本發(fā)明屬于藥物控制釋放技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種喜樹堿類和伊文思藍(lán)形成的小分子兩親性藥物及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

癌癥是全球發(fā)病和死亡的主要原因之一。根據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，2012年全球約有1400萬新病例，并預(yù)計在未來二十年新病例的數(shù)量將增加約70％。癌癥是全球第二大死亡原因，2015年造成880萬人死亡。全球，接近六分之一的死亡是由于癌癥，其中約70％的癌癥死亡發(fā)生在低收入和中等收入國家。目前，化療是癌癥的主要治療方法之一。然而，大多數(shù)化療藥物，比如喜樹堿(camptothecin)，紫杉醇(paclitaxel)，阿霉素(doxorubicin)等，在水中溶解度都很底，而且有著不良副作用。例如，喜樹堿在臨床前研究中具有顯著的抗腫瘤活性，但由于低溶解度和嚴(yán)重不良副作用，在臨床試驗中失敗。目前，喜樹堿類似物伊立替康(irinotecan)和拓?fù)涮婵?topotecan)已被美國食品和藥物管理局(fda)批準(zhǔn)用于治療結(jié)腸癌。伊立替康顯示出更好的水溶性和減少的副作用；然而，對癌細(xì)胞的殺傷力也明顯受損。

納米藥物已被廣泛研究用于癌癥治療。納米顆粒的使用不僅可以改善這些藥物的水分散性，而且還可以增強它們的藥代動力學(xué)和生物體內(nèi)分布，改善治療效果和減少副作用。小分子兩親性前藥組裝成的納米顆粒受到廣泛研究。小分子兩親性藥物，一般由疏水性的化療藥物連接到親水性小分子，例如低聚乙二醇，多肽序列，或另一種親水性藥物。與聚合物藥物偶聯(lián)物(polymerdrugconjugates)相比，小分子兩親性前藥可以比較容易地合成，具有特定的化學(xué)結(jié)構(gòu)，和高的藥物負(fù)載能力。然而，很多小分子兩親性前藥利用喜樹堿的內(nèi)酯環(huán)上的羥基作為鏈接基團(tuán)，并形成相當(dāng)穩(wěn)定的酯鍵，這導(dǎo)致極其緩慢的釋放和顯著減少對癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性。此外，由于臨界聚集濃度較高，藥物兩親物可能不能在體內(nèi)維持其納米結(jié)構(gòu)，進(jìn)而不能受益于納米尺寸載體的增強的滲透性和保留(epr)效應(yīng)。

白蛋白是血液中最常見的蛋白質(zhì)，約7納米大小，具有約20天的長血液半衰期。由于比較大的尺寸，納米結(jié)構(gòu)的epr效應(yīng)的最早就是通過使用白蛋白和伊文思藍(lán)(evansblue)結(jié)合發(fā)現(xiàn)的。因此，我們發(fā)明了一種能夠利用白蛋白做蛋白載體并在細(xì)胞內(nèi)迅速釋放喜樹堿兩親性小分子前藥。在本發(fā)明中，喜樹堿兩親性小分子前藥在體內(nèi)體外均能維持納米結(jié)構(gòu)，并能夠在細(xì)胞內(nèi)迅速釋放。目前，國內(nèi)外尚無這種兩親性小分子前藥被報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的首要目的是提供一種喜樹堿前藥，可作為小分子兩親性藥物，在體內(nèi)外均具有優(yōu)異的腫瘤細(xì)胞攝取，并體現(xiàn)出顯著的癌細(xì)胞抑制效果。

本發(fā)明的另一目的是提供制備所述的喜樹堿前藥的方法。

本發(fā)明的再一目的是提供所述的喜樹堿前藥在制備癌癥治療藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的上述目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

首先，提供一種喜樹堿類前藥，它是喜樹堿或其衍生物和伊文思藍(lán)形成的前藥，其結(jié)構(gòu)式如式(i)

其中，

r¹為喜樹堿或其衍生物基團(tuán)；

r²為-ch2-，或者-o-中的一種；

r³為-ch2-，或者中的一種；

x為s或者-ch2-中的一種；

n1，n2為重復(fù)單元數(shù)，均為0-10的整數(shù)。

本發(fā)明優(yōu)選的方案中，所述的喜樹堿或其衍生物基團(tuán)來自式(ii)或式(iii)所示結(jié)構(gòu)：

式(ii)為喜樹堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)式，式(iii)為7-乙基-10-羥基喜樹堿化學(xué)結(jié)構(gòu)式。

本發(fā)明優(yōu)選的方案中，所述的式(i)中的n1和n2均為0-5的整數(shù)；進(jìn)一步優(yōu)選0-2的整數(shù)。

本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的方案中，所述的式(i)中r¹為喜樹堿基團(tuán)，r²為-o-或-ch2-，r³為或-ch2-，x為s或者-ch2-，n1為1-2的整數(shù)，n2為0-2的整數(shù)。

本發(fā)明更優(yōu)選的方案中，所述的喜樹堿類前藥是結(jié)構(gòu)如下式(iv)、(v)、(vi)或(vii)所示的任意一種：

或者

本發(fā)明還提供一種制備所述的喜樹堿類前藥的方法，是以喜樹堿或其衍生物為原料，在有機溶劑中，通過與帶有相應(yīng)基團(tuán)的原料反應(yīng)，制成喜樹堿或其衍生物前藥中間體，最后所述中間體再和伊文思藍(lán)反應(yīng)制備得到所述的喜樹堿類前藥；所述的喜樹堿或其衍生物優(yōu)選自喜樹堿或7-乙基-10-羥基喜樹堿。

本發(fā)明所述的制備方法中，制備所述的式(iv)或(v)的喜樹堿類前藥的方法，記作制備方法i，具體包括以下步驟：

ia)在有機溶劑中，在?；呋瘎┐嬖谙率褂萌鈿饣罨矘鋲A內(nèi)酯環(huán)上的羥基，再加入過量的2,2'-二硫代二乙醇或1,6-己二醇反應(yīng)，得到中間體醇；

ib)在催化劑存在下使用琥珀酸酐將步驟ia)得到的中間體醇轉(zhuǎn)化為羧酸封端的中間體酸；

ic)將步驟ib)得到的中間體酸和伊文思藍(lán)eb-nh2在有機溶劑中混合，并加入縮合劑攪拌反應(yīng)，得到本發(fā)明所述的部分喜樹堿類前藥。

本發(fā)明所述制備方法i中，步驟ia)所述的有機溶劑可以選自二氯甲烷、氯仿、四氫呋喃、1,4-二氧六環(huán)或二甲基甲酰胺中的任意一種；優(yōu)選二氯甲烷。

本發(fā)明所述制備方法i中，步驟ia)所述的?；呋瘎┛梢赃x自4-(二甲基氨基)吡啶、三乙胺或n,n-二異丙基乙胺中的任意一種；優(yōu)選4-(二甲基氨基)吡啶。

本發(fā)明所述制備方法i中，步驟ib)所述的催化劑可以選自4-(二甲基氨基)吡啶、三乙胺或n,n-二異丙基乙胺中的任意一種；優(yōu)選4-(二甲基氨基)吡啶。

本發(fā)明所述制備方法i中，步驟ic)所述的有機溶劑可以選自二甲基甲酰胺或二甲基亞砜中的任意一種；優(yōu)選二甲基甲酰胺。

本發(fā)明所述制備方法i中，步驟ic)所述的縮合劑可以選自1h-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸鹽(pybop)、n,n,n',n'-四甲基-o-(1h-苯并三唑-1-基)脲六氟磷酸鹽(hbtu)或2-(7-氧化苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hatu)中的任意一種或兩種的混合物；優(yōu)選1h-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸鹽。

本發(fā)明所述制備方法i優(yōu)選的一種實施方式中，制備了式(iv)所示的前藥，其合成路線如下：

具體包括如下步驟：

在4-(二甲基氨基)吡啶的存在下，在二氯甲烷中，使用三光氣活化喜樹堿的羥基，然后與過量的2,2'-二硫代二乙醇反應(yīng)，制備得到cpt-ss-oh；然后使用琥珀酸酐在有機溶劑中將cpt-ss-oh轉(zhuǎn)化為羧酸封端的cpt-ss-cooh，其中需要添加4-(二甲基氨基)吡啶作為催化劑；最后，將cpt-ss-cooh和伊文思藍(lán)eb-nh2一起在二甲基甲酰胺中混合，并加入1h-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸鹽(pybop)和n,n-二異丙基乙胺(dipea)一起攪拌，制備得到式(iv)所示前藥：cpt-ss-eb。

本發(fā)明所述制備方法i優(yōu)選的另一種實施方式中，制備了以下式(v)所示的前藥：

其合成路線如下：

具體包括如下步驟：

在4-(二甲基氨基)吡啶的存在下，在二氯甲烷中，使用三光氣活化喜樹堿的羥基，然后與過量的1,6-己二醇反應(yīng)，制備得到cpt-cc-oh；然后使用琥珀酸酐在有機溶劑中將cpt-cc-oh轉(zhuǎn)化為羧酸封端的cpt-cc-cooh，其中需要添加4-(二甲基氨基)吡啶作為催化劑；最后，將cpt-cc-cooh和伊文思藍(lán)eb-nh2一起在二甲基甲酰胺中混合，并加入1h-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸鹽(pybop)和n,n-二異丙基乙胺(dipea)一起攪拌，制備得到式(v)所示前藥：cpt-cc-eb。

本發(fā)明所述的制備方法中，制備所述的式(vi)或(vii)的喜樹堿類前藥的方法，記作制備方法ii，具體包括以下步驟：

iia)在有機溶劑中，在酰化催化劑存在下，體系中加入縮合劑使喜樹堿內(nèi)酯環(huán)上的羥基與過量的3,3'-二氫氧啉酸或辛二酸一端的羧基發(fā)生縮合反應(yīng)，得到羧基封端的中間體酸；

iib)將步驟iia)得到的中間體酸和伊文思藍(lán)eb-nh2在有機溶劑中混合，并加入縮合劑攪拌反應(yīng)，得到本發(fā)明所述的部分喜樹堿類前藥。

本發(fā)明所述制備方法ii中，步驟iia)所述的有機溶劑可以選自二氯甲烷、氯仿、四氫呋喃、1,4-二氧六環(huán)或二甲基甲酰胺中的任意一種；優(yōu)選四氫呋喃或二氯甲烷。

本發(fā)明所述制備方法ii中，步驟iia)所述的?；呋瘎┛梢赃x自4-(二甲基氨基)吡啶、三乙胺或n,n-二異丙基乙胺中的任意一種；優(yōu)選4-(二甲基氨基)吡啶。

本發(fā)明所述制備方法ii中，步驟iia)所述的縮合劑優(yōu)選1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽。

本發(fā)明所述制備方法ii中，步驟iib)所述的有機溶劑可以選自二甲基甲酰胺或二甲基亞砜中的任意一種；優(yōu)選二甲基甲酰胺；

本發(fā)明所述制備方法ii中，步驟iib)所述的縮合劑可以選自1h-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸鹽(pybop)、n,n,n',n'-四甲基-o-(1h-苯并三唑-1-基)脲六氟磷酸鹽(hbtu)或2-(7-氧化苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hatu)中的任意一種或兩種的混合物；優(yōu)選1h-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸鹽。

本發(fā)明所述制備方法ii優(yōu)選的一種實施方式中，制備了以下式(vi)所示的前藥：

其合成路線如下：

具體包括如下步驟：

在4-(二甲基氨基)吡啶的存在下，在二氯甲烷中，使用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edchcl)作為縮合劑，然后與過量的3,3'-二氫氧啉酸反應(yīng)，制備得到cpt-ss-cooh-2；最后，將cpt-ss-cooh-2和伊文思藍(lán)eb-nh2一起在二甲基甲酰胺中混合，并加入1h-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸鹽(pybop)和n,n-二異丙基乙胺(dipea)一起攪拌，制備得到式(vi)所示前藥：cpt-ss-eb-2。

本發(fā)明所述制備方法ii優(yōu)選的另一種實施方式中，制備了以下式(vii)所示的前藥：

其合成路線如下：

具體包括如下步驟：

在4-(二甲基氨基)吡啶的存在下，在二氯甲烷中，使用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edchcl)作為縮合劑，然后與過量的辛二酸反應(yīng)，制備得到cpt-cc-cooh-2；最后，將cpt-cc-cooh-2和伊文思藍(lán)eb-nh2一起在二甲基甲酰胺中混合，并加入1h-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸鹽(pybop)和n,n-二異丙基乙胺(dipea)一起攪拌，制備得到式(vii)所示前藥：cpt-cc-eb-2。

本發(fā)明還提供所述的喜樹堿類前藥在制備癌癥治療藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明設(shè)計和合成的喜樹堿類前藥是新型藥物兩親性前藥，在體外能夠自組裝成納米粒子，在體內(nèi)和白蛋白結(jié)合，形成兩親性前藥/白蛋白復(fù)合體。本發(fā)明所述的喜樹堿類藥物兩親性前藥制備簡單，具有確定的化學(xué)結(jié)構(gòu)和固定的高藥物量，而且可以直接重懸浮于水溶液中，并自組裝成直徑為80±16nm的明確界定的納米顆粒。納米顆粒的形成提供了具有高水分散性的前藥，并且保護(hù)藥物免于水解。因此本發(fā)明所述的喜樹堿類藥物兩親性前藥在水溶液中穩(wěn)定，6天內(nèi)幾乎沒有變化。試驗證明本發(fā)明的喜樹堿類兩親性前藥能被癌細(xì)胞有效內(nèi)吞，并且cpt-ss-eb、cpt-ss-eb-2等二硫鍵連接的前藥能夠在多種類型的癌細(xì)胞中的體現(xiàn)很強的細(xì)胞毒性，ic50值比伊立替康低10-27倍。此外cpt-ss-eb、cpt-ss-eb-2等的二硫鍵能夠在谷胱甘肽存在下迅速裂解并釋放出喜樹堿，從而能夠維持其抗癌活性。

現(xiàn)有技術(shù)中，與聚合物-藥物的形成納米顆粒相比，小分子藥物兩親性前藥的一個潛在缺點是其在體內(nèi)血液循環(huán)中在稀釋條件下的相對低的穩(wěn)定性。但是本發(fā)明中，通過eb-白蛋白結(jié)合，cpt-ss-eb兩親性前藥能夠從80nm納米顆粒瞬時轉(zhuǎn)化為7nm的白蛋白/前藥復(fù)合物。體內(nèi)pet成像研究證實，本發(fā)明中的藥物兩親性前藥具有很長的血液循環(huán)，并能夠在腫瘤中富集。在注射后24小時，cpt-eb的半衰期和曲線下面積(auc)比喜樹堿改善了130倍和30倍。cpt-ss-eb的腫瘤積累相對于喜樹堿增加了40倍。同時，本發(fā)明的小分子兩親性前藥對結(jié)腸癌具有優(yōu)異的抗癌功效?？傮w而言，本發(fā)明制備的小分子兩親性前藥具有顯著的創(chuàng)新性和極強的臨床轉(zhuǎn)化能力，為小分子藥物遞送系統(tǒng)的開發(fā)開辟了一種新的途徑。

附圖說明

圖1為cpt-ss-oh的¹hnmr(300mhz，cd2cl2)。

圖2為cpt-ss-cooh的¹hnmr(300mhz,cdcl3)。

圖3為cpt-ss-eb的¹hnmr(300mhz,dmso-d6)。

圖4為cpt-ss-eb的hplc和esi-ms譜圖。

圖5為cpt-cc-oh的¹hnmr(300mhz,cdcl3)。

圖6為cpt-cc-cooh的¹hnmr(300mhz,cdcl3)。

圖7為cpt-cc-eb的hplc和esi-ms譜圖。

圖8為cpt-nh2的¹hnmr(300mhz，cd2cl2)。

圖9為eb-nota-cpt的hpl譜圖。

圖10為eb-nota-cpt的lc-mass譜圖。

圖11為nota-cpt的lc-mass譜圖。

圖12為cpt-ss-eb臨界聚集濃度的測定。

圖13為cpt-ss-eb的流體動力學(xué)直徑變化圖。

圖14為cpt-ss-eb和cpt-cc-eb的在37度ph7.4條件下攪拌3天后的hplc譜圖。

圖15為cpt-ss-eb加入白蛋白以后的伊文思熒光變化圖。

圖16為cpt-eb和cpt的血液半衰期。

圖17為cpt-ss-eb前藥的表征。(a)cpt-ss-eb在水中的照片(左)和紅色激光通過后(右)的照片；(b)cpt-ss-eb在pbs中的水合直徑分布圖；(c)cpt-ss-eb的tem圖像；(e)具有或不具有白蛋白的cpt-ss-eb和eb-cooh的熒光光譜；(d)加入白蛋白5分鐘后cpt-ss-eb的水合直徑分布圖和(f)加入白蛋白24小時后的cpt-ss-eb的水合直徑分布圖。

圖18為37℃下在pbs中，在含有/不含10mm谷胱甘肽(gsh)的pbs中的喜樹堿(cpt)的釋放。

圖19為cpt-ss-eb、cpt-cc-eb、ir和cpt不同的癌細(xì)胞(a)hct116，(b)u87mg，(c)4t1，和(d)a549的體外細(xì)胞毒性。

圖20為共焦顯微鏡圖像顯示(a)cpt-cc-eb和(b)cpt-ss-eb的細(xì)胞內(nèi)吞。藍(lán)色＝hoechst(核染色)，綠色＝lysogreen跟蹤劑(溶酶體)，紅色＝來自前藥的eb。

圖21為cpt-ss-eb和相關(guān)化合物的流式細(xì)胞儀分析結(jié)果。左：450nm通道，對應(yīng)于來自cpt的熒光；右：660nm通道，對應(yīng)于來自eb的熒光。

圖22為靜脈注射[64cu]標(biāo)記的(a)cpt-eb和(b)cpt后5分鐘，1小時，3小時，5小時，7小時和24小時的hct116腫瘤攜帶小鼠的代表性全身冠狀和橫向pet圖像。在示蹤劑注射后不同時間點的cpt-eb和cpt在心臟(c，具有血液)，腫瘤(d)和肝臟(e)中的分布。定量基于pet圖像(n＝3/組)。(f)在注射后48小時殺死小鼠，收集他們的器官和組織的定量生物分布數(shù)據(jù)。白色箭頭/圓圈表示腫瘤的位置。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(n＝3/組)。

圖23為hct116腫瘤生長抑制圖，每組5只小鼠，每3天一次，注射5次。

具體實施方式

下面通過實施例對本發(fā)明進(jìn)行具體描述，本實施例只用于對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，不能理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)上述發(fā)明的內(nèi)容做出的一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整，均屬本發(fā)明保護(hù)范圍。

實施例1：cpt-ss-oh的制備

在攪拌下，將4-二甲氨基吡啶(1.05g，8.60mmol)在10ml二氯甲烷中的溶液滴加到喜樹堿(1.0g，2.87mmol)和三光氣(0.315g，1.06mmol)的無水二氯甲烷(200ml)的混合物懸浮液中。攪拌30分鐘后，加入在無水四氫呋喃(25ml)中的2,2'-二硫代二乙醇(8.60g，55.8mmol)，將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌過夜。將混合物用50mm鹽酸水溶液(2×100ml)，水(1×100ml)和飽和鹽水(1×100ml)洗滌。分離有機層并用無水硫酸鈉干燥。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮溶液，并使用預(yù)填充的二氧化硅柱通過快速色譜分離純化。產(chǎn)量：1.05g(69％產(chǎn)率)。¹hnmr(300mhz，cd2cl2)δ8.46(s，1h)，8.22(d，j＝8.3hz，1h)，7.99(dd，j＝8.2,1.1hz，1h)，7.86(ddd，j＝6.9,6.5hz，1h)，7.70(ddd，j＝8.1,6.9,1.2hz，1h)，7.42(s，1h)，5.64(d，j＝18hz，1h)，5.36(m，1h)4.37(t，j＝6.0hz，2h)，3.93-3.81(m，2h)，3.03-2.82(m，4h)，2.19(tdd，j＝14.0,12.3,7.5hz，2h)，1.01(t，j＝7.5hz，3h)。圖1為cpt-ss-oh的¹hnmr譜圖，證明了制備該化合物成功。

實施例2：cpt-ss-cooh的制備

在攪拌下將琥珀酸酐(400mg，4.00mmol)、實施例1制備的cpt-ss-oh(204mg，0.386mmol)和4-二甲氨基吡啶(19.6mg，0.161mmol)溶于無水二氯甲烷(200ml)中。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌過夜，然后用水(1×100ml)，50mm鹽酸水溶液(1×100ml)和飽和鹽水(1×100ml)洗滌。分離有機層并用無水硫酸鈉干燥。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮溶液，并使用預(yù)填充的二氧化硅柱通過快速色譜純化。產(chǎn)量：201mg(83％產(chǎn)率)。¹hnmr(300mhz，cdcl3)δ8.44(s，1h)，8.32(d，j＝8.4hz，1h)，7.95(d，j＝8.2hz，1h)(ddd，j＝8.5,6.9,1.4hz，1h)，7.69(ddd，j＝8.1,7.0,1.1hz，1h)，7.43(s，1h)，5.71(d，j＝17.3hz，1h)5.39(d，j＝17.3hz，1h)，5.32(s，2h)，4.46-4.25(m，4h)，3.00-2.86(m，4h)，2.79-2.61m，2h)，2.18(m，j＝2h)，1.01(t，j＝7.5,3h)。esi-msm/z：計算值628，實測值629(m+h)。圖2為cpt-ss-cooh的¹hnmr譜圖，證明了制備該化合物成功。

實施例3：cpt-ss-eb的制備

實施例2制備的cpt-ss-cooh(58mg，0.092mmol)、eb-胺(25mg，0.046mmol)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基鏻(pybop，48mg，0.092mmol)和n,n-二異丙基乙胺(dipea，59mg，0.46mmol)在二甲基甲酰胺中混合，在氮氣下攪拌2天。通過加入過量的乙酸淬滅反應(yīng)，并通過制備型高效液相使用乙腈和0.2％乙酸水溶液(梯度：5-95％乙腈)純化。將收集的純化產(chǎn)物凍干并儲存在-20℃以備后用。產(chǎn)量：21mg(40％產(chǎn)率)。esi-msm/z：計算值1152，實測值1151(m-h)。¹hnmr(300mhz，dmso)δ9.34(s，1h)，8.70(d，j＝3.7hz，1h)，8.35(s，1h)，8.21-8.10(m，3h)，8.02(d，9.9hz，1h)，7.88(dt，j＝8.4,4.1hz，2h)，7.73(dd，j＝6.9,4.1hz，1h)，7.64(dd，j＝4.0hz，j＝6.5hz，1h)，7.50(d，j＝5.2hz，2h)，7.09(d，j＝2.2hz，1h)，7.00(d，j＝10hz，1h)，5.56-5.32(m，4h)，4.32(t，j＝5.9hz，2h)，4.21(t，j＝6.2hz，2h)，3.55(t，j＝6.4hz，1h)，3.06-2.89(m，3h)，2.75(dd，j＝11.9,5.4hz，1h)，2.66-2.52(m，6h)，2.28(s，3h)，2.26(s，3h)，2.22-2.13(m，4h),0.92(t，j＝7.4hz)。圖3為cpt-ss-eb的¹hnmr譜圖，證明了制備該化合物成功。圖4為cpt-ss-eb的hplc和esi-ms譜圖，也證明了該化合物成功制備，并且具有99％以上純度。

實施例4：cpt-cc-oh的制備

在攪拌下，將4-二甲氨基吡啶(1.68g，13.8mmol)在10ml二氯甲烷中的溶液滴加到喜樹堿(1.5g，4.31mmol)和三光氣(0.473g，1.59mmol)的無水二氯甲烷(200ml)的混合物懸浮液中。攪拌30分鐘后，加入在無水四氫呋喃(15ml)中的1,6-己二醇(6.64g，43.1mmol)，將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌過夜。將混合物用50mm鹽酸水溶液(2×100ml)，水(1×100ml)和飽和鹽水(1×100ml)洗滌。分離有機層并用無水硫酸鈉干燥。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮溶液，并使用預(yù)填充的二氧化硅柱通過快速色譜純化。使用梯度乙酸乙酯和己烷混合物作為洗脫劑。產(chǎn)量：1.48g(70％產(chǎn)率)。¹hnmr(300mhz，cdcl3)δ8.41(s，1h)，8.23(d，j＝8.7hz，1h)，7.95(dd，j＝8.2,1.1hz，1h)，7.85(ddd，j＝6.9,6.5hz，1h)，7.68(ddd，j＝8.1,6.9,1.2hz，1h)，7.36(s，1h)，5.70(d，j＝17.3hz，1h)，5.39(d，j＝1h)，5.30(s，2h)，4.21-4.05(m，2h)，3.59(dd，j＝10.1,6.1hz，2h)，2.43-2.01(m，2h)，1.74-1.65(m，3h)，1.59-1.47(m，2h)，1.45-1.32(m，4h)，1.00(t，j＝7.5hz，3h)。圖5為cpt-cc-oh的¹hnmr譜圖，證明了制備該化合物成功。

實施例5：cpt-cc-cooh的制備

在攪拌下將琥珀酸酐(400mg，4.00mmol)、實施例4制備的cpt-cc-oh(200mg，0.406mmol)和4-二甲氨基吡啶(19.8mg，0.162mmol)溶于無水二氯甲烷(200ml)中。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌過夜，然后用水(1×100ml)，50mm鹽酸水溶液(1×100ml)和飽和鹽水(1×100ml)洗滌。分離有機層并用無水硫酸鈉干燥。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮溶液，并使用預(yù)填充的二氧化硅柱通過快速色譜純化。使用梯度乙酸乙酯和己烷混合物作為洗脫劑。產(chǎn)量：192mg(80％產(chǎn)率)。esi-msm/z(m+)計算值592，實測值591(m-h)。1hnmr(300mhz，cdcl3)δ8.42(s，1h)，8.28(d，j＝8.7hz，1h)，7.95(d，j＝8.3hz，1h)，7.85(ddd，j＝1h)，7.68(ddd，j＝8.1,6.9,1.1hz，1h)，7.38(d，j＝5.1hz，1h)，5.70(d，j＝17.3hz，1h),5.39(d,j＝17.3hz，1h)，5.31(s，2h)，4.23-3.99(m，4h)，2.74-2.56(m，4h)，2.37-2.07(m，2h)，1.61(ddd，j＝12.9,6.6hz，5h)，1.44-1.23(m，7h)，1.00(t，j＝7.5hz，3h)。圖6為cpt-cc-cooh的¹hnmr譜圖，證明了制備該化合物成功。

實施例6：cpt-cc-eb的制備

將實施例5制備的cpt-cc-cooh(52mg，0.092mmol)、eb-胺(25mg，0.046mmol)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧三吡咯烷基鏻(pybop，48mg，0.092mmol)和n,n-二異丙基乙胺(dipea，59mg，0.46mmol)在二甲基甲酰胺中混合，在氮氣下攪拌2天。通過加入過量的乙酸淬滅反應(yīng)，并通過制備型高效液相使用乙腈和0.2％乙酸水溶液(梯度：5-95％乙腈)純化。將收集的純化產(chǎn)物凍干并儲存在-20℃以備后用。產(chǎn)量：23mg(45％產(chǎn)率)。esi-msm/z：計算值1116，實測值1115(m-h)。圖7為cpt-cc-eb的hplc和esi-ms譜圖，證明了該化合物成功制備，并且具有99％以上純度。

實施例7：cpt-ss-cooh-2的制備

在攪拌下將3,3'-二氫氧啉酸(1197mg，5.7mmol)、cpt(200mg，0.57mmol)和4-二甲氨基吡啶(35mg，0.29mmol)混于四氫呋喃(200ml)中。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌過夜，然后用飽和碳素氫鈉水溶液(3×100ml)，50mm鹽酸水溶液(1×100ml)和飽和鹽水(1×100ml)洗滌。分離有機層并用無水硫酸鈉干燥。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮溶液，并使用預(yù)填充的二氧化硅柱通過快速色譜純化。使用梯度乙酸乙酯和己烷混合物作為洗脫劑。產(chǎn)量：121mg(39％產(chǎn)率)。¹hnmr(300mhz，cdcl3)δ8.41(s，1h)，8.27(d，j＝8.7hz，1h)，7.95(d，j＝8.3hz，1h)，7.85(m，1h)，7.68(m,1h)，7.37(d，j＝5.1hz，1h)，5.70(d，j＝17.2hz，1h)，5.39(d,j＝17.2hz，1h)，5.30(s，2h)，2.92-2.59(m，8h)，2.36-2.06(m，2h)，1.01(t，j＝7.5hz，3h)。

實施例8：cpt-ss-eb-2的制備

實施例7制備的cpt-ss-cooh-2(50mg，0.092mmol)、eb-胺(25mg，0.046mmol)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基鏻(pybop，48mg，0.092mmol)和n,n-二異丙基乙胺(dipea，59mg，0.46mmol)在二甲基甲酰胺中混合，在氮氣下攪拌2天。通過加入過量的乙酸淬滅反應(yīng)，并通過制備型高效液相使用乙腈和0.2％乙酸水溶液(梯度：5-95％乙腈)純化。將收集的純化產(chǎn)物凍干并儲存在-20℃以備后用。產(chǎn)量：11mg(22％產(chǎn)率)。esi-msm/z：計算值1064，實測值1063(m-h)。¹hnmr(300mhz，dmso)δ9.35(s，1h)，8.71(d，j＝3.7hz，1h)，8.35(s，1h)，8.21-8.11(m，3h)，8.03(d，9.9hz，1h)，7.89(m，2h)，7.74(m，1h)，7.65(m，1h)，7.51(d，j＝5.2hz，2h)，7.09(d，j＝2.3hz，1h)，7.01(d，j＝10.0hz，1h)，5.56-5.31(m，4h)，2.98-2.52(m，8h)，2.28(s，3h)，2.25(s，3h)，2.22-2.13(m，2h)，0.91(t，j＝7.4hz)。

實施例9：cpt-cc-cooh-2的制備

在攪拌下將辛二酸(991mg，5.7mmol)、cpt(200mg，0.57mmol)和4-二甲氨基吡啶(35mg，0.29mmol)混于四氫呋喃(200ml)中。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌過夜，然后用飽和碳素氫鈉水溶液(3×100ml)，50mm鹽酸水溶液(1×100ml)和飽和鹽水(1×100ml)洗滌。分離有機層并用無水硫酸鈉干燥。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮溶液，并使用預(yù)填充的二氧化硅柱通過快速色譜純化。使用梯度乙酸乙酯和己烷混合物作為洗脫劑。產(chǎn)量：109mg(38％產(chǎn)率)。1hnmr(300mhz，cdcl3)δ8.42(s，1h)，8.27(d，j＝8.7hz，1h)，7.96(d，j＝8.3hz，1h)，7.86(m，1h)，7.68(m,1h)，7.38(d，j＝5.1hz，1h)，5.71(d，j＝17.3hz，1h)，5.38(d,j＝17.3hz，1h)，5.31(s，2h)，2.46-2.08(m，6h)，1.68-1.21(m，8h)，1.00(t，j＝7.5hz，3h)。

實施例10：cpt-cc-eb-2的制備

實施例9制備的cpt-cc-cooh-2(46mg，0.092mmol)、eb-胺(25mg，0.046mmol)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基鏻(pybop，48mg，0.092mmol)和n,n-二異丙基乙胺(dipea，59mg，0.46mmol)在二甲基甲酰胺中混合，在氮氣下攪拌2天。通過加入過量的乙酸淬滅反應(yīng)，并通過制備型高效液相使用乙腈和0.2％乙酸水溶液(梯度：5-95％乙腈)純化。將收集的純化產(chǎn)物凍干并儲存在-20℃以備后用。產(chǎn)量：12mg(21％產(chǎn)率)。esi-msm/z：計算值1029，實測值1028(m-h)。¹hnmr(300mhz，dmso)δ9.33(s，1h)，8.70(d，j＝3.7hz，1h)，8.34(s，1h)，8.20-8.10(m，3h)，8.01(d，9.9hz，1h)，7.87(m，2h)，7.72(m，1h)，7.63(m，1h)，7.50(d，j＝5.2hz，2h)，7.08(d，j＝2.2hz，1h)，7.00(d，j＝10hz，1h)，5.56-5.31(m，4h)，2.49-2.02(m，12h)，1.68-1.21(m，8h)，0.92(t，j＝7.4hz)。

實施例11：cpt-nhs活化酯的制備

在-10℃下將實施例5制備的cpt-cc-cooh(27μmol)和n-羥基琥珀酰亞胺(27μmol)溶解在1.0ml無水thf中。然后滴加n,n'-二環(huán)己基碳二亞胺(dcc，27μmol)在無水四氫呋喃(0.5ml)中的溶液。將反應(yīng)混合物在-10℃下攪拌1小時，然后在室溫下攪拌過夜。通過過濾除去白色沉淀，真空除去溶劑，得到油狀物。將產(chǎn)物在乙酸乙酯中重結(jié)晶，得到白色-黃色固體產(chǎn)物(52％產(chǎn)率)。

實施例12：eb-nota-cpt的制備

將eb-lys-nota(5.0μmol)溶解在200μl二甲基甲酰胺中。然后加入在100μl二甲基甲酰胺中的cpt-nhs活化酯(實施例11制備的)(6.0μmol)，然后加入n,n-二異丙基乙胺(dipea，25μmol)。將反應(yīng)在室溫下攪拌3-4小時。然后，使用higgins柱純化粗產(chǎn)物。獲得化學(xué)純度>95％的產(chǎn)物。lcms1529.46(m-h)。圖9，圖10為eb-nota-cpt的hplc和lc-mass譜圖，證明了該化合物成功制備，并且具有95％以上純度。

實施例13：cpt-nh2的制備

向在1ml無水二甲基甲酰胺(dmf)中的實施例5制備的cpt-cc-cooh(3.6當(dāng)量)溶液中加入2-(7-氧化苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯((hatu，4.2當(dāng)量)。將溶液在室溫下攪拌10分鐘。然后加入10當(dāng)量的n,n-二異丙基乙胺，然后加入n-叔丁氧羰基-1,2-乙二胺(1.0當(dāng)量)的二甲基甲酰胺溶液。將反應(yīng)在室溫下攪拌過夜。使用油真空泵除去二甲基甲酰胺，并使用二氯甲烷/水萃取粗混合物。蒸發(fā)有機層，然后在室溫下用三氟乙酸/二氯甲烷(1:1)處理1小時。將混合物在高效液相制備柱上純化，得到cpt-nh2，為黃色固體(44％產(chǎn)率)。圖8為cpt-nh2的¹hnmr譜圖，證明了制備該化合物成功。

實施例14：nota-cpt的制備

將cpt-nh2(5.0μmol)溶解在200μl二甲基甲酰胺中。然后加入在100μl二甲基甲酰胺中的nota-nhs活化酯(6.0μmol)，然后加入n,n-二異丙基乙胺(dipea，25μmol)。將反應(yīng)在室溫下攪拌3-4小時。然后，使用higgins柱方法純化。產(chǎn)物以>95％的化學(xué)純度。lcms：920.34(m+h)使用分析型高效液相和lc-ms來確認(rèn)產(chǎn)物已經(jīng)純化。圖11為nota-cpt的hplc和lc-mass譜圖，證明了該化合物成功制備，并且具有95％以上純度。

實施例15：臨界聚集濃度(cac)測量

芘被用作為熒光探針，將實施例3制備的cpt-ss-eb以1.0mg/ml分散在水中，芘含量為6.0×10^-7mol/l。然后將溶液以6.0×10^-7mol/l的恒定芘濃度稀釋至284μg/ml至0.277μg/ml的各種濃度。記錄所有樣品的激發(fā)光譜，發(fā)射波長設(shè)定在375nm。測定所有溶液的i339/i335比率值，并且使用這些值相對于對數(shù)刻度(logc)上的濃度作圖。在cpt-ss-eb濃度<1.5μg/ml時，強度比為約0.25，表明芘在親水環(huán)境中。當(dāng)濃度>1.5μg/ml時，強度比顯著增加，最終達(dá)到～0.9，這是疏水環(huán)境中芘的特征。圖12為測得結(jié)果，顯示臨界聚集濃度值在水為1.5μg/ml。

實施例16：cpt-ss-eb在水中的組裝形成納米粒子和相關(guān)表征

凍干的cpt-ss-eb可以直接重懸在水或其他水溶液中，并且由于其內(nèi)在的兩親性質(zhì)而自發(fā)地自組裝成納米顆粒。由于eb的優(yōu)異的水溶性和納米顆粒的形成，cpt-ss-eb可以以很高的濃度(5mg/ml)分散在水溶液中(參見圖17a左)。當(dāng)紅色激光通過cpt-ss-eb溶液時，顯示強的光散射，這表明納米顆粒已經(jīng)形成(參見圖17a右)。我們進(jìn)一步用動態(tài)光散射測定了cpt-ss-eb水合直徑。結(jié)果顯示納米顆粒具有80±16nm的數(shù)均平均流體動力學(xué)直徑(圖17b)。透射電子顯微鏡(tem)表明cpt-ss-eb納米顆粒是球形的，具有約57nm的相對均勻的尺寸(圖17c)。穩(wěn)定的納米顆粒的形成不僅增強了喜樹堿的水分散性，而且保護(hù)了其不被水解。如由dls在6天內(nèi)監(jiān)測，納米組裝件在pbs中保持流體動力學(xué)二聚體，進(jìn)一步指示其穩(wěn)定性(圖13)。此外，hplc也用于證實本發(fā)明的藥物兩親物的穩(wěn)定性。在pbs中孵育三天后，僅觀察到痕量的降解產(chǎn)物，并且對于實施例3制備的cpt-ss-eb和實施例6制備的cpt-cc-eb這兩種藥物兩親物均沒有檢測到游離cpt(參見圖18中的方塊和倒三角標(biāo)記的兩條曲線)。在水性環(huán)境中的高穩(wěn)定性，連同優(yōu)異的重復(fù)凍干和再懸浮的能力使得本發(fā)明的藥物兩親物作為藥物遞送平臺具有高度吸引力。

實施例17：cpt-ss-eb在水中的組裝形成納米粒子和白蛋白的相互作用

現(xiàn)有技術(shù)中，雖然有些小分子藥物兩親性前藥在水溶液中可能是穩(wěn)定的，但它們可能不能在體內(nèi)保持其完整性。本發(fā)明的cpt-ss-eb兩親性前藥的一個關(guān)鍵優(yōu)點是通過伊文斯藍(lán)與白蛋白結(jié)合，將它們轉(zhuǎn)化為白蛋白與藥物的復(fù)合物。新形成的白蛋白/藥物復(fù)合物仍然是納米結(jié)構(gòu)，并利用白蛋白的長血液循環(huán)和epr效應(yīng)優(yōu)先將藥物積累在腫瘤。一系列研究驗證了cpt-ss-eb與白蛋白結(jié)合的能力。首先，我們發(fā)現(xiàn)在過量牛血清白蛋白(bsa)存在下cpt-ss-eb的eb熒光強度增加了10倍，程度與未偶聯(lián)的eb-cooh相當(dāng)(參見圖17e中上部的兩條曲線)。

我們進(jìn)一步進(jìn)行了白蛋白結(jié)合的熒光動力學(xué)研究，將0.2mg/ml(對應(yīng)于藥物注射后的初始小鼠血漿藥物濃度)的cpt-ss-eb的eb熒光監(jiān)控20分鐘，然后加入白蛋白，終濃度為35mg/ml(對應(yīng)于小鼠血清白蛋白濃度)。加入白蛋白后，eb熒光增加7.3倍，并在4小時內(nèi)逐漸增加總共8.6倍，變化趨勢參見圖15。

通過動態(tài)光散射測量，在加入白蛋白后，cpt-ss-eb納米組裝體的數(shù)均平均流體動力學(xué)直徑從80nm變?yōu)?nm，表明大多數(shù)cpt-ss-eb從較大納米結(jié)構(gòu)解離并轉(zhuǎn)化為白蛋白/cpt-ss-eb復(fù)合物。此外，對大納米顆粒非常敏感的強度平均流體動力學(xué)直徑從用于cpt-ss-eb納米組裝的121nm變化為加入白蛋白之后的148nm和7nm，表明同時存在白蛋白/cpt-ss-eb復(fù)合物以及一小部分剩余的cpt-ss-eb納米組裝。1天后，數(shù)量和強度平均的流體動力學(xué)直徑均變?yōu)榧s7nm。這些結(jié)果表明，cpt-ss-eb納米組件通過白蛋白結(jié)合cpt-ss-eb而固定地轉(zhuǎn)化為白蛋白/cpt-ss-eb復(fù)合物。

實施例18：喜樹堿釋放實驗

通過透析法測量喜樹堿從cpt-cc-eb和cpt-ss-eb的釋放。簡言之，將水中的cpt-cc-eb或cpt-ss-eb用磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)稀釋，產(chǎn)生55μg/ml的濃度，將0.5ml轉(zhuǎn)移到預(yù)浸漬的透析盒中，放置于25ml磷酸鹽緩沖鹽水或者含有10mm谷胱甘肽的磷酸鹽緩沖鹽水中透析72小時。在預(yù)定時間從透析液中取等分試樣(0.1ml)，并將0.1ml新鮮磷酸鹽緩沖鹽水加回到外部透析液中。通過高效液相(條件：30％乙腈，含有0.1％tfa，1ml/min，uv檢測器，250nm)監(jiān)測喜樹堿濃度的增加。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)(如圖18所示)，cpt-ss-eb在不含gsh的pbs中非常穩(wěn)定，并且在72小時內(nèi)僅釋放～3％的cpt(圖18中接近橫坐標(biāo)的方塊標(biāo)記的曲線)。相比之下，在gsh的存在下，超過80％的喜樹堿在12小時內(nèi)快速釋放(圖18中最高處的原點標(biāo)記的曲線)。該結(jié)果表明二硫鍵容易被gsh切割，其隨后導(dǎo)致碳酸酯鍵的分解以產(chǎn)生游離的喜樹堿。這些結(jié)果同時表明，cpt-ss-eb在正常生理條件(例如鹽水，血液和細(xì)胞外基質(zhì))中相對穩(wěn)定，但在細(xì)胞內(nèi)，特別是具有升高的gsh水平的癌細(xì)胞中快速重新釋放高毒性cpt。如我們所預(yù)期的，沒有二硫鍵，cpt-cc-eb在pbs或單獨的10mmgsh中均釋放有限量(<5％)的cpt。

實施例19：體外細(xì)胞毒性測定

將人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系u87mg，人結(jié)腸癌細(xì)胞hct116，人肺癌細(xì)胞系a549或小鼠乳腺癌4t1接種在96孔板中。將細(xì)胞在37℃下在含有5％二氧化碳的潮濕氣氛中孵育。接種后24小時用新鮮培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基。將喜樹堿等制劑溶解在溶劑中，并使用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋。對于每個孔，加入100μl具有不同指定藥物濃度的細(xì)胞培養(yǎng)基。將細(xì)胞孵育48小時，并且在此期間后，用含有0.5mg/ml的3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑(mtt)的100μl培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基。細(xì)胞與試劑孵育2小時后，小心地除去含有未反應(yīng)的mtt的培養(yǎng)基。然后，將獲得的藍(lán)色晶體溶解于100μldmso中，并在bioteksynergyh4混合讀數(shù)器中在570nm的波長下測量吸光度。將空白減去測量的光密度(od)值，并且基于對照未處理細(xì)胞的相對吸光度計算細(xì)胞活力。使用graphpadprism5進(jìn)行ic50值的計算和統(tǒng)計分析。

我們首先測試了對來自結(jié)腸癌的細(xì)胞系hct116的體外細(xì)胞毒性(圖19a)。如我們所預(yù)期的，fda批準(zhǔn)的ir顯示出比cpt(0.087μm)高得多的ic50(1.8μm)。cpt-cc-eb顯示出最低的細(xì)胞毒性，因為活性羥基轉(zhuǎn)化成與eb的穩(wěn)定酯鍵。cpt-cc-eb的低毒性還表明cpt-ss-eb在血液循環(huán)期間可能具有低毒性，其中g(shù)sh濃度低。cpt-ss-eb的ic50值確定為0.15μm，其類似于高效的cpt，但比cpt-cc-eb低近300倍。這表明細(xì)胞內(nèi)gsh能夠從還原敏感性藥物兩親物cpt-ss-eb切割cpt。另外cpt-ss-eb-2的細(xì)胞毒性比cpt-ss-eb稍低(ic50為0.29μm)，但也顯著高于ir。cpt-cc-eb-2毒性與cpt-cc-eb類似。值得注意的是，u87mg對cpt-ss-eb和cpt也顯示出非常高的靈敏度，ic50值分別為0.31μm和0.12μm(參見圖19b)。我們還證實，cpt-ss-eb和cpt對4t1和a549癌細(xì)胞具有相似的細(xì)胞毒性(參見圖19c、圖19d)，盡管與hct116細(xì)胞相比，所有制劑對這些細(xì)胞的敏感性相對較低?？傊@些研究表明本發(fā)明的喜樹堿類前藥不但都具有良好的水溶性和穩(wěn)定性，而且其中的cpt-ss-eb、cpt-ss-eb-2等二硫鍵連接的前藥與cpt具有相當(dāng)?shù)捏w外細(xì)胞毒性，并且比fda批準(zhǔn)的ir更有效，并且可切割的連接體能夠顯著抑制癌細(xì)胞增殖。

實施例20：體外細(xì)胞攝取

使用共聚焦激光掃描顯微鏡和流式細(xì)胞儀研究喜樹堿體外細(xì)胞攝取。將eb-ss-cpt和eb-cc-cpt(10μm)與hct116細(xì)胞孵育4小時，并用lysotrackergreen和10μg/mlhoechst33342在細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育0.5小時，共聚焦觀察。然后將細(xì)胞用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌三次，之后在zeisslsm780共聚焦顯微鏡上成像?；蛘撸瑢τ诹魇郊?xì)胞術(shù)分析，將hct116細(xì)胞接種到24孔板中，24小時后，用eb-ss-cpt、eb-cc-cpt、喜樹堿、伊立替康和eb-胺(10μm每種藥物)4小時。然后，使用胰蛋白酶分離細(xì)胞，并用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌三次。使用bdbeckmancoulter流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞的熒光強度。eb熒光：激發(fā)532nm，發(fā)射660nm；cpt熒光：激發(fā)-355nm，發(fā)射450nm。

由于eb是熒光的，特別是在與白蛋白結(jié)合后，這些藥物兩親性前藥可以直接成像，而不需要另外的染料標(biāo)記。在hct116細(xì)胞的共聚焦顯微鏡中，細(xì)胞核通過hoechst染色，溶酶體使用lysotrackergreen染色。孵育4小時后，cpt-ss-eb和cpt-cc-eb定位于溶酶體和細(xì)胞核中(參見圖20a-b，其中a體現(xiàn)cpt-cc-eb的細(xì)胞內(nèi)吞；b體現(xiàn)cpt-ss-eb的細(xì)胞內(nèi)吞)，表明本發(fā)明的藥物兩親物可通過內(nèi)吞途徑內(nèi)化。我們進(jìn)一步進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析以嘗試比較不同制劑的細(xì)胞攝取(圖21)。根據(jù)喜樹堿熒光，與游離喜樹堿、伊立替康和未處理的對照相比，本發(fā)明的cpt-ss-eb和cpt-cc-eb兩種藥物兩親物具有高得多的細(xì)胞攝取(如圖21中左圖所示)。此外，基于eb熒光，本發(fā)明的cpt-ss-eb和cpt-cc-eb兩種藥物兩親性前藥與eb和對照相比具有高細(xì)胞攝取(如圖21中右圖所示)。從上述實驗結(jié)果可以得出，本發(fā)明的cpt-ss-eb等二硫鍵連接的前藥和cpt-cc-eb等碳-碳鍵連接的前藥，都可被hct116細(xì)胞有效內(nèi)吞。

實施例21：hct116腫瘤的體內(nèi)正電子發(fā)射計算機斷層掃描(pet)成像。

通過皮下注射5×10⁶個hct116細(xì)胞在磷酸鹽緩沖鹽水(100μl)中的懸浮液制備裸鼠hct116移植瘤：(7周齡，雌性)。當(dāng)腫瘤大小達(dá)到500-1000mm³時，將小鼠用于pet成像。在示蹤劑注射前使用異氟烷/氧氣(2％v/v)麻醉小鼠。將麻醉的小鼠靜脈內(nèi)注射在磷酸鹽緩沖鹽水(100μl)中配置的⁶⁴cu標(biāo)記的實施例12制備的cpt-nota-eb和實施例14制備的cpt-nota(4.44-5.55mbq/120-150μci每只小鼠)。在注射后指定的時間點，在inveondpet掃描儀(siemensmedicalsolutions，malvern，pa)上掃描小鼠。使用3d有序子集期望最大化算法重建沒有衰減或散射的校正的正電子發(fā)射計算機斷層掃描圖像。使用asiprovmtm軟件進(jìn)行圖像分析。在任何感興趣的器官上繪制感興趣的區(qū)域(roi)以計算％id/g。

上述小鼠在注射后48小時處死。收集器官和血液并濕稱重。將收集的器官和血液與一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液一起在γ-計數(shù)器(wallacwizard1480，perkinelmer)上測量⁶⁴cu放射性。將器官和血液的放射性轉(zhuǎn)換以計算目標(biāo)器官中的注射劑量(％id)的百分比和每克組織的注射劑量的百分比(％id/g)。

通過pet成像(圖22)，我們發(fā)現(xiàn)cpt-eb逐漸積累在腫瘤中(圖22a)，而cpt的沒有明顯積累(圖22b)。我們進(jìn)一步量化cpt-eb和cpt在心臟、腫瘤和肝臟的分布。如圖22c所示，cpt-eb的濃度隨時間逐漸降低，血液半衰期為～6.5小時(圖16)。相比之下，cpt濃度迅速下降，血液半衰期僅為～3分鐘。cpt-eb的曲線下面積(auc)為221.2±17.9h*％id/g，比cpt的面積(7.3±1.2h*％id/g)增大了30倍。半衰期的130倍增加和auc的30倍增加證明cpt-eb具有比cpt長得多的血液循環(huán)時間。更重要的是，cpt-eb的腫瘤攝取從5分鐘時的1.18±0.24％id/g迅速增加到5小時的5.61±1.14％id/g，然后逐漸增加至6.33±0.22％id/24小時(如圖22d所示)。對于cpt，觀測到的則是相反的趨勢：在注射后5分鐘時最高濃度為0.79±0.27％id/g，并且在注射后24小時衰減至接近零(圖22d)。cpt濃度的急劇下降可能是由于高的肝吸收，然后被消化并從身體排出(圖22e)。通過γ-計數(shù)的體外定量的器官放射性還證實了注射后48小時的cpt-eb在腫瘤組織中的4.26±0.97％id/g比cpt在腫瘤組織中更有效的積累(圖22f)。值得注意的是，在腎臟中有顯著量的放射性，表明cpt-eb可能從可逆結(jié)合的白蛋白分離并通過腎清除從體內(nèi)排出。這些體內(nèi)藥代動力學(xué)和生物分布清楚地表明本發(fā)明的藥物兩親性前藥具有較長的血液循環(huán)和較高的腫瘤富集。

實施例22：hct116荷瘤小鼠的體內(nèi)治療

通過皮下注射5×10⁶個hct116細(xì)胞在磷酸鹽緩沖鹽水(100μl)中的懸浮液制備hct116荷瘤裸鼠(7周齡，雌性)。當(dāng)在腫瘤接種后第10天建立腫瘤時，通過每3天靜脈內(nèi)注射100μl藥物(cpt-ss-eb、cpt-cc-eb、ir、cpt)或磷酸鹽緩沖鹽水最多5次開始用相同方案治療小鼠(按喜樹堿的劑量計算：3mg/公斤)。每三天監(jiān)測腫瘤體積和小鼠重量。當(dāng)腫瘤的任何尺寸超過2cm或當(dāng)小鼠體重減輕超過20％時，對小鼠實施安樂死。使用以下公式分別計算每種類型腫瘤的體積：體積＝(長度×寬度²)/2。

如圖23所示，cpt-ss-eb顯示出最有效的抗腫瘤效果，能夠顯著延遲腫瘤發(fā)展(參見圖23中接近橫坐標(biāo)的菱形標(biāo)記的曲線)。cpt-cc-eb的抗腫瘤活性與fda批準(zhǔn)的伊諾替康(ir)在治療后22天內(nèi)的抗腫瘤功效相當(dāng)(參見圖23中處于中間位置的菱形標(biāo)記曲線和倒三角形標(biāo)記曲線)。此外，很重要的一點是，用cpt-ss-eb和cpt-cc-eb治療的小鼠在治療過程中均生存良好，體重未明顯下降；然而，用喜樹堿(cpt)治療的小鼠發(fā)生了嚴(yán)重減重(減少20％)和注射部位的損傷，并且由于副作用而必須在接種后第18天處死(參見圖23中接近橫坐標(biāo)的三角形標(biāo)記曲線)。這些結(jié)果進(jìn)一步證明，本發(fā)明的喜樹堿類前藥的抗腫瘤效果達(dá)到甚至超過了現(xiàn)有的常規(guī)抗腫瘤藥，尤其是具有二硫鍵的藥物兩親性前藥納米組裝體表現(xiàn)出了非常有效的治療效果和低副作用。