以去除非生物堿雜質(zhì)，去雜質(zhì)的濾液用飽和碳酸氫鈉水溶液調(diào)ph至14，得到堿化液；

c、將步驟b中的堿化液用二氯甲烷充分萃取并干燥，得到總生物堿48克；

d、將步驟c中的總生物堿用體積比4:5:4:5的正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水的兩相溶劑系統(tǒng)進(jìn)行分配，收集上相有機(jī)相，干燥得到上相部位25克，再將上相部位進(jìn)行正相硅膠(100-200目)柱層析分段分離，以體積比100:0，85:15，70:30，55:45的環(huán)己烷:乙酸乙酯為洗脫溶劑進(jìn)行梯度洗脫，得到4個(gè)部位為v100，v85，v70和v55；

e、將步驟d中的v70部位以無(wú)水甲醇為溶劑，經(jīng)葡聚糖凝膠lh-20分離得到v70-1組分，將v70-1組分利用反相色譜柱：ymcpydrospherec185μm10×250mm；溶劑：濃度為34％的乙腈水溶液；流速：4.0ml/min進(jìn)行分離，分別收集并干燥2.5分鐘至6.5分鐘的流份(v70-1-1)，18.5分鐘至19.5分鐘的流份(v70-1-6)，以及20分鐘至21分鐘的流份(v70-1-7)，將流份v70-1-1繼續(xù)用反相色譜柱：ymcpydrospherec185μm10×250mm；溶劑：濃度為37％的甲醇水溶液；流速：3.1ml/min進(jìn)行純化，收集50至53分鐘的流份，干燥即得化合物3天山堇啶；將流份v70-1-6繼續(xù)用反相色譜柱：ymcpydrospherec185μm10×250mm；溶劑：濃度為59％的甲醇水溶液；流速：2.8ml/min進(jìn)行純化，收集21.5至23分鐘的流份，干燥既得化合物2天山堇寧b；再將流份v70-1-7繼續(xù)用反相色譜柱：ymcpydrospherec185μm10×250mm；溶劑：濃度為52.8％的甲醇水溶液；流速：4.0ml/min進(jìn)行純化，收集31.5至33.5分鐘的流份，干燥既得化合物1天山堇寧a。