本發(fā)明涉及呋喃并[2,3-d]嘧啶-4-胺衍生物。
背景技術(shù)：
：伴隨著人們生活環(huán)境的日益惡化，精神壓力的不斷提高，全球腫瘤患者逐年增多，但是傳統(tǒng)常用的治療腫瘤的化學(xué)藥物選擇性差、毒副作用強(qiáng)且耐藥問題比較嚴(yán)重，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足治療要求。因此，研發(fā)高效、低毒的抗腫瘤新藥在當(dāng)前藥物研發(fā)領(lǐng)域中十分重要。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和對發(fā)病機(jī)制從細(xì)胞、分子水平的進(jìn)一步認(rèn)識，以腫瘤發(fā)生發(fā)展信號通路中的關(guān)鍵酶為靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)高效、低毒的抗癌藥物已成為重要的研究方向。腫瘤的分子靶向治療不同于傳統(tǒng)的腫瘤治療方法，它是建立在腫瘤分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)上，對腫瘤生長的關(guān)鍵通路采用小分子化合物阻斷其關(guān)鍵酶，從而達(dá)到阻斷腫瘤細(xì)胞生長的作用。分子靶向治療具有較好的選擇性，，減少對正常組織的損傷，而這正是傳統(tǒng)化學(xué)藥物治療難以實(shí)現(xiàn)的。在眾多的抗腫瘤藥物靶點(diǎn)中，表皮生長因子受體(egfr)，也就是一個(gè)蛋白酪氨酸激酶(rtk)受體，是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長，增殖，存活及遷移的信號通路的重要因子。癌癥臨床研究表明,這些受體及其配體與很多腫瘤都有重要聯(lián)系,很多癌癥出現(xiàn)了相關(guān)生長因子的過量表達(dá),導(dǎo)致過量的酪氨酸磷酸化信號傳入細(xì)胞.在腫瘤組織中nrptks常被激活,再激活下游的信號傳導(dǎo)途徑,促進(jìn)細(xì)胞增殖、抵抗細(xì)胞凋亡,促使腫瘤發(fā)生和發(fā)展[summy,j.m.；gallick,g.e.clin.cancerrev.2006,12,1398.].最普遍的激活突變表現(xiàn)在l858r，外顯子21的單點(diǎn)替換和外顯子19的刪除(dele746-a750)。第一代可逆的表皮生長因子受體抑制劑吉非替尼和埃羅替尼。對身體里有這些特定的激活突變的病人表現(xiàn)出了顯著的臨床反應(yīng)(50-80％)。然而，對于這些藥物產(chǎn)生繼發(fā)性耐藥突變的病人會(huì)在幾個(gè)月內(nèi)遭受癌癥的復(fù)發(fā)。第二代表皮生長因子受體抑制劑包括來那替尼，達(dá)克替尼，阿法替尼這些藥物的結(jié)構(gòu)中都含有親電的基團(tuán)michael-受體。其中以阿法替尼為藥物代表為例，烯丙酰胺結(jié)構(gòu)對阿法替尼的抗腫瘤活性起著至關(guān)重要的作用，它作為邁克爾受體與egfr上半胱氨酸殘基(cys797)的催化部位(親核的巰基)發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)，使激酶失活，不可逆地抑制酪氨酸激酶的活性，因而具有良好的耐受性。研究者們通過大量的光譜分析進(jìn)一步證明了這些共價(jià)鍵的存在，并且發(fā)現(xiàn)了阿法替尼通過與her2的cys805以及her4的cys803作用進(jìn)而強(qiáng)力抑制這些酶。在對野生型egfr體外測試顯示，阿法替尼在對野生型egfr與l858r/t790m雙突變型的抑制作用與吉非替尼、埃羅替尼以及拉帕替尼相比有著更好的效果。此外，阿法替尼對her4的抑制作用高于拉帕替尼30倍，高于吉非替尼300倍，高于埃羅替尼500倍。盡管阿法替尼在療效上優(yōu)于吉非替尼與埃羅替尼等，但其不良反應(yīng)與之相比也有所提高。阿法替尼的不良反應(yīng)較多，其中腹瀉、皮疹、口腔炎癥、甲溝炎、食欲下降、鼻出血、瘙癢、皮膚干燥十分常見，脫水、味覺改變、膀胱炎、唇炎、發(fā)熱、鼻塞、低血鉀、結(jié)膜炎、轉(zhuǎn)氨酶升高、手足綜合征、肌肉痙攣與腎損傷常見，角膜炎與肺炎偶見。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為解決上述問題，本發(fā)明提供了式(ⅰ)所示的化合物、或其立體異構(gòu)體、或其藥學(xué)上可接受的鹽、或其溶劑合物：其中，r1選自a類基團(tuán)，r2選自b類基團(tuán)；或者，r1選自b類基團(tuán)，r2選自a類基團(tuán)；所述a類基團(tuán)選自苯基或雜芳基，其中所述苯基或雜芳基分別獨(dú)立地任選進(jìn)一步被鹵素、c1-c6的烷基、c1-c6的烷氧基、c1-c6的鹵代烷基所取代；所述b類基團(tuán)選自其中m為0或1，n為0或1，且m和n不同時(shí)為0；x表示x的苯基端與嘧啶并呋喃環(huán)的呋喃環(huán)相連；y表示當(dāng)m為0時(shí)，y的苯基端與嘧啶并呋喃環(huán)的呋喃環(huán)相連；當(dāng)m不為0時(shí)，y的苯基端與x相連；z選自氫、鹵素、芳基或-n(ra)(rb)；ra和rb分別獨(dú)立地選自c1-c6的烷基；或者，ra和rb共同與它們相連接的氮原子一起形成飽和雜環(huán)基，所述飽和雜環(huán)基任選進(jìn)一步被羥基或c1-c6的烷基所取代；r3、r4分別獨(dú)立地選自氫、苯基或-c(o)rc，其中所述苯基任選進(jìn)一步被一個(gè)或多個(gè)鹵素所取代，rc選自c1-c6的烷基；r5選自氫或-so2-rd，其中rd選自c1-c6的烷基。進(jìn)一步地，r3和r4同時(shí)為氫。進(jìn)一步地，r5為氫。進(jìn)一步地，所述化合物如下式(ⅰa)所示：進(jìn)一步地，當(dāng)a類基團(tuán)選自雜芳基時(shí)，所述雜芳基為5元環(huán)或6元環(huán)。進(jìn)一步地，所述雜芳基選自吡啶基或吡咯基。進(jìn)一步地，當(dāng)a類基團(tuán)選自取代的苯基時(shí)，取代基選自氟、氯、溴、c1-c3的烷基、甲氧基、三氟甲基中的任一種或多種。進(jìn)一步地，所述x或y表示的結(jié)構(gòu)中，苯基上的取代基位于該苯基的3位或4位。進(jìn)一步地，當(dāng)a類基團(tuán)選自取代的苯基或取代的雜芳基時(shí)，取代基的數(shù)量為1～3。進(jìn)一步地，當(dāng)z選自芳基時(shí)，該芳基為苯基、氨基取代的苯基或硝基取代的苯基。進(jìn)一步地，當(dāng)ra和rb共同與它們相連接的氮原子一起形成飽和雜環(huán)基時(shí)，所述飽和雜環(huán)基為6元環(huán)。進(jìn)一步地，所述飽和雜環(huán)基為哌啶基、嗎啉基或哌嗪基。進(jìn)一步地，當(dāng)ra和rb共同與它們相連接的原子一起形成飽和雜環(huán)基時(shí)，所述飽和雜環(huán)基進(jìn)一步被羥基、c1-c6的烷基或-nh-pg所取代，其中pg表示氨基保護(hù)基。進(jìn)一步地，所述化合物為如下化合物之一：本發(fā)明還提供了前述的化合物、或其立體異構(gòu)體、或其藥學(xué)上可接受的鹽、或其溶劑合物在制備抗腫瘤藥物、血管生成抑制劑、efgr激酶抑制劑或aura激酶抑制劑中中的用途。進(jìn)一步地，所述腫瘤為肝癌、肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤、星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、宮頸癌、結(jié)腸癌或乳腺癌。本發(fā)明中：所述“立體異構(gòu)體”包括立體中心(例如帶有4個(gè)不同取代基的碳)、軸不對稱例如有關(guān)鍵、平面不對稱及其混合物的存在。立體異構(gòu)體包括對映體、非對映體、差向異構(gòu)體、外消旋體和具有內(nèi)部對稱面的內(nèi)消旋化合物。所述“藥學(xué)上可接受的”是指某載體、運(yùn)載物、稀釋劑、輔料，和/或所形成的鹽通常在化學(xué)上或物理上與構(gòu)成某藥物劑型的其它成分相兼容，并在生理上與受體相兼容。所述c1-c6的烷基是指c1、c2、c3、c4、c5、c6的烷基，即具有1～6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈的烷基，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、仲丁基、戊基、己基等等?！鞍被Ｗo(hù)基”將指可連接至氨基上的氮原子從而保護(hù)所述氨基不參與反應(yīng)并且其可在后面的反應(yīng)中容易地除去的基團(tuán)。合適的氨基保護(hù)基包括，但不限于下述保護(hù)基：式-c(o)o-r的氨基甲酸酯基團(tuán)，其中r例如甲基、乙基、叔丁基、芐基、苯乙基、ch2＝ch-ch2-，等等；式-c(o)-r′的酰胺基團(tuán)，其中r′例如甲基、乙基、苯基、三氟甲基，等等；式-so2-r″的n-磺?；苌?基團(tuán)，其中r″例如甲苯基、苯基、三氟甲基、2，2，5，7，8-五甲基色滿-6-基-、2，3，6-三甲基-4-甲氧基苯，等等。試驗(yàn)結(jié)果顯示，本發(fā)明化合物可用于制備抗腫瘤藥物、血管生成抑制劑或efgr激酶抑制劑。顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。以下通過實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。附圖說明圖1為本發(fā)明化合物對肝癌hepg2細(xì)胞抑制活性測試結(jié)果如圖1所示。圖2為本發(fā)明化合物對肺癌a549細(xì)胞抑制活性測試結(jié)果如圖2所示具體實(shí)施方式本發(fā)明化合物及中間體主要按照下述路線制備得到：方案一：中間體i和ii的合成方法參照文獻(xiàn)bioorganic&medicinalchemistryletters15(2005)2203–2207。中間體(e)-4-溴丁-2-烯酰氯iii的合成：將(e)-4-溴巴豆酸甲酯(6g，33.5mmol)溶于thf(60ml)冷去至0℃，在n2保護(hù)下滴加入一水合氫氧化鋰(1.83g，43.6mmol)的水溶液(20ml)。15min滴完后，保持0℃攪拌3h。然后將冷水(150ml)和石油醚(200ml)加入該體系在0℃繼續(xù)攪拌10min。分離水相，在0℃用濃鹽酸調(diào)節(jié)ph至1，再用二氯甲烷(80mlx3)萃取。合并有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥后濃縮，得到e-4-溴巴豆酸iii,黃色固體(4.5g，收率82％)。在混有e-4-溴巴豆酸iii和1滴dmf的dcm(3ml)溶液中滴加入草酰氯(250mg，1.96mmol)。滴加完后，升至室溫?cái)嚢?h。反應(yīng)結(jié)束，濃縮溶劑，得到中間體(e)-4-溴丁-2-烯酰氯iv，無需進(jìn)一步處理，直接用于下一步反應(yīng)。方案二：方案三：參照文獻(xiàn)wo2005121149a1可以合成得到中間體xii。方案四：方案五實(shí)施例1化合物c-14的制備將中間體i(1g,3.01mmol)溶于thf，加入三乙胺(0.6g,6.02mmo)，然后滴加入氯乙酰氯(0.37g,3.31mmol)。液相監(jiān)測反應(yīng)完全后，滴入3滴水淬滅反應(yīng)，濃縮溶劑。在殘留物中加入水，二氯甲烷萃取，合并有機(jī)相。飽和氯化銨洗滌有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥，濃縮溶劑。殘留物進(jìn)行柱色譜分離，得到化合物0.88g，白色固體(收率72％)。1hnmr(400mhz，cdcl3)δppm:3.80(s,3h),4.25(s,2h),6.81-6.83(d，j＝9.2hz,2h),7.46-7.51(m，4h)，7.73-7.76(d，j＝7.6hz,1h)，8.37(s，1h)，8.3,9(s，1h)。實(shí)施例2化合物c-13的制備將碳酸鉀(0.89g,6.47mmol)加化合物c-14(0.88g，2.15mmol)的乙腈，然后加入二甲胺鹽酸鹽(0.17g,2.15mmol)，tlc監(jiān)測反應(yīng)，攪拌5h。反應(yīng)結(jié)束，抽慮，少量乙腈洗滌固體，濃縮母液。將殘留物進(jìn)行柱色譜分離，得到化合物0.55g(收率61％)。1hnmr(dmso)δ:9.33(s,1h),8.36(s,1h),7.76-7.78(m，2h),7.45-7.49(m，4h),6.80-6.84(m,2h),4.93(s,2h),3.80(s,3h),3.14(s,2h),2.43(s,6h)；實(shí)施例3化合物c-11的制備其制備方法參照實(shí)施例2，原料為c-14和n-甲基哌嗪，產(chǎn)物為白色固體，收率60％。1hnmr(dmso)δ:9.33(s,1h),8.36(s,1h),7.74-7.76(m，2h),7.46-7.52(m，4h),6.81-6.83(m,2h),4.92(s,2h),3.80(s,3h),3.20(s,2h),2.51-2.71(m,8h),2.35(s,3h)；實(shí)施例4化合物c-5的制備將中間體i0.5g(1.08mmol)溶于thf，加入三乙胺0.22g(2.18mmol)，然后滴加入上述制備得到的(e)-4-溴丁-2-烯酰氯iv0.195g(1.08mmol)。液相監(jiān)測反應(yīng)完全后，濃縮溶劑。在殘留物中加入水，二氯甲烷萃取，合并有機(jī)相。飽和氯化銨洗滌有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥，濃縮溶劑，得到中間體iv白色固體無需進(jìn)一步處理，直接用于下一步。將碳酸鉀0.60g(4.32mmol)加入上述制備得到的中間體v的乙腈溶液中，然后加入二甲胺鹽酸鹽0.089g(1.08mmol)，tlc監(jiān)測反應(yīng)，攪拌5h。反應(yīng)結(jié)束，抽慮，少量乙腈洗滌固體，濃縮母液。將殘留物進(jìn)行柱色譜分離純化(二氯甲烷/甲醇作洗脫劑)，得到白色固體(c-5)0.40g，收率64％。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm:2.45(s,6h),3.44(s,2h),3.75(s,3h),6.38-6.42(d，j＝15.2hz,1h)，6.75-6.79(m，1h),6.93-6.95(d，j＝8.8hz,1h),7.37-7.39(d，j＝8.8hz,2h),7.43-7.45(d，j＝8.4hz,2h)，7.84-7.86(d,j＝8.8hz，2h)，8.23(s，1h),10.40(s，1h)。實(shí)施例5化合物c-1的制備其制備方法參照實(shí)施例4中間體v的合成，原料為中間體i和丙烯酰氯，產(chǎn)物為白色固體，收率72％。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm:3.80(s,3h),4.92(s,2h),5.84-5.87(dd，j＝10.0hz,1.2hz,1h)，6.31-6.32(dd，j＝16.8hz,10.0hz,1h),6.47(d，j＝2.0hz,1h),6.49-6.51(dd，j＝16.8hz,1.2hz,1h),6.80-6.83(d，j＝12.0hz，2h),7.42(s，1h),7.46-7.50(m，4h)，7.76-7.78(d,j＝8.8hz，2h)，8.36(s，1h)。實(shí)施例6化合物c-6的制備其制備方法參照實(shí)施例4的合成，原料為中間體ii和哌啶，產(chǎn)物為白色固體，收率59％。1hnmr(400mhz，cdcl3)δppm:1.47(m,2h),1.61-1.64(m,4h),2.45(s,4h),3.17-3.19(dd,j＝5.6hz,2h),3.80(s,3h),4.90(s,2h),6.13-6.17(d，j＝15.2hz,1h)，6.80-6.82(d，j＝8.0hz,2h),6.99-7.07(m，1h),7.36(s，1h),7.45-7.49(m，4h)，7.73-7.75(d,j＝8.4hz，2h)，8.36(s，1h)。實(shí)施例7化合物c-4的制備其制備方法參照實(shí)施例4中間體v的合成，原料為中間體ii和丙烯酰氯，產(chǎn)物為白色固體，收率66％。1hnmr(400mhz，cdcl3)δppm:3.80(s,3h),5.17(s,2h),5.81-5.84(d，j＝11.2hz,1h)，6.23-6.29(dd，j＝16.8hz,10.0hz,1h),6.44-6.48(d，j＝16.8hz,1h),6.81-6.83(d，j＝8.8hz,2h),7.24(s，1h),7.42(s，1h),7.44-7.51(m，4h)，7.65(s,1h)，7.74-7.76(d，j＝7.6hz,1h)，8.35(s，1h)。實(shí)施例8化合物c-7的制備其制備方法參照實(shí)施例4的合成，原料為中間體ii和n-甲基哌嗪，產(chǎn)物為白色固體，收率63％。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm:2.15bs,3h),2.34(s,6h),3.10-3.11(d，j＝4.8hz,2h)，3.75(s,3h),6.24-6.28(d，j＝15.6hz,1h)，6.68-6.74(m，1h),6.93-6.95(d，j＝9.2hz,2h),7.15-7.17(d，j＝7.6hz,1h),7.38-7.41(d，j＝9.2hz,2h)，7.48-7.52(d，j＝8.4hz,7.6hz,1h)，7.78-7.80(m,2h)，8.24(s，1h),10.25(s，1h)。實(shí)施例9化合物c-6的制備其制備方法參照實(shí)施例4的合成，原料為中間體ii和二甲胺，產(chǎn)物為白色固體，收率58％。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm:2.72(s,6h),3.75(s,3h),3.87-3.88(d,j＝5.2hz,2h),6.47-6.51(d，j＝15.2hz,1h)，6.75-6.80(m，1h),6.93-6.95(d，j＝9.2hz,2h),7.19-7.21(d，j＝7.6hz,1h),7.38-7.41(d，j＝9.2hz,2h)，7.51-7.55(t，j＝8.0hz,1h)，7.82-7.85(m，2h)，8.25(s，1h),10.67(s，1h)。實(shí)施例10化合物c-16的制備其制備方法參照實(shí)施例4的合成，原料為中間體ii和哌啶，產(chǎn)物為白色固體，收率58％。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm:1.38-1.52(s,6h),2.34(s,4h),3.10-3.11(d，j＝4.8hz,2h)，3.75(s,3h),6.23-6.27(d，j＝15.2hz,1h)，6.68-6.72(m，1h),6.93-6.95(d，j＝8.8hz,2h),7.15-7.17(d，j＝7.6hz,1h),7.39-7.41(d，j＝8.8hz,2h)，7.48-7.52(d，j＝8.4hz,8.0hz,1h)，7.79(s,2h)，8.25(s，1h),10.25(s，1h)。實(shí)施例11化合物c-18的制備其制備方法參照實(shí)施例4的合成，原料為中間體ii和嗎啉，產(chǎn)物為白色固體，收率60％。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm:2.40(s,6h),2.34(s,2h),3.10-3.11(t，j＝4.4hz,4h)，3.74(s,3h),6.31-6.35(d，j＝15.6hz,1h)，6.74-6.79(m，1h),6.92-6.94(d，j＝8.8hz,2h),7.37-7.38(d，j＝9.2hz,2h),7.42-7.44(d，j＝8.4hz,2h)，7.83-7.85(d，j＝8.8hz,2h)，8.23(s,2h)，10.30(s，1h)。實(shí)施例12化合物c-21的制備其制備方法參照實(shí)施例4的合成，原料為中間體i和嗎啉，產(chǎn)物為白色固體，收率61％。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm:10.31(s,1h),8.24(s,1h),7.86-7.83(d,j＝8.4hz,2h),7.44-7.37(m,4h),6.95-6.92(d,j＝8.8hz,2h),6.79-6.74(m,1h),6.35-6.31(d,j＝15.2hz,1h),3.75(s,3h),3.63-3.60(j＝4.4hz,j＝4.4hz,4h),3.15-3.14(d,j＝5.6hz,2h),2.41(m,4h)。實(shí)施例13化合物c-20的制備向中間體(i)(3.32g,10mmol)的四氫呋喃(50ml)溶液中依次加入乙胺2.53g(25mmol)，間硝基苯異氰酸酯1.64g(10mmol)，加畢，室溫反應(yīng)30min后，濃縮溶劑得粗產(chǎn)品。粗產(chǎn)品乙酸乙酯打漿，抽慮，干燥，得化合物淡黃色固體4.46g，收率90％。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm:3.75(s,3h),6.96-6.94(d,j＝9.2hz,2h),7.44-7.40(m,4h),7.61-7.57(q,j＝8.4hz,j＝8.0hz,1h),7.69-7.66(d,j＝8.4hz,2h),7.76-7.74(d,j＝8.0hz,1h),7.86-7.84(d,j＝8.4hz,1h),8.24(s,1h),8.35(s,1h),8.59-8.58(q,j＝2.4hz,j＝2hz,1h),9.11(s,1h),9.33(s,1h).實(shí)施例14化合物c-9的制備其制備方法參照實(shí)施例13的合成，原料為中間體ii和間硝基苯異氰酸酯，產(chǎn)物為淡黃色固體，收率83％。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm:3.76(s,3h),6.94-6.96(d,j＝8.8hz,2h),7.06-7.15(m,3h),7.41-7.63(m,4h),7.70-7.73(d,j＝8.8hz,2h),8.27(s,1h),8.59-8.58(t,j＝2.4hz,j＝2hz,1h),9.07(s,1h),9.29(s,1h)。實(shí)施例15化合物c-22的制備將實(shí)施例13化合物(1.32g，2.66mmol)加入10ml乙醇，10ml水及1.2ml醋酸的混合液后，升溫至70℃，加入0.62g鐵粉在該溫度繼續(xù)攪拌2h。反應(yīng)結(jié)束，抽慮，取母液濃縮。殘留物用氫氧化鈉水溶液調(diào)ph至9，加入乙酸乙酯50mlx3萃取。合并有機(jī)相，飽和氯化鈉洗滌，干燥有機(jī)相，濃縮至干，得粗產(chǎn)品。將粗產(chǎn)品用柱色譜分離純化(二氯甲烷/甲醇作洗脫劑)，得白色固體0.99g，產(chǎn)率80％。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm:3.75(s,3h),5.05(s,2h),6.21-6.20(d,j＝8.0hz,1h),6.59-6.57(d,j＝8.0hz),6.79(s,1h),6.96-6.89(m,3h),7.42-7.37(m,4h),7.64-7.62(d,j＝8.4hz,2h),8.23(s,1h),8.49(s,1h),8.84(s,1h).實(shí)施例16化合物c-10的制備其制備方法參照實(shí)施例15的合成，原料為實(shí)施例14，產(chǎn)物為白色固體，收率71％。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm:3.76(s,3h),5.02(s,2h),6.17-6.19(d，j＝8.0hz,,1h),6.52-6.55(d，j＝9.2hz,1h),6.75(s,1h),6.86-6.90(t，j＝8.0hz,1h),6.94-6.96(d，j＝9.2hz,2h),7.05-7.07(d,j＝7.6hz,1h),7.42-7.47(m，3h),7.54-7.56(d，j＝8.4hz,1h)，7.62(s，1h)，8.25(s，1h),8.42(s，1h),8.76(s，1h)。實(shí)施例17化合物c-24的制備制備方法參照實(shí)施4，原料為實(shí)施例15和二甲胺，產(chǎn)物為白色固體，收率53％。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm:10.15(s,1h),9.30(m,1h),9.15(m,1h),8.24(s,1h),7.85(s,1h),7.66-7.64(d,j＝8.8hz,2h),7.42-7.39(m,4h),7.35(m,1h),7.22-7.21(d,j＝5.2hz,2h),6.96-6.94(d,j＝7.6hz,2h),6.77-6.70(m,1h),6.35-6.31(d,j＝14.4hz,1h),3.75(s,3h),3,17(s,2h),2.26(s,6h)。實(shí)施例18化合物c-23的制備制備方法參照實(shí)施17，原料為實(shí)施例15和哌啶，產(chǎn)物為白色固體，收率55％。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm:1.54-1.40(m,6h),2.37-2.33(m,4h),3.10(s,2h),3.75(s,3h),6.31-6.27(d,j＝16.0hz,1h),6.76-6.70(m,1h),6.96-6.94(d,j＝8.8hz,2h),7.22-7.20(d,j＝6.4hz,2h),7.30(m,1h),7.42-7.39(m,4h),7.66-7.64(d,j＝8.4hz,2h),7.89(s,1h),8.24(s,1h),8.96-8.91(m,2h),10.08(s,1h)。實(shí)施例19化合物c-19的制備制備方法參照實(shí)施例17，原料為實(shí)施例16和哌啶，產(chǎn)物為白色固體，收率53％。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm:1hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm:1.39-1.52(m,6h),14.2.39(s,4h),3.07(s,2h),3.75(s,3h),6.24-6.28(d,j＝14.8hz,1h),6.68-6.75(m,1h),6.94-6.96(d,j＝8.8hz,2h),7.07-7.20(m,3h),7.28-7.30(d,j＝14.8hz,1h),7.41-7.48(m,3h),7.55-7.57(d,j＝8.4hz,2h),7.63(s,1h),7.84(s,1h),8.24(s,1h),8.78-8.82(d,j＝14hz,2h),10.08(s,1h)。實(shí)施例20化合物c-12的制備制備方法參照實(shí)施例17，原料為實(shí)施例16和丙烯酰氯，產(chǎn)物為白色固體，收率53％。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm:3.76(s,3h),5.73-5.76(m,1h),6.22-6.27(dd，j＝16.8hz,2.0hz,1h),6.41-6.47(dd，j＝16.8hz,10.0hz,1h),6.94-6.96(d，j＝7.2hz,2h),6.94-6.96(d，j＝7.6hz,1h),7.14-7.22(m,2h),7.31-7.33(d，j＝7.6hz,1h),7.41-7.49(m，3h)，7.56-7.58(d，j＝9.2hz,1h)，7.64(s，1h)，7.87(s，1h),7.87(s，1h),8.25(s，1h),8.84-8.87(d，j＝14.8hz,2h),10.12(s，1h)。實(shí)施例21化合物c-45的制備方法一該方法一參照實(shí)施例4的合成，原料為4-氟溴代苯乙酮，原料4-氟溴代苯乙酮和二甲胺鹽酸鹽，產(chǎn)物為白色固體。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm:2.22(s,6h),3.09-3.10(d，j＝4.8hz,2h),6.30-6.34(d，j＝15.2hz,1h)，6.74-6.80(m，1h),7.21-7.25(t，j＝9.2,6.8hz,2h),7.43-7.48(m，4h)，7.85-7.87(d,j＝8.8hz，2h)，8.26(s，1h),10.32(s，1h)。方法二方法二參照文獻(xiàn)w03022852a2可以合成得到中間體xi,參照可實(shí)施例4的合成方法由中間體xi合成得到實(shí)施例22。實(shí)施例22化合物c-32的制備原料4-溴代乙?；拎ず投装符}酸鹽，產(chǎn)物為白色固體，收率41％。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm:2.31(s,6h),3.26(s,2h),6.36-6.40(d,j＝15.2hz,1h),6.76-6.83(m,1h),7.41-7.44(m,1h),7.46-7.49(d,j＝12.4hz,2h),7.81-7.84(m,1h),7.88-7.90(d,j＝8.4hz,2h),8.30(s,1h),8.50-8.51(m,1h),8.57-8.58(d,j＝1.6hz,1h),10.45(s,1h)；實(shí)施例23化合物c-25的制備制備方法參照實(shí)施例21，原料4-氟溴代苯乙酮和3-叔丁氧羰基氨基哌啶，產(chǎn)物為白色固體，收率50％。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm:1.05-1.178(m，2h),1.38(s，9h),1.49-1.88(m,5h),2.69-2.81(m,2h),3.14-3.15(d,j＝5.2hz，2h),6.28-6.32(d，j＝15.2hz,1h)，6.74-6.80(m，2h),7.21-7.25(t，j＝9.2hz，8.8hz,1h),7.49-7.50(m，4h)，7.85-7.87(d,j＝8.4hz，2h)，8.26(s，1h),10.31(s，1h)。實(shí)施例24化合物c-27的制備制備方法參照實(shí)施例21，原料溴代苯乙酮和二甲胺鹽酸鹽，產(chǎn)物為白色固體，收率50％。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm:2.72(s,6h),3.87(d，j＝4.8hz,2h),6.55-6.59(d，j＝15.2hz,1h)，6.83-6.87(m，1h),7.32-7.46(m，7h),7.91-7.93(d,j＝8.4hz，2h)，8.27(s，1h),10.82(s，1h)。實(shí)施例25化合物c-28的制備制備方法參照實(shí)施例8，原料溴代苯乙酮和哌啶，產(chǎn)物為白色固體，收率51％。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm:1.40-1.532(m,6h),2.33-2.36(m,4h),3.10-3.11(d，j＝4.4hz,2h)，6.24-6.28(d,j＝15.6hz,1h),6.72-6.76(m，1h)，7.17-7.19(d，j＝7.6hz，1h),7.33-7.37(m,3h),7.46-7.53(m,3h),7.80(d，j＝6.4hz，2h),8.28(s，1h)，10.28(s，1h)。實(shí)施例26化合物c-29的制備制備方法參照實(shí)施例8，原料2-溴-1-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)乙酮和哌啶，產(chǎn)物為白色固體，收率43％。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm:1.50-1.70(m,6h),2.87(m,4h),3.65(m,2h),3.83(s,3h),6.46-6.50(d,j＝15.2hz,1h),6.82-6.87(m,1h),7.34(s,1h),7.46-7.48(d,j＝8.4hz,2h),7.88-7.91(q,j＝4.8hz,j＝4.8hz,3h),8.21(s,1h),10.59(s,1h)；實(shí)施例27化合物c-37的制備制備方法參照實(shí)施例21，原料4-氟溴代苯乙酮和哌啶，產(chǎn)物為白色固體，收率50％。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm:1.42-1.56(m,6h),2.49(s,4h),3.22(s,2h),6.32-6.35(d，j＝15.2hz,1h)，6.76-6.81(m，1h),7.21-7.25(t，j＝8.8hz,1h),7.44-7.48(m，4h)，7.85-7.87(d,j＝8.4hz，2h)，8.26(s，1h),10.34(s，1h)。實(shí)施例28化合物c-31的制備制備方法參照實(shí)施例8，原料溴代苯乙酮和4-羥基哌啶，產(chǎn)物為白色固體，收率50％。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm:1.35-1.45(m,2h),1.65-1.78(m,2h),1.95-2.15(m,2h),2.63-2.75(m,2h),3.16-3.17(d，j＝5.0hz,2h),4.60(m,2h),6.24-6.28(d，j＝15.6hz,1h)，6.71-6.77(m，1h),7.17-7.19(d，7.2hz,1h),7.33-7.53(m，5h)，7.80-7.81(m，2h),10.28(s，1h)。實(shí)施例29化合物c-30的制備制備方法參照實(shí)施例22，原料4-溴代乙?；拎ず瓦哙?，產(chǎn)物為白色固體，收率43％。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm:1.40(m,2h),1.52-1.55(m,4h),2.37(m,4h),3.10-3.12(d,j＝5.2hz,2h),6.29-6.33(d,j＝15.6hz,1h),6.75-6.82(m,1h),7.41-7.44(m,1h),7.45-7.49(d,j＝12.8hz,2h),7.82-7.84(m,1h),7.86-7.89(d,j＝8.8hz,2h),8.30(s,1h),8.50-8.51(m,1h),8.57-8.58(d,j＝1.6hz,1h),10.33(s,1h)。實(shí)施例30化合物c-33的制備制備方法參照實(shí)施例8，原料3-溴代苯乙酮和二甲胺鹽酸鹽，產(chǎn)物為白色固體，收率41％。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm:2.18(s,6h),3.05-3.06(d,j＝4.8hz,2h),3.86(s,3h),6.26-6.30(d,j＝15.6hz,1h),6.54(s,1h),6.70-6.76(m,1h),7.06-7.08(m,1h),7.17-7.19(d,j＝8.8hz,2h),7.25-7.30(m,2h),7.40(s,2h),7.65-7.67(d,j＝8.8hz,2h),8.09(s,1h),10.13(s,1h)。實(shí)施例31化合物c-35的制備制備方法參照實(shí)施例22，原料3,5-二三氟甲基溴代苯乙酮和哌啶，產(chǎn)物為白色固體，收率41％。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm:1.40(m,2h),1.50-1.51(m,4h),2.35(m,4h),3.08-3.09(d,j＝5.2hz,2h),6.23-6.27(d,j＝15.6hz,1h),6.71-6.76(m,1h),7.22-7.24(d,j＝7.6hz,1h),7.53-7.56(q,j＝7.6hz,j＝8.0hz,1h),7.79-7.81(d,j＝8.4hz,1h),7.91-7.94(m,3h),8.08(s,1h),8.34(s,1h),10.29(s,1h)。實(shí)施例32化合物c-43的制備制備方法參照實(shí)施例21，原料3,4,5-三甲氧基溴代苯乙酮和二甲胺，產(chǎn)物為白色固體，收率41％。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm:2.19(s，6h)，3.07-3.08(d，j＝5.2hz，2h),3.58(s,6h),3.65(s,3h),6.29-6.33(d,j＝15.6hz,1h),6.72(s,2h),6.76-6.80(m,1h),7.47-7.49(d,j＝8.8hz,2h),7.86-7.88(d,j＝8.4hz,2h),8.25(s,1h),10.30(s,1h)；實(shí)施例33化合物c-44的制備制備方法參照實(shí)施例21，原料3,4,5-三甲氧基溴代苯乙酮和哌啶，產(chǎn)物為白色固體，收率41％。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm:1.30(m,2h),1.52-1.55(m,4h),2.37(m,4h),3.10-3.12(d,j＝5.2hz,2h),3.58(s,6h),3.65(s,3h),6.28-6.32(d,j＝15.2hz,1h),6.72(s,2h),6.74-6.81(m,1h),7.47-7.49(d,j＝8.4hz,2h),7.86-7.88(d,8.4hz,2h),8.25(s,1h),10.29(s,1h)；實(shí)施例34化合物c-46的制備制備方法參照實(shí)施例21，原料溴代苯乙酮和哌啶，產(chǎn)物為白色固體，收率50％。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm:1.35-1.55(m,6h),2.29-2.39(m,4h),3.11(d，j＝4.8hz,2h),6.28-6.32(d，j＝15.2hz,1h)，6.75-6.80(m，1h),7.32-7.44(m，7h),7.85-7.87(d,j＝8.8hz，2h)，8.26(s，1h),10.30(s，1h)。實(shí)施例35化合物c-8的制備制備方法參照實(shí)施例21，原料3,4,5-三甲氧基溴代苯乙酮和哌啶，產(chǎn)物為白色固體，收率41％。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm:1.40-1.70(m,6h),2.87(m,4h),3.58(s，6h)，3.66(s，3h)，3.88(s,2h),6.43-6.47(d，j＝14.8hz,1h)，6.74(s，2h),6.77-6.82(m，1h),7.26-7.28(d，j＝7.6hz,1h),7.55-7.59(t，j＝8.07.6hz,7.6hz,1h)，7.80-7.82(d,j＝8.0hz，1h)，7.85(s，1h),8.28(s，1h),10.58(s，1h)。實(shí)施例36化合物c-15的制備制備方法參照實(shí)施例22，原料3,5-二三氟甲基溴代苯乙酮和二甲胺鹽酸鹽，產(chǎn)物為白色固體，收率41％。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm:2.17(s,6h),3.05-3.06(d,j＝4.8hz,2h),6.24-6.28(d,j＝15.2hz,1h)6.71-6.75(m,1h),7.22-7.24(d,j＝7.6hz,1h),7.52-7.56(q,j1＝j(luò)2＝8.0hz,1h),7.78-7.80(d,j＝8.0hz,1h),7.91-7.94(d,j＝12.4hz,3h),8.08(s,1h),8.34(s,1h),10.30(s,1h)。實(shí)施例37化合物c-17的制備制備方法參照實(shí)施例22，原料3,5-二三氟甲基溴代苯乙酮和哌啶，產(chǎn)物為白色固體，收率41％。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm:1.39-1.51(m,6h),2.25-2.39(m,4h),3.07-3.08(d,j＝5.2hz,2h),6.23-6.27(d,j＝15.2hz,1h)，6.72-6.75(m,1h),7.22-7.24(d,j＝7.6hz,1h),7.52-7.56(q,j＝8.0hz,7.6hz,1h),7.78-7.80(d,j＝8.4hz,1h),7.90-7.93(d,j＝12.4hz,3h),8.34(s,1h),8.34(s,1h),10.29(s,1h)。實(shí)施例38化合物c-40的制備制備方法參照實(shí)施例22，原料3-溴代噻吩乙酮和哌啶，產(chǎn)物為白色固體，收率41％。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm:1.43-1.54(m,6h),2.30-2.40(m,4h),3.14(s,2h),6.30-6.34(d,j＝15.2hz,1h)，6.75-6.82(m,1h),6.88-6.89(d,j＝5.2hz,1h)，7.45-7.47(d,j＝8.8hz,2h)，7.55-7.57(m,1h),7.69-7.70(m,1h),7.86-7.88(d,j＝8.8hz,2h),8.34(s,1h),8.24(s,1h),10.29(s,1h)。實(shí)施例39化合物c-2的制備制備方法參照實(shí)施例22，原料3-溴代噻吩乙酮和哌啶，產(chǎn)物為白色固體，收率41％。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm:1.40-1.65(m,9h),1.91(s,3h),2.20-2.25(m,3h),2.37-2.46(m,4h),2.99-3.02(t,j＝6.0hz,5.2hz,3h),2.56-3.59(m,4h),6.32-6.35(d,j＝15.2hz,1h)，6.76-6.85(m,1h),7.42-7.53(d,j＝8.4hz,2h),7.50-7.51(d,j＝9.2hz,2h),7.84-7.86(d,j＝8.4hz,1h),8.14-8.15(d,j＝2.4hz,1h),8.22(s,1h),10.29(s,1h)。實(shí)施例40化合物c-47的制備制備方法參照實(shí)施例21，原料3,4-二甲氧基溴代苯乙酮和哌啶，產(chǎn)物為白色固體，收率41％。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm:2.19(s,6h),3.08-3.09(d,j＝5.6hz,2h),3.55(s,3h),3.74(s,3h),6.29-6.33(d,j＝15.2hz,1h),6.74-6.79(m,1h),6.94-7.03(m,3h),7.44-7.46(q,j＝8.4hz,2h),7.84-7.86(d,j＝8.4hz,2h),8.24(s,1h),10.31(s,1h)；實(shí)施例41化合物c-36的制備制備方法參照實(shí)施例21，原料3,5-二甲氧基溴代苯乙酮和哌啶，產(chǎn)物為白色固體，收率41％。實(shí)施例42化合物c-39的制備將中間體xii(100mg，0.26mmol)溶于14ml異丙醇后，加入(69mg，0.31mmol)(r)-(-)-1-苯甲基-3-氨基吡咯烷和(0.66mg，0.65mmol)三乙胺，加熱80度攪拌2.5h。液相檢測反應(yīng)完全，濃縮溶劑。在殘留物中加入水，乙酸乙酯萃取，合并有機(jī)相。飽和氯化銨洗滌有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥，濃縮溶劑。殘留物進(jìn)行柱色譜分離，得到化合物77mg,白色固體(收率62％)。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm:2.95(s,3h),3.08(s,3h),3.86(s,3h),7.14-7.16(d,j＝8.8hz，2h),7.79(s,1h),8.04-8.06(d,j＝8.8hz,2h)。制備方法參照實(shí)施例42，原料氨水和中間體xii，收率69％。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm:2.82(s,3h),3.83(s,3h),7.09-7.11(dd,j＝6.8hz，2.0hz，2h),7.25(s,1h),7.73-7.77(dd,j＝6.8hz,2.0hz,2h),7.98(s,4h)。實(shí)施例43化合物c-38的制備參照實(shí)施例4的合成方法，原料為中間體xiii和二甲胺鹽酸鹽。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm:2.21(s,6h),3.09-3.10(d,j＝3.6hz,2h),3.76(s,3h),6.31-6.34(d,j＝15.2hz,1h),6.76-6.80(m,1h),6.95-6.97(d,＝8.8hz,2h),7.40-7.45(m,3h),7.85-7.87(q,j＝8.8hz,2h),10.32(s,1h)。實(shí)施例44化合物c-26的制備參照文獻(xiàn)w03022852a2可以合成得到中間體xiv,再參照實(shí)施例4的合成方法得到產(chǎn)物。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm:10.21(s,1h),8.25(s,1h),7.64-7.62(d,j＝8.8hz,2h),7.44-7.39(m,4h),7.15-7.13(d,j＝8.8hz,2h),6.76-6.72(m,1h),6.28-6.25(d,j＝15.6hz,1h),3.85(s,3h),3.06-3.05(d,j＝4.8hz,2h),3.17(s,6h)；實(shí)施例45化合物c-34的制備制備方法參照實(shí)施例44，原料4-甲氧基溴代苯乙酮和哌啶，產(chǎn)物為類白固體。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm:1.40-1.53(m，6h),2.37(m,4h),3.11(m,2h),3.86(s,3h),6.24-6.28(d,j＝15.6hz,1h),6.71-6.77(m,1h),7.13-7.15(d,j＝8.8hz,2h),7.39-7.44(m,4h),7.62-7.64(d,j＝8.8hz,2h),8.25(s,1h),10.22(s,1h)；實(shí)施例46化合物c-41的制備參照文獻(xiàn)w03022852a2可以合成得到中間體xv，再參照實(shí)施例4的合成方法得到產(chǎn)物。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm:1.41(m,2h),1.51-1.55(m,4h),2.33-2.36(m,4h),3.10-3.11(d,j＝4.4hz,2h),3.77(s,3h),6.30-6.33(d,j＝15.6hz,1h),6.75-6.83(m,1h),6.97-6.99(d,j＝8.8hz,2h),7.15-7.18(m,1h),7.25(s,1h),7.34-7.38(q,j＝9.2hz,j＝8.8hz,1h),7.43-7.46(d,j＝9.2hz,2h),7.53-7.56(d,j＝8.8hz,2h),7.87-7.90(m,3h),8.52(s,1h),10.32(s,1h)；實(shí)施例47化合物c-42的制備制備方法參照實(shí)施例46，原料4-甲氧基溴代苯乙酮，間氨基苯硼酸和哌啶，產(chǎn)物為白色固體。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm:1.38(m,2h),1.50-1.82(m,4h),2.34(m,4h),3.07-3.08(d,j＝5.2hz,2h),6.24-6.28(d,j＝15.6hz,1h),6.72-6.79(m,1h),6.97-6.99(d,j＝8.8hz,2h),7.22-7.34(m,4h),7.46-7.48(d,j＝8.8hz,2h),7.53-7.57(q,j＝7.6hz,j＝8.0hz,1h),7.79-7.84(m,2h),7.95(s,1h),8.52(s,1h),10.30(s,1h)；實(shí)施例48本發(fā)明化合物的生物活性第一部分一、實(shí)驗(yàn)材料1、細(xì)胞株：人神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞u251、人腦星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞u87、宮頸癌細(xì)胞hela、人結(jié)腸癌細(xì)胞hct116、人乳腺癌細(xì)胞系mcf-7、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株huvec，本實(shí)驗(yàn)室保存。2、實(shí)驗(yàn)試劑：mtt(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽)、pbs緩沖液、dmem培養(yǎng)基：gibco公司，胎牛血清：四季青公司，dmso：sigma公司，胰蛋白酶：gibco公司3、實(shí)驗(yàn)儀器：細(xì)胞培養(yǎng)箱：日本三洋電器公司、酶標(biāo)儀：molecular公司、光學(xué)顯微鏡：leica公司、超凈工作臺：北京偉達(dá)凈化技術(shù)研究所。4、試劑的配制：(1)pbs溶液：nacl8g，kcl0.2g，na2hpo4·2h2o3.62g，kh2po40.24g，將上述混合物加入900ml蒸餾水溶解，調(diào)節(jié)ph值至7.0，蒸餾水定容至1000ml。(2)mtt溶液：將mtt粉末溶于pbs溶液中(5mg/ml)，過濾除菌，4℃保存。5、受試藥品:實(shí)施例4，實(shí)施例5，實(shí)施例6，實(shí)施例7，實(shí)施例12，實(shí)施例15，實(shí)施例16，實(shí)施例18，實(shí)施例20，實(shí)施例21，實(shí)施例22。二、實(shí)驗(yàn)步驟1.收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為25000個(gè)/ml，每孔加入100ul細(xì)胞懸液(每孔2500個(gè)細(xì)胞)。一般設(shè)6個(gè)復(fù)孔并設(shè)置對照孔。2.細(xì)胞放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待貼壁后第二天給藥(通常前一天下午或晚上鋪板，第2天上午給藥)。3.給藥方法：先配好藥，再拿出96孔板，棄去原有培養(yǎng)液，加入藥物。藥物用培養(yǎng)基配制，每個(gè)藥物設(shè)置0ug/ml、2ug/ml、4ug/ml、6ug/ml、8ug/ml、10ug/ml、20ug/ml、25ug/ml八個(gè)濃度梯度。4.細(xì)胞放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h。5.藥物作用結(jié)束后，每孔加入20ul---mtt(5mg/ml)，培養(yǎng)3-4h。6.終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150ul---dmso,37℃溫箱孵育10分鐘或搖床低速振蕩10分鐘。之后用酶標(biāo)儀檢測od—490nm(也有測570nm的)各孔的吸光度值。7.同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔(無血清培養(yǎng)基,mtt,dmso),對照孔(細(xì)胞，最大濃度的藥物溶解介質(zhì)，無血清培養(yǎng)基,mtt,dmso)。8.細(xì)胞活力(cellviability)：細(xì)胞活力(cellviabilityofcontrol)＝(藥物組a值-調(diào)零孔a值)/(對照孔a值-調(diào)零孔a值)*100％。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果表1化合物對癌細(xì)胞系mcf-7，宮頸癌細(xì)胞hela及231c的ic50值(μm)化合物helamcf7231cc-4100.54445.527194.23c-66.5855.36826.963c-163.074.483.65c-18無75.678無c-199.2169.310.316c-208.56710.02511.434c-2117.94350.61751.998c-229.47215.98421.206c-234.0526.8417.285c-2414.69510.6510.931c-399.16512.06313.539表2化合物對人神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞u251和u87等的ic50值(μm)化合物u87u251阿法替尼7.4296.849c-313.9313.905c-58.1194.503c-713.529.498表3化合物對hct-116的ic50值(μm)化合物hct-116阿法替尼2.668c-17.715c-30.7882c-461.038c-51.1548c-73.008c-98.959c-1015.083c-115.288c-1213.677c-136.827c-1410.401c-613.984c-164.642c-18138.268c-1911.729c-2010.468c-2119.216c-2210.165c-233.761c-248.507c-396.508表4化合物對a549的ic50值(μm)化合物a549阿法替尼3.13c-36.39c-514.59c-1610.06c-257.32c-266.6c-347.89c-352.49c-3615.46c-372.47c-412.07c-426.25c-453.79c-462.46依魯替尼61.4表5化合物對hepg2的ic50值(μm)化合物hepg2阿法替尼1.69c-34.2c-513.43c-168.63c-255.33c-266.6c-347.89c-352.49c-3615.83c-372.47c-412.07c-426.25c-452.2c-462.46依魯替尼61.4表6化合物對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株huvec的ic50值(μm)化合物名稱huvec阿法替尼1.436c-34.283c-54.605c-712.054c-449.671c-611.392c-163.957c-1915.902c-2012.609c-2134.191c-2228.036c-2311.782化合物對肝癌hepg2細(xì)胞抑制活性測試結(jié)果如圖1所示。對肺癌a549細(xì)胞抑制活性測試結(jié)果如圖2所示。第二部分激酶活性測試在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，我們利用mobilityshiftassay的方法，對體外激酶axl和trka進(jìn)行2個(gè)化合物的篩選，1μm起始，3倍稀釋，10個(gè)濃度，單孔測試。采用化合物阿法替尼作為標(biāo)準(zhǔn)對照。實(shí)驗(yàn)方法i.配制1倍的激酶緩沖液和終止液1.1倍激酶緩沖液25mmhepes,ph7.50.001％brij-350.01％triton0.5mmegta10mmmgcl22mmdtt2.終止液100mmhepes,ph7.50.015％brij-350.2％coatingreagent#350mmedtaii.化合物配制1)化合物稀釋3.配制50倍的化合物：化合物的檢測終濃度為1μm，配置成50倍濃度，即50μm，在96孔板上第二個(gè)孔中加入100μl的50μm化合物，其他孔加入60μl的100％dmso。從第2孔中取30μl化合物加入第3孔中，依次往下做3倍稀釋，共稀釋10個(gè)濃度。2)轉(zhuǎn)移5倍化合物到反應(yīng)板4.從上述96孔板的每一孔取10μl到另一塊96孔板中，加入90μl激酶緩沖液。因此第二孔至第十一孔中是溶解于10％dmso中的化合物，第一孔和第十二孔中為10％dmso。5.從上述96孔板中取出5μl到一塊384孔反應(yīng)板。因此，384孔反應(yīng)板中就有5μl的10％dmso溶解的5倍化合物及5μl的10％dmso。iii.激酶反應(yīng)1)配制2.5倍酶溶液6.將激酶加入1倍激酶緩沖液，形成2.5倍酶溶液。2)配制2.5倍的底物溶液7.將fam標(biāo)記的多肽和atp加入1倍激酶緩沖液，形成2.5倍底物溶液。3)向384孔板中加入酶溶液8.384孔反應(yīng)板中已有5μl的10％dmso溶解的5倍化合物。9.在384孔反應(yīng)板中加入10μl的2.5倍酶溶液。10.室溫下孵育10分鐘。4)向384孔板中加入底物溶液11.在384孔反應(yīng)板中加入10μl的2.5倍底物溶液。5)激酶反應(yīng)和終止12.28℃下孵育3hr。13.加25μl終止液終止反應(yīng)。iv.caliper讀取數(shù)據(jù)14.caliper上讀取轉(zhuǎn)化率數(shù)據(jù)。v.抑制率計(jì)算15.從caliper上復(fù)制轉(zhuǎn)化率數(shù)據(jù)。16.把轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化成抑制率數(shù)據(jù)。其中max是指dmso對照的轉(zhuǎn)化率，min是指無酶活對照的轉(zhuǎn)化率。percentinhibition＝(max-conversion)/(max-min)*100.17.用xlfitexceladd-inversion4.3.1擬合ic50值.擬合公式:y＝bottom+(top-bottom)/(1+(ic50/x)^hillslope)結(jié)果如下表所示。表7ic50結(jié)果(nm)從所得的細(xì)胞活性測試結(jié)果可知大部分化合物對抗腫瘤細(xì)胞如肝癌，肺癌，人結(jié)腸癌細(xì)胞hct116和宮頸癌細(xì)胞等表現(xiàn)出良好的活性，甚至比參照阿法替尼和依魯替尼效果更好；表6顯示大部分化合物對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株huvec的正常細(xì)胞的毒性較阿法替尼更小。從egfr和aura激酶活性測試結(jié)果可知所測化合物對egrf激酶有較好的抑制作用，對aura激酶的抑制作用強(qiáng)于阿法替尼。當(dāng)前第1頁12