專利名稱：特異性配體在msrv相關(guān)疾病中的治療用途的制作方法
特異性配體在MSRV相關(guān)疾病中的治療用途本發(fā)明的目的是一種對(duì)靶分子(抗配體)顯示顯著結(jié)合的配體。根據(jù)本發(fā)明，“抗配體”是MSRV-ENV (包膜)蛋白，MSRV是多發(fā)性硬化相關(guān)的逆轉(zhuǎn)錄 病毒(Perron等，1997)?！癕olecular identification of a novel retrovirus repeatedly isolated from patients with multiple sclerosis. The Collaborative Research Group on Multiple Sclerosis. "Proc Natl Acad Sci USA 94(14) :7583-8?！癕SRV_ENV蛋白，，應(yīng)當(dāng) 被理解為MSRV env基因編碼的完整或部分蛋白產(chǎn)物，如下定義=Komurian-Pradel, F等人 (1999). Virology 260(1) 1-9，和 Rolland 八等口006)了 Immunol 176 (12) :7636-44 或模擬 MRSV-ENV的抗原或結(jié)合特性的任意分子(模擬位)。“ENV-T”對(duì)應(yīng)于完整蛋白，這在實(shí)施例2 中詳述(殘基1到542)，“ENV-SU”也稱為ENV-I，對(duì)應(yīng)于實(shí)施例2詳述的S30到K316序列。 Env-SU也可以參考Rolland A等人Q006)J Immunol 176 (12) :7636_44。如通常針對(duì)逆轉(zhuǎn)錄 病毒來(lái)說(shuō)，MSRV在其包膜蛋白-ENV-顯示變異性(Perron，H等人Q000)J Neurovirol 6 S67-75 ；Voisset, C, 0. Bouton 等人(2000)AIDS Res Hum Retroviruses 16(8) :731-40)。 已經(jīng)顯示存在模擬MSRV ENV部分蛋白片段的模擬位，其被來(lái)自多發(fā)性硬化患者的抗體 選擇性結(jié)合(Jolivet-Reynaud, C, H. Perron 等(1999)。"Specificities of multiple sclerosis cerebrospinal fluid and serum antibodies against mimotopes.，，Clin Immunol 93(3) :283-93)。更具體的，本發(fā)明的配體包括具有如下所示氨基酸序列的各種互補(bǔ)決定區(qū)(CDR) 氨基酸序列 SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5 和 SEQ ID No. 6或具有以下所述的任意序列如下指示的所述序列內(nèi)的大量取代的氨基酸，并且已知可用于獲得功能等同的氨 基酸序列(Huang 1986 ；Zabin, Horvath 等人 1991 ；Edgar and Schwartz 1992 ；Sardana, Emini 等人 1992 ；Xu, Kapfer 等人 1992 ；Lamande 禾口 Bateman 1993 ；Verdoliva, Ruvo 等 1995 ；Yu Jchurr 等人 1995 ；ffehrmann, Van Vliet 等人 1996 ；Ullmann，Hauswald等人 1997 ； Minuth, Kramer 等 1998 ；Ullmann, Hauswald 等 2000 Janke, Martin 等人 2003) =CDRl (SEQ ID No. 1)中從 O 到 3，CDR2 (SEQ ID No. 2)中從 O 到 2，CDR3 (SEQ ID No. 3)中從 O 到 2， CDR4 (SEQ ID No. 4)中從 O 到 1，CDR5(SEQ ID No. 5)中從 O 到 4，CDR6 (SEQ ID No. 6)中從 O到2，或-在如SEQID No. 1到SEQ ID No. 6所示氨基酸序列內(nèi)，氨基酸用具有等同化學(xué) 功能和特性的其他氨基酸取代，以及按照例如下列表格的類(lèi)似氨基酸(一個(gè)字母代碼)所 示用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他氨基酸取代(也稱為“氨基酸相似性”)G或A，F(xiàn)或Y， D或E，N或Q，K或R或H，S或T，C或M，V或L或I，W或P和/或根據(jù)現(xiàn)有領(lǐng)域的取代 (Huang 1986 ；Zabin, Horvath 等 1991 ；Edgar and Schwartz 1992 ；Sardana, Emini 等 1992 ； Xu, Kapfer 等 1992 ；Lamande and Bateman 1993 ；Verdoliva, Ruvo 等 1995 ；Yu, Schurr 等 1995 ；ffehrmann, Van Vliet 等 1996 ；Ullmann, Hauswald 等 1997 ；Minuth, Kramer 等 1998 ； Ullmann, Hauswald 等 2000 Janke, Martin 等 2003)。這些變體是SEQ ID Nos. 1到6所示肽段中氨基酸的缺失、添加或取代的結(jié)果，也包括在本發(fā)明中，可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法諸如定點(diǎn)誘變或化學(xué)合成獲得。本發(fā)明的配體具有結(jié)合本發(fā)明抗配體的能力。根據(jù)本發(fā)明，“結(jié)合(bind) ”或“結(jié)合(binding) ”的表述應(yīng)理解為配體明顯識(shí)別根 據(jù)實(shí)施例5所給標(biāo)準(zhǔn)的抗配體。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，所述配體包括輕鏈可變區(qū)(VL)和重鏈可變區(qū)(VH)，所述 輕鏈可變區(qū)包括具有如SEQ ID No. 1，SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 3所示的氨基酸序列或與 所述序列具有至少80%同一性和更優(yōu)選的90%同一性的任意序列的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，所 述重鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域包括具有如SEQ ID No. 4,SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示的氨基酸 序列或與所述序列具有至少80%同一性和更優(yōu)選的90%同一性的⑶R。在另一方面，本發(fā)明的配體包括輕鏈可變區(qū)(VL)和重鏈可變區(qū)(VH)，所述輕鏈可 變區(qū)具有如SEQ ID No. 7所示的氨基酸序列或與所述序列具有至少75%同一性和更優(yōu)選的 80%和甚至更優(yōu)選的90%同一性的任意序列，所述重鏈可變區(qū)具有如SEQ ID No. 8所示的 氨基酸序列或與所述序列具有至少75%同一性和更優(yōu)選的80%和甚至更優(yōu)選的90%同一 性的任意序列。根據(jù)本發(fā)明這些VH和VL序列的變體與抗配體顯著結(jié)合?！靶蛄型恍浴北硎纠缭诰哂?0 %序列同一性的序列中，在序列比對(duì)時(shí)相 同位置存在80%相同的氨基酸，所述比對(duì)可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行，諸如描述于 Sequence-Evolution-Function Computational Approaches in Comparative genomics. Koonon E.等，2003 :Kluwer Academic Publishers 或根據(jù) “Mac Vector" Software (UK)" 說(shuō)明書(shū)的缺省參數(shù)。本發(fā)明的配體還可以被定義為包括于重組SCFV蛋白之內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，配體可以包括于抗體的Fab片段中，所述抗體可以是多 克隆，單克隆，寡克隆，嵌合，改造或人源化的抗體。在本發(fā)明的具體方面，包括配體的抗體 是人IgG，和更具體的是IgGl或IgG4。多克隆，寡克隆，單克隆抗體可以利用如上所述的抗配體通過(guò)傳統(tǒng)方法(諸如 由Kohler和Milstein(1975)描述的那些方法)或使用描述于Sambrook等，A Guide to Molecular Cloning, A Laboratory Manual，第二版(1989)的方法產(chǎn)生。更具體的，用于獲得抗體的本發(fā)明的抗配體是由SEQ ID No. 20或SEQ ID No. 32 所示序列或與SEQ ID No. 20或SEQ ID No. 32所示序列具有至少75%序列同一性的任意序 列或與其100%互補(bǔ)的任意序列組成的抗配體。尤其是采用連接到載體蛋白的肽的形式，所述載體蛋白諸如用于免疫的血清白蛋 白或KLH。本發(fā)明還涉及包括本發(fā)明配體作為活性成分的藥物組合物。該配體還能夠以 kFv、Fab片段或抗體的形式存在于藥物組合物中。本發(fā)明的藥物組合物用于治療MSRV相
關(guān)疾病。在本發(fā)明的含義中，“治療”包括預(yù)防性或治愈性治療。本發(fā)明藥物組合物的給藥 量將是治療有效和免疫原性的，并且是本領(lǐng)域已知的，給藥的劑量取決于待治療的個(gè)體。在另一方面，本發(fā)明涉及一種治療方法，包括給藥配體、ScFv、Fab片段或抗體或在 如上公開(kāi)的維持其結(jié)合特性的任意分子或合適治療載體中的配體或如上所述的藥物組合 物。
本發(fā)明的治療方法目的在于治療MSRV相關(guān)疾病。MSRV是首先從多發(fā)性硬化患者分離的人逆轉(zhuǎn)錄病毒(Perron，H.，B. Lalande等 (1991)，Lancet 337(8745) :862-3 ；Perron, H.，J.A. Garson 等(1997)，Proc Natl Acad Sci USA 94(14) :7583-8)。相關(guān)疾病或綜合征被定義為在相應(yīng)患者中存在以下情況中的一 種(i)特定MSRV RNA或抗原，.優(yōu)選的在體液(血液，腦脊液，尿液...)中檢測(cè)到，(ii) 來(lái)自病變或功能障礙器官的細(xì)胞或組織中DNA或RNA拷貝數(shù)增加，(iii)涉及疾病或臨床綜 合征的過(guò)程的細(xì)胞或組織中的特定MSRV蛋白或抗原，或(iv)患有疾病的個(gè)體或表現(xiàn)臨床 綜合征的個(gè)體的體液中的MSRV蛋白或抗原(如實(shí)施例8所述，參見(jiàn)下文及其他部分)。因 為MSRV與人內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒W(wǎng)型(HERV-W)家族具有遺傳同源性(Blond等1999 ；Dolei, 2005 ；Dolei and Perron，2008)，MSRV相關(guān)疾病的選擇性或互補(bǔ)性定義還可以由用于相同 檢測(cè)試驗(yàn)的HERV-W核酸、抗原或蛋白獲得(Antony等，2004 ；Arru等，2007 ；Karlsson等， 2004 ；MameIi等，2007)。此外，MSRV表達(dá)與在致病性病變中共檢測(cè)到的一些HERV-W拷貝 的上調(diào)有關(guān)(Mameli等，2009)。因此MSRV相關(guān)疾病的定義隱含地包括與HERV-W元件相關(guān) 聯(lián)。當(dāng)與炎癥或免疫失調(diào)有關(guān)以及與上文所述的MSRV表達(dá)產(chǎn)物的存在有關(guān)時(shí)，MSRV 相關(guān)疾病選自多發(fā)性硬化、精神分裂癥、臨床孤立綜合征(CIS，具有神經(jīng)學(xué)癥狀)、慢性炎 性脫髓鞘多神經(jīng)病、癲癇癥、銀屑病、癌癥、炎性胰腺炎和糖尿病，諸如1型或2型糖尿病。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，MSRV相關(guān)疾病的治療方法包括利用有規(guī)律地重復(fù)注射 給藥IgG4或IgGl抗體作為慢性治療。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種核酸分子，其包括如SEQ ID No. 13,SEQ ID No. 14、 SEQ ID No. 15、SEQ ID No. 16、SEQ ID No. 17、SEQ IDNo. 18 所示序列的至少一種全長(zhǎng)核酸 序列或與所述序列具有至少70%，更優(yōu)選的80%，甚至更優(yōu)選的90%同一性的任意序列或 與其100%互補(bǔ)的任意序列?！靶蛄型恍浴北硎纠缭诰哂?0%序列同一性的序列中，在序列比對(duì)時(shí)相同位 置存在80%相同的核苷酸，所述比對(duì)可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行。(參見(jiàn)上文)在本發(fā)明上述方面優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸分子包括SEQ ID No. 13、SEQ ID No. 14、SEQ ID No. 15、SEQ ID No. 16、SEQ ID No. 17 和 SEQ IDNo. 18所示的每種序列，或與所述序列具有至少70%和更優(yōu)選的80%和甚至更優(yōu) 選的90%同一性的任意序列，或與其100%互補(bǔ)的任意序列。在本發(fā)明的另一方面，核酸編碼VH鏈，更具體的，所述核算由以下序列表示SEQ ID No. 10或12或與所述序列具有至少70%、更優(yōu)選80%、甚至更優(yōu)選90%同一性的任意 序列，或與其100%互補(bǔ)的任意序列，但不限于維持原始配體或抗配體分子的抗原性和結(jié)合 性的如先前描述的取代、插入和缺失百分比并(Huang 1986 ；Zabin，Horvath等1991 ；Edgar 禾口 Schwartz 1992 ；Sardana, Emini 等 1992 ；Xu, Kapfer 等.1992 ；Lamande 禾口 Bateman 1993 ；Verdoliva，Ruvo 等 1995 ；Yu，khurr 等 1995 ；ffehrmann, Van Vliet 等 1996 ；Ullmann, Hauswald 等 1997 ；Minuth, Kramer 等 1998 ；Ullmann, Hauswald 等 2000 Janke, Martin 等 2003)。核酸序列還能夠編碼VL鏈，所述核算由以下序列表示序列SEQ ID No. 9或11，或 與所述序列具有至少70 %、更優(yōu)選80 %、甚至更優(yōu)選90 %同一性的任意序列，或與其100 %互補(bǔ)的任意序列，但不限于維持原始配體或抗配體分子的抗原性和結(jié)合性的如先前描述 的取代、插入和缺失百分比并(Huang 1986 ；Zabin, Horvath等1991 ；Edgar和khwartz 1992 ；Sardana, Emini 等 1992 ；Xu, Kapfer 等 1992 ；Lamande 禾口 Bateman 1993 ；Verdoliva, Ruvo 等 1995 ；Yu, Schurr 等 1995 ；ffehrmann, Van Vliet 等· 1996 ；UlImann，Hauswald 等 1997 ；Minuth, Kramer 等 1998 ；Ullmann, Hauswald 等 2000 Janke, Martin 等 2003)。本發(fā)明還包括在嚴(yán)格條件下與編碼本發(fā)明至少一種肽的核酸雜交的任意核酸。如 本文使用的，術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)格條件”是指允許探針序列與待檢測(cè)的核苷酸序列雜交的條件。合適 的嚴(yán)格條件可以由以下確定例如預(yù)雜交和雜交溶液中鹽或甲酰胺的濃度，或雜交溫度，這 是本領(lǐng)域公知的。尤其是，可以通過(guò)降低鹽濃度、增加甲酰胺濃度或提高雜交溫度來(lái)增加嚴(yán) 格性。通過(guò)計(jì)算目標(biāo)核酸中嘌呤對(duì)嘧啶的比例進(jìn)而改變溫度可以進(jìn)一步縮小對(duì)應(yīng)于具體嚴(yán) 格水平的溫度范圍。關(guān)于上述范圍和條件的改變是本領(lǐng)域公知的。本發(fā)明還涉及一種嵌合基因，其包括彼此功能性連接的至少一種啟動(dòng)子(在宿主 生物體中具有功能)、本發(fā)明的核酸和終止子元件(在相同的宿主生物體中具有功能)。嵌 合基因包含的各種元件是首先是調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、翻譯和蛋白成熟的元件，諸如啟動(dòng)子，編碼信 號(hào)肽或轉(zhuǎn)運(yùn)肽的序列，或構(gòu)成多腺苷酸化信號(hào)的終止子元件，再者是編碼蛋白的多核苷酸。 表述“彼此功能性連接”意指嵌合基因的所述元件彼此連接使得這些元件其中一種的功能 受到另一個(gè)元件的影響。舉例來(lái)說(shuō)，當(dāng)啟動(dòng)子能夠影響所述編碼序列的表達(dá)時(shí)，啟動(dòng)子就是 與編碼序列功能性連接。本發(fā)明嵌合基因的構(gòu)建及其各種元件的組裝可以使用本領(lǐng)域技術(shù) 人員公知的技術(shù)進(jìn)行，尤其描述于Sambrook等(1989，Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Nolan C. ed. , New York : Co Id Spring Harbor Laboratory Press)。構(gòu)成嵌合基 因的調(diào)節(jié)元件的選擇基本上取決于宿主生物體(其中它們必須具有功能)，本領(lǐng)域技術(shù)人 員能夠選擇在指定宿主生物體中具有功能的調(diào)節(jié)元件。術(shù)語(yǔ)“具有功能”旨在表示能夠在 指定宿主生物體中發(fā)揮功能。本發(fā)明嵌合基因包含的啟動(dòng)子是組成型或誘導(dǎo)型的。舉例來(lái)說(shuō)，常見(jiàn)用于哺乳動(dòng) 物細(xì)胞中表達(dá)的有效啟動(dòng)子是pCMV(巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子)。根據(jù)本發(fā)明，嵌合基因還可以包括其他調(diào)節(jié)序列，其位于啟動(dòng)子和編碼序列之間， 諸如轉(zhuǎn)錄活化因子(增強(qiáng)子)。本發(fā)明還涉及一種包括本發(fā)明嵌合基因的克隆和/或表達(dá)載體。本發(fā)明的載體 用于轉(zhuǎn)化宿主生物體及在該生物體中表達(dá)配體。這種載體可以是質(zhì)粒、粘粒、噬菌體或病 毒。優(yōu)選的，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化載體是質(zhì)粒。通常，該載體的主要性質(zhì)是在宿主生物體的細(xì)胞 中維持自身和自我復(fù)制的能力，尤其是借助于復(fù)制起點(diǎn)的存在，以及在其中表達(dá)配體的能 力。為了宿主生物體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，還可以將載體插入基因組。然后載體的組成限于宿主中 合成配體需要的元件。這類(lèi)載體的選擇，以及將本發(fā)明嵌合基因插入該載體的技術(shù)，詳盡的 描述于 Sambrook 等(1989, Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Nolan C. ed. , New York : Co Id Spring Harbor Laboratory Press),屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的普通知識(shí)。有禾Ij 地，除了本發(fā)明的嵌合基因之外，用于本發(fā)明的載體還包含編碼選擇性標(biāo)記物的嵌合基因。 這種選擇性標(biāo)記物使得能夠選擇有效轉(zhuǎn)化的宿主生物體，即摻入載體的那些。上文所述的 可以由編碼容易鑒別的酶(諸如GUS酶)的基因，或編碼色素或調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化細(xì)胞中色素產(chǎn)生 的酶的基因?qū)崿F(xiàn)。這類(lèi)選擇性標(biāo)志基因具體描述于專利申請(qǐng)WO 91/02071、WO 95/06128、WO 96/38567 和 WO 97/04103。本發(fā)明還涉及包含至少一種本發(fā)明嵌合基因的轉(zhuǎn)化宿主生物體，或整合入它們的 基因組或攜帶在染色體外遺傳元件上，例如質(zhì)粒。術(shù)語(yǔ)“宿主生物體”旨在表示任意低級(jí) 或高級(jí)的單細(xì)胞或細(xì)胞外周生物體，本發(fā)明的嵌合基因可以被引入其中以產(chǎn)生本發(fā)明的配 體。優(yōu)選的，宿主生物體是中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO，Chinese Hamster Ovary)細(xì)胞或人胚腎細(xì) 胞(HEK, Human Epthelium Kidney)細(xì)胞。表述“轉(zhuǎn)化的宿主生物體”旨在表示一種宿主生物體，其具有整合入其基因組或在 染色體外遺傳元件(例如質(zhì)粒)中的至少一種本發(fā)明嵌合基因，從而在其組織或培養(yǎng)基中 產(chǎn)生配體。為了獲得本的發(fā)明宿主生物體，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用許多已知的轉(zhuǎn)化方法之一。這些方法之一包括將待轉(zhuǎn)化的宿主生物體的細(xì)胞或組織與聚乙二醇(PEG)和本 發(fā)明載體接觸(Chang and Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168(1), 111-115 ；Mercenier and Chassy，1988，Biochimie 70 (4)，503-517)。電穿孔是另一種方法，其包括將待轉(zhuǎn)化的細(xì) 胞或組織和本發(fā)明的載體置于電場(chǎng)中(Andreason和Evans，1988，Biotechniques 6(7)， 650-660 ；Shigekawa 禾口 Dower，1989，Aust. J. Biotechnol. 3 (1)，56—62)。另一種方法包 括通過(guò)顯微注射將載體直接注射入細(xì)胞或組織(Gordon和Ruddle. 1985，Gene 33(2), 121-136)。有利地，可以使用“生物彈道學(xué)(biolistic)”方法。它包括用其上吸附本 發(fā)明載體的顆粒轟擊細(xì)胞或組織(Bruce等.，1989，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86(24), 9692-9696 ；Klein 等，1992，Biotechnology 10 (3) ；286-291 ；U. S. Pat. No. 4，945，050)。本發(fā)明還包括用于產(chǎn)生如上所述的配體、ScFv, Fab片段或抗體的方法，包括在允 許合成配體、Fab片段或抗體的條件下培養(yǎng)上述宿主細(xì)胞的步驟。本發(fā)明配體的特征在于其結(jié)合抗配體的特性。在特定形式中，本發(fā)明抗配體的特 征在于它包括SEQ ID No. 20定義的氨基酸序列，優(yōu)選的選擇由SEQ ID No. 32表示。一種檢測(cè)生物樣品中抗配體的方法，使用本發(fā)明ScFv、Fab片段或抗體形式的配 體，也是本發(fā)明的一部分。所述方法包括以下步驟(a)將樣品與本發(fā)明的配體(如上所述的&Fv、Fab片段或抗體)接觸，(b)檢測(cè)樣品中抗配體的存在。所述檢測(cè)方法可以通過(guò)將樣品與特異性結(jié)合MSRV GAG抗原(由MSRV gag基因編 碼，描述于 “Komurian-Pradel 等，Virology, 1999 ；260(1),H 1-9 頁(yè)”)的配體接觸的額外 步驟實(shí)現(xiàn)。根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明還涉及檢測(cè)生物樣品中抗配體的免疫測(cè)定試劑盒，所述 試劑盒包括本發(fā)明的配體，如上所述的&FV、Fab片段或抗體，以及用于檢測(cè)抗配體與上述 配體、Fab片段或抗原的特異性結(jié)合的試劑，所述試劑盒還包括免疫反應(yīng)必需的所有試劑。 所述試劑盒此外可以包括與先前定義的GAG抗原特異性結(jié)合的配體。根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明還涉及如上所述的這類(lèi)免疫測(cè)定試劑盒在檢測(cè)MSRV相 關(guān)疾病中的用途，所述MSRV相關(guān)疾病選自多發(fā)性硬化癥、精神分裂癥、臨床孤立綜合征、 慢性炎性脫髓鞘多神經(jīng)病、癲癇癥、銀屑病、癌癥、炎性胰腺炎和糖尿病，更具體的是1型糖 尿病或2型糖尿病。生物樣品可以是血清，尿液，唾液，活檢材料等等。免疫測(cè)定法的設(shè)計(jì)是本領(lǐng)域常用的，實(shí)驗(yàn)方案諸如固相支持物或免疫沉淀的使用是公知技術(shù)?？贵w可以被標(biāo)記用于檢測(cè) 目的，使用酶促、熒光、化學(xué)發(fā)光、放射性或染料標(biāo)記。擴(kuò)大免疫復(fù)合物的信號(hào)的測(cè)定法(諸 如使用生物素和抗生物素蛋白或鏈霉親和素的測(cè)定法)以及酶聯(lián)免疫測(cè)定諸如ELISA或夾 心測(cè)定法屬于本發(fā)明的一部分。附1 : (A)VL氨基酸序列，(B)VH氨基酸序列，⑶R序列用下劃線表示圖2 完整ENV蛋白(ENV-T)和表面切割片段(ENV 1或ENV-SU)的結(jié)構(gòu)圖3 利用過(guò)氧化物酶底物進(jìn)行比色法測(cè)量的光密度，比較鼠GNbACl抗體配體 (鼠IgGl perox)以及只含有配體的重組ScFv片段(ScFv VH+VL biot)。包被抗體的濃度和每種檢測(cè)配體的濃度均為5 μ g/ml ；鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶 偶聯(lián)物稀釋度是1/2000。圖4 利用過(guò)氧化物酶底物通過(guò)比色法測(cè)量的光密度，比較鼠GNbACl抗體配體以 及只含有配體的Fab結(jié)合片段。每種檢測(cè)配體或IgGl的濃度是10μ g/ml+1/250稀釋的 Jackson公司的過(guò)氧化物酶抗-Fab或抗-IgG。檢測(cè)不同的ENV-T濃度。圖5 在ENV抗原(ENV-T)的系列稀釋物上檢測(cè)GNbACl和本發(fā)明的嵌合抗體IgGl 和IgG4?？贵w濃度是lmg/ml，過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗IgG 二抗是1/250。2G5E12抗體是不與 ENV抗原結(jié)合的無(wú)關(guān)抗體，本文中用做陰性對(duì)照。圖6 在恒定抗原濃度(ENV-T)的兩個(gè)批次的配體(A)批次1，(B)批次2上檢測(cè) GNbACl和嵌合構(gòu)建體IgGl和IgG4?？乖瓭舛葹?到0. 0078原始鼠單克隆抗體(GNb ACl)， 標(biāo)記為mulgG,含有配體的人IgGl或IgG4構(gòu)建體(標(biāo)記為hulgGI和huIgG4. μ g/ml)。 Jackson公司的抗小鼠或抗人IgG 二抗的稀釋度是1/250。圖7 含有配體的GNbACl、ScFv、IgGl和IgG4嵌合人抗體的構(gòu)建體由IL-6的減 少表示的ENV抗原(ENV SU)對(duì)PBMC促炎性活化的抑制?？贵w或kFv與ENV抗原的比例 是 25/1。圖8 =ApoH-ELISA結(jié)果。在獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)室對(duì)來(lái)自關(guān)于多發(fā)性硬化的歐洲多中心研 究的血清進(jìn)行盲測(cè)。圖9 精神分裂癥患者和對(duì)照的MSRV-ENV和GAG抗原血。使用的抗體對(duì)于ENV是 2A12A5 和 6A2B2，對(duì)于 GAG 是 2G5E12。

圖10 利用6A2B2特異性單克隆抗體檢測(cè)MSRV-ENV抗原的Ap0H-ELISA的光密度 (OD)。圖11 患有急性神經(jīng)炎癥和脫髓鞘(實(shí)驗(yàn)性變應(yīng)性腦脊髓炎，多發(fā)性硬化的動(dòng)物 模型)的人源化SCID小鼠的臨床追蹤與未治療組相比，不同抗體治療組臨床結(jié)果的比 較。原始鼠單克隆抗體(GNbACl)標(biāo)記為mulgG，含有配體的人IgGl或IgG4構(gòu)建體標(biāo)記為 hulgGI 禾口 huIgG4。圖12 患有急性神經(jīng)炎癥和脫髓鞘(實(shí)驗(yàn)性變應(yīng)性腦脊髓炎，多發(fā)性硬化的動(dòng)物 模型)的人源化SCID小鼠的生存曲線與未治療組相比，不同抗體治療組臨床結(jié)果的比 較。原始鼠單克隆抗體(GNbACl)標(biāo)記為mulgG，含有配體的人IgGl或IgG4構(gòu)建體標(biāo)記為 hulgGI 禾口 huIgG4。圖13 本實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)的每只NOD-SCID小鼠的重量曲線。每只小鼠注射的ENV蛋白劑量標(biāo)示在括號(hào)中。通過(guò)箭頭標(biāo)示在IFA和PTX(PH)中乳化的ENV蛋白的最后一次注 射。根據(jù)它們接受的ENV劑量，將小鼠命名為Ml到M6，這標(biāo)示在圖例的括號(hào)中編碼后(從 0到20微克)。曲線的間斷對(duì)應(yīng)于相應(yīng)類(lèi)型的動(dòng)物死亡的日期。圖14 對(duì)照和ENV-注射的N0D-SCID小鼠(ENV)中的血糖(糖血)濃度第一次 注射的日期(Po)和最后一次注射后一周(P30)的比較。P30測(cè)量的血糖可以表示為模擬注 射和ENV-注射組在PO (Y軸)測(cè)量的血糖的百分比(X軸對(duì)照和“ENV”)。圖15 =GNb ACl抗體重鏈的CDR定義15A 根據(jù)Chothia定義鑒定的氨基酸用更小的字母表示。根據(jù)Kabat定義鑒定的 氨基酸用加下劃線的字母表示。15B 根據(jù)組合兩種確定的優(yōu)選定義，用下劃線表示考慮到移植人IgG4抗體可變 重鏈的功能性配體的原始鼠⑶R區(qū)。圖16 =GNb ACl抗體輕鏈的⑶R定義用下劃線表示根據(jù)Kabat定義鑒定的⑶R。根 據(jù)Contact定義(不是標(biāo)準(zhǔn)的)鑒定的CDR具有更小的字母。圖17 嵌合GNb ACl抗體與固定的ENV蛋白的結(jié)合活性。條件描述在相應(yīng)實(shí)施例 的正文中。Y軸代表通過(guò)比色法測(cè)定的每個(gè)點(diǎn)的光密度(OD)，并與結(jié)合靶ENV蛋白的抗體 數(shù)量相關(guān)。X軸代表用于包被微板相應(yīng)孔的ENV重組蛋白的濃度，清洗后，獲得相應(yīng)平板固 定蛋白的寬泛量譜。圖18 人源化抗體H2/VK3與固定的ENV蛋白的結(jié)合活性。條件描述在相應(yīng)實(shí)施 例的正文中。Y軸代表通過(guò)比色法測(cè)定的每個(gè)點(diǎn)的光密度(OD)，并與結(jié)合靶ENV蛋白的抗 體數(shù)量相關(guān)。X軸代表用于包被微板相應(yīng)孔的ENV重組蛋白的濃度，清洗后，獲得相應(yīng)平板 固定蛋白的寬泛量譜。圖19 人源化抗體H4/VK3與固定的ENV蛋白的結(jié)合活性。條件描述在相應(yīng)實(shí)施 例的正文中。Y軸代表通過(guò)比色法測(cè)定的每個(gè)點(diǎn)的光密度(OD)，并與結(jié)合靶ENV蛋白的抗 體數(shù)量相關(guān)。X軸代表用于包被微板相應(yīng)孔的ENV重組蛋白的濃度，清洗后，獲得相應(yīng)平板 固定蛋白的寬泛量譜。圖20 人源化抗體H2/VK3 (H2vk3)和嵌合抗體(GNbAC lIgG4)與固定的ENV的結(jié) 合活性的比較。條件描述在相應(yīng)實(shí)施例的正文中。Y軸代表通過(guò)比色法測(cè)定的每個(gè)點(diǎn)的光 密度(0D)，并與結(jié)合靶ENV蛋白的抗體數(shù)量相關(guān)。X軸代表用于包被微板相應(yīng)孔的ENV重 組蛋白的濃度，清洗后，獲得相應(yīng)平板固定蛋白的寬泛量譜。圖21 非還原性凝膠中純化的H2VK3抗體條件描述在相應(yīng)實(shí)施例的正文中。左側(cè)，KD數(shù)目表示具有指定分子量(KD)的標(biāo) 準(zhǔn)蛋白在凝膠上遷移的水平(條狀)，如附圖左側(cè)泳道所示。純化的H2/VK3抗體在附圖的 中間泳道顯示為單一條帶(箭頭)，而牛血清白蛋白(抗體緩沖液中的標(biāo)準(zhǔn)品，不同分子量 處箭頭顯示的對(duì)照)，顯示于附圖的右側(cè)泳道；圖22 純化的H2/VK3 (hH2+hVK3純化)和純化的嵌合抗體(GNbAClIgG4)與固定 的ENV (0. 5微克/ml)的結(jié)合活性的比較。X軸代表單位為納克/ml的IgG4嵌合抗體或挑 選的人源化抗體濃度。Y軸代表通過(guò)比色法測(cè)定的光密度，并與測(cè)定中結(jié)合含量恒定的固定 ENV蛋白的抗體數(shù)量相關(guān)。圖23 人源化抗體H2重鏈和VK3輕鏈的氨基酸序列。上標(biāo)黑體字的氨基酸代表框架中保留的鼠氨基酸，基于數(shù)據(jù)庫(kù)中分析的它們與人抗體序列的共有位置。圖M 通過(guò)HERV-W ENV相關(guān)蛋白刺激星形細(xì)胞強(qiáng)烈上調(diào)促炎性細(xì)胞因子結(jié)果表示為三次重復(fù)值的平均數(shù)。ENV =MSRV-ENV ；合胞素來(lái)自染色體7q拷貝的 HERV-W ENV ；X 無(wú)關(guān)抗體(對(duì)照同種型)；鼠抗-ENV =GNb ACl鼠抗體；嵌合抗-ENV =GNb ACl 嵌合人IgG4 ；Pg/ml 皮克每毫升。圖25 外周血單核細(xì)胞培養(yǎng)物結(jié)果表示為三次重復(fù)值的平均數(shù)。ENV =MSRV-ENV ；合胞素來(lái)自染色體7q拷貝的 HERV-W ENV ；X 無(wú)關(guān)抗體(對(duì)照同種型)；鼠抗-ENV =GNb AC 1鼠抗體；嵌合抗-ENV =GNb AC 1嵌合人IgG4 ；Pg/ml 皮克每毫升。圖沈人的糖基化處理HERV-W ENV蛋白與三種形式的GNb ACl配體(鼠，嵌合和 人源化抗體)的檢測(cè)。A)人糖基化處理的HERV-W ENV蛋白與GNb ACl鼠抗體的檢測(cè)。B) 人糖基化處理的HERV-W ENV蛋白與GNb ACl嵌合抗體的檢測(cè)。C)人糖基化處理的HERV-W ENV蛋白與GNb ACl人源化抗體的檢測(cè)。Y軸光密度；X軸細(xì)菌MSRV-ENV蛋白(ENV-T 7A 批次)；細(xì)菌MSRV-ENV表面片段(ENV-SU4A批次)；人糖基化合胞素；人糖基化MSRV-ENV蛋 白(ENV-T Pl 批次)。圖27 腦內(nèi)注射MSRV ENV模擬溶液(假)的大鼠的神經(jīng)行為分?jǐn)?shù)在假( 85溶液)工附4(^伍附注射的腦內(nèi)室)和ENV-hipp大鼠中腦內(nèi)注射后數(shù) 個(gè)時(shí)間點(diǎn)(P5、P6、P7、P11和P12)，接觸新鮮刺激后水平的-用Y軸穿越線的數(shù)目顯示-(A) 和垂直的-用Y軸后腿站立的次數(shù)顯示-(B)運(yùn)動(dòng)活性。圖觀腦內(nèi)注射MSRV ENV模擬溶液(假)的大鼠的神經(jīng)行為分?jǐn)?shù)在Pll的假、ENV-icv和ENV-hipp大鼠中鹽水注射后的水平的-通過(guò)穿越線的數(shù) 目在Y軸上顯示-(A)和垂直的-通過(guò)后腿站立的次數(shù)在Y軸上顯示-(B)運(yùn)動(dòng)活性。圖四腦內(nèi)注射MSRV ENV模擬溶液(假)的大鼠的神經(jīng)行為分?jǐn)?shù)在P13的假、ENV-icv和ENV-hipp大鼠中受限應(yīng)力后的水平的-通過(guò)穿越線的數(shù) 目在Y軸上顯示-(A)和垂直的-通過(guò)后腿站立的次數(shù)在Y軸上顯示-(B)運(yùn)動(dòng)活性。圖30 腦內(nèi)注射MSRV ENV的大鼠神經(jīng)行為分?jǐn)?shù)顯示IgG4GNbACl配體的治療效 果(A)在假大鼠、注射ENV(ENV+)的未治療大鼠和IgG4治療ENV+大鼠(如附圖指 示)中接觸新鮮刺激后在P12和P32在開(kāi)放野測(cè)量的水平運(yùn)動(dòng)活性-如X軸所示_，(B)在P32通過(guò)受限應(yīng)力后的水平運(yùn)動(dòng)活性觀察IgG4配體治療效果的確認(rèn)；在假 大鼠、未治療的ENV+大鼠和IgG4治療的ENV+大鼠(如附圖指示)中取消全身性注射ENV 蛋白后受限應(yīng)力之后在開(kāi)放野測(cè)量-Y軸上穿越線的數(shù)目。圖31 顯示IgGlGNbACl配體治療效果的“ENV陽(yáng)性”淋巴瘤移植裸鼠的研究注射淋巴瘤細(xì)胞19天后從對(duì)照和IgGl治療小鼠(X軸)計(jì)算的脾指數(shù)(Y軸)。 如下計(jì)算脾指數(shù)[(脾重量/體重)X 100]。沒(méi)有重疊的誤差棒表明統(tǒng)計(jì)顯著性。圖32 顯示IgGlGNbACl配體治療效果的“ENV陽(yáng)性”淋巴瘤移植SCID小鼠的研究注射B淋巴瘤細(xì)胞7天后從未治療的和IgGl治療的SCID小鼠計(jì)算的脾/體重比 (Y軸)。如下計(jì)算的脾/體重比進(jìn)行估算[(脾重量/體重)X100]。圖33 顯示IgGlGNbACl配體治療效果的“ENV陽(yáng)性”淋巴瘤移植SCID小鼠的研究
注射淋巴瘤細(xì)胞后7天和注射抗體后6天，從對(duì)照和IgGl治療小鼠收集的腹膜液 中活的和死的淋巴樣干細(xì)胞的數(shù)目-Y軸-㈧其他白細(xì)胞的數(shù)目⑶-X軸-。下列實(shí)施例是為了說(shuō)明本發(fā)明，無(wú)論如何不是限制本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1 鼠特異性抗體(GNbACl)的分析鑒定對(duì)MSRV ENV蛋白及其等同物特異 的分子配體的序列和結(jié)構(gòu)將小鼠骨髓瘤與來(lái)自Balb-C小鼠的脾細(xì)胞融合后獲得鼠雜交瘤，所述小鼠用在 大腸桿菌中產(chǎn)生并從MSRV“ENV”克隆純化的重組MSRV蛋白免疫，描述于Komurian-Pradel， F.，G. Paranhos-Baccala 等(1999)，Virology 260(1) :1_9)。來(lái)自該IgGl/Kappa(GNbACl)生成雜交瘤的VH和VL區(qū)的PCR擴(kuò)增根據(jù)下列方案 實(shí)現(xiàn)。根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)，利用mRNA純化試劑盒(Amersham Bioscience)從5X107 個(gè)生成IgGl/Kappa的雜交瘤細(xì)胞提取并純化Poly (A+) RNAs。根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)，使 用RT-PCR試劑盒(Amersham Bioscience)從800ng mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。按照先前的描述 (Ruberti 等，1994，J. Immunol. Methods 173，33-39)，利用 cDNA 末端快速擴(kuò)增(RACE)法獲 得輕鏈(VL)和重鏈(VH)的cDNA編碼可變區(qū)基因序列。正向引物如下SEQID No. 21 (RACEforward)，反向引物SEQ ID No. 22 (CL_ Alal30_Fwd)用于 VL 擴(kuò)增，正向引物 SEQ ID No. 23 (CHl_Proll9_Fwd)用于 VH 擴(kuò)增，字 母代碼 R = A/G, K = G/T, H = A/T/C。反向引物 CL_Alal30_Backward 和 CHl_Prol 19_ Backward, 從 Kabat 等(1991)Sequences of proteins of immunological interest. National Institute of Health Bethesda，MD)的共有序列推導(dǎo)得出，對(duì)小鼠 kappa/CL 結(jié) 構(gòu)域和IgG/CHl結(jié)構(gòu)域的N端特異。使用Taq DNA聚合酶獲得PCR產(chǎn)物，然后根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)，使用TA克隆試 劑盒(Invitrogen)將其直接連入pCR 2.1-TOPO 載體。使用循環(huán)測(cè)序試劑盒(Dye Terminator Cycle S equencing Ready Reaction Kit，Applied Biosystems 公司)在 ABI310自動(dòng)測(cè)序儀上測(cè)序來(lái)確定克隆的DNA的序列。這些PCR擴(kuò)增，繼之以克隆和測(cè)序步驟分別提供SEQ ID No. 7和8表示的VL和 VH鏈的序列，它們的氨基酸序列從原始核苷酸序列推導(dǎo)得出。此外，這些氨基酸序列的 分析允許鑒定涉及配體特異性的互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R)(根據(jù)Kabat，Wu和Kabat 1970，An analysis ofthe sequences of the variable regiohs of Bence Jones proteins and myeloma light chains and their implications for antibody complementarity. J. Exp. Med. 1 32:2 1 1-250 ;Kabat 等人 1987,1991, Sequences of proteins of immunological interest ；第四版 US Govt. Printing Off. No. 165-492)或通過(guò)結(jié)構(gòu)，根據(jù) Chothia 和 Lesk 1987, Canonical structures for the hypervahable regions of immunoglobulins. J. MoI. Biol. 196 :901-917 ；Chothia 等 人 1989, Conformations of immunoglobulin hypervariable regions. Nature 342 :877-883)。VH氨基酸序列上鑒定出3個(gè)CDR序列(圖IB)，對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5 和SEQ ID N0. 6，在VL氨基酸序列上鑒定出3個(gè)⑶R序列(圖1A)，對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2和SEQ ID NO. 3。這6個(gè)CDR序列代表配體結(jié)合特異性所需的核心“最小”序 列，包括在保留當(dāng)前鑒定的特異性配體的活性的任意組合物或分子構(gòu)建體中。盡管如此，本 領(lǐng)域技術(shù)人員都知道少數(shù)氨基酸可以被替代具有等同特性，因此保留原始配體序列的特異 性，使其成為等同配體。已知這類(lèi)變體可能在10-12%的最大范圍內(nèi)。實(shí)施例2 =MSRV ENV抗原產(chǎn)生和免疫的實(shí)施例——為了獲得抗ENV反應(yīng)性脾細(xì)胞 用于產(chǎn)生特異性雜交瘤來(lái)源來(lái)自MSRV 病毒粒子(Perron，Jouvin-Marche 等.2001)的質(zhì)粒 pV14，包括 對(duì)應(yīng)于數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)(NCBI-Entrez/Genbank) :AF331500. 1的蛋白序列。圖2代表完整ENV蛋白(ENV-T,SEQ ID No. 19)和表面切割片段(ENV1或ENV-SU， SEQ ID No. 24)的結(jié)構(gòu)。圖2中，信號(hào)肽起始于殘基#1 (甲硫氨酸)，終止于殘基#29 (蘇氨 酸)。產(chǎn)牛方法根據(jù)供應(yīng)商的說(shuō)明書(shū)，將Geneart (USA)提供的ENV-T編碼序列連接入 Novagen(EMD Chemicals, Inc.，Gibbstown, NJ, UNITED STATES)提供的表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)載 體pET-15b，通過(guò)典型CaCl2透化轉(zhuǎn)化細(xì)菌BL21大腸桿菌菌株，描述于“DNA Isolation and Sequencing，，(Essential Techniques Series)by Bruce A. Roe, Judy S. Crabtree 禾口 Akbar S. Khan 由 John Wiley&Sons 出版，ISBN 0-471-97324-0 QP625. N89R64 1996 John Wiley&Sons,以及描述于 Molecular Biology Techniques :An Intensive Laboratory Course (Paperback)中，Katharine G. Field(作者)，Walt Ream (作者)，轉(zhuǎn)化的細(xì)菌在添 加30 μ g/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中37°C生長(zhǎng)直至光密度然后通過(guò)ImM IPTG誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)，然后在37°C繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。提取方法.在4°C下5000g離心20分鐘后，將細(xì)菌沉淀重懸于20mL/L培養(yǎng)物裂解緩沖液 (Tris 20mM pH7. 5 ；NaCl 0. 15M ；胰蛋白酶醛肽(leup印tine) 1 μ g/mL，胃蛋白酶抑制劑 (P印statine) 1 μ g/mL, PMSF ImM, MgCl2 2mM，溶菌酶 50 μ g/mL)。溶液邊攪拌邊在 4°C溫 育30分鐘，然后在冰/乙醇中超聲處理G步，7分鐘在80% 0. 5)。添加脫氧核糖核酸酶 (DNase) ImM，溶液邊攪拌邊在4°C溫育1小時(shí)。懸液在4°C下以40000g離心30分鐘。將沉淀重懸于7. 5mL/L培養(yǎng)物溶解緩沖液(Tris 20mM pH7. 5，NaC1150mM，尿素 2M，SDS 1.5%, β巰基乙醇50mM)。將溶液在8°C邊攪拌邊溫育2小時(shí)。然后將懸液在10°C下40000g離心30分鐘。純化方法將尿素上清用緩沖液iTris 20mM pH7. 5, NaCl 150mM，尿素 150mM，SDS 1. 5%稀釋 5 倍。禾1J用銀柱(Ni Sepharose Fast Flow column, Amersham BioScience 公司)通過(guò)親禾口 層析純化 lmL/L培養(yǎng)物。在用緩沖液iTris 20mM pH7. 5，NaC1150mM，尿素 500mM，SDS 1.5%， β -巰基乙醇IOmM平衡后，將上清按2mL/mn上樣到樹(shù)脂上。通過(guò)30和50mM咪唑的步驟進(jìn) 行Env的洗脫。利用脫鹽柱(Amersham Bic^cience，25mL樹(shù)脂)進(jìn)行純化。在用緩沖液Tris 20mM pH7. 5,NaCl 150mM,SDS 1. 5%,DTT IOmM平衡后將來(lái)自親和層析的混合物按照2mL/min上 樣到樹(shù)脂上。利用相同緩沖液洗脫蛋白。
然后，將蛋白按照l(shuí)mL/min上樣于用緩沖液Tris 20mM pH7. 5, NaC1150mM, SDS 1.5%，DTT IOmM 平衡的 Superdex 200 凝膠過(guò)濾(Amersham Bioscience)。利用相同緩沖 液洗脫蛋白。內(nèi)毒素去除利用Acticlean 柱(Amersham Bic^cience，8mL樹(shù)脂)進(jìn)行純化。在用緩沖液 Tris 20mM pH7. 5,NaCl 150mM,SDS 1. 5%,DTT IOmM 平衡后，將混合物按照 lmL/min 上樣到樹(shù)脂 上。利用相同緩沖液洗脫蛋白。批次的質(zhì)量控制-質(zhì)譜MALDI-TOFF因?yàn)镾DS所以不能使用。-N 端測(cè)序AIi^XTFLFT-內(nèi)毒素測(cè)定<5UE/ml批次性質(zhì)表觀溶解度100%純度>90%濃度0.05mg/ml保存_80°C數(shù)量1.5mg緩沖液Tris20mM pH 7. 5，NaCl 150mM, SDS 1. 5%, DTT IOmM實(shí)施例3 對(duì)MSRV ENV抗原特異的配體結(jié)合活性的體外證據(jù)I-目標(biāo)我們通過(guò)免疫測(cè)定技術(shù)(ELISA)評(píng)價(jià)了配體對(duì)于重組抗配體(以來(lái)自克隆VH+VL 序列的^Fv重組蛋白的形式或以從原始鼠GNbACl切割的Fab片段的形式(包含缺失鼠抗 體功能和結(jié)構(gòu)的切割VH+VL鏈))的親和力。將這種配體與原始鼠GNbACl，以及將配體插入 人IgGl或IgG4恒定鏈及其用作藥理學(xué)載體的相應(yīng)序列的分子構(gòu)建體進(jìn)行比較。II-材料和方法a) VH 禾口 VL 克隆:GNbACl可變區(qū)輕鏈(VL)和重鏈(VH)的克隆和核苷酸測(cè)序根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)，利用mRNA純化試劑盒(Amersham Bioscience)從5X107 個(gè)生成GNb ACl抗體的雜交瘤細(xì)胞提取并純化Poly (A+)RNA。根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)，使用 RT-PCR 試劑盒(Amersham Bioscience)從 800ng mRNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。按照先前的描述(Ruberti等，1994，The use of the RACE method to clone hybridoma cDNA when V region primers fail. J. Immunol. Methods 173,33-39),利用 cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)法獲得輕鏈(VL)和重鏈(VH)的cDNA編碼可變區(qū)基因序列。 正向引物如下RACE aller, (SEQ ID No. 21)。反向引物如下CL Alal30 retour(SEQ ID No. 25)用于 VL 擴(kuò)增，和 CHl Proll9 retour(SEQ ID No. 26)用于 VH 擴(kuò)增，字母代碼 R = AIG, K = G/T, H = ATTIC0 反向引物 CL Alal30 retour 和 CHl Prol 19 retour，從 Kabat 等(1991,Sequences of proteins of immunological interest. National Institute of Health Bethesda，MD)的共有序列推導(dǎo)得出，對(duì)小鼠kappa/CL結(jié)構(gòu)域和IgG/CHl結(jié)構(gòu)域的 N端特異。
使用Taq DNA聚合酶獲得PCR產(chǎn)物，然后根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)，使用TA克隆試 劑盒(Invitrogen)將其直接連入pCR 2.1-TOPO 載體。使用循環(huán)測(cè)序試劑盒(Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit,Applied Biosystems)在 ABI310 自 動(dòng)測(cè)序儀上測(cè)序來(lái)確定克隆的DNA的序列。b)kFv構(gòu)建和表達(dá)根據(jù)“Mallano A 等，2008, Generation and characterization of a human single-chain fragment variable (scFv)antibody against cytosine deaminase from Yeast. M. BMC Biotechnol. Sep 10 ；8 :68” 中描述的技術(shù)獲得 &FV。c)來(lái)自 GNb ACl 抗體的 Fab根據(jù)"Lefranc G, Lefranc M P. Antibody eng ineering and perspectives in therapy. Biochimie. 1990Sep ；72 (9) ；639-51” 描述的技術(shù)獲得 Fab。II-I 材料II-Ia單克降抗體產(chǎn)生并純化下列濃度的配體，人IgG分子構(gòu)建體或GNbACl 表1 不同配體、ScFV, Fab和抗體的濃度
名稱濃度GNbACl5. 91/ml人IgGl中的配體Imgml人IgG4中的配體2mg/ml小鼠F^ablmg/ml重組ScFvlmg/mlII-Ib重組蛋白MSRV完整ENV蛋白(ENV-T)和表面結(jié)構(gòu)域片段(ENV-SU)重組蛋白，由蛋白專家 (Protein Expert)在大腸桿菌中產(chǎn)生，并按照實(shí)施例2的描述進(jìn)一步純化。
蛋白名稱濃度內(nèi)毒素ENV-T0.15mg/ml< 5UI/mlENV-SU0.20mg/ml< 5UI/ml表2:重組蛋白的濃度II-Ic 夾心 ELISA-微孔用每孔100μ 1的50mM碳酸氫鈉、pH 9. 6稀釋的抗-ENV捕獲抗體(3C1D5，bioMerieux提供)包被。4°C密封板一夜。-用每孔250 μ 1 的 PBST 0. 05% (含 0. 05% Tween20 的磷酸鹽緩沖鹽水Sigma P7949)將微孔清洗3次。最后一次清洗后，將板倒置，在吸水紙上滲出以去除任何殘余緩沖液。-添加200μ 1每孔的PBST 0. 05% +5%奶粉。將板密封，輕輕攪拌條件下在室溫 下溫育1小時(shí)。-用每孔250μ 1的PBST 0. 05%將微孔清洗3次。最后一次清洗后將板倒置，在 吸水紙上滲出以去除任何殘余緩沖液。-將微孔用每孔100μ 1的PBST 0. 05%稀釋的ENV抗原(ENV-T或ENV-SU)溫育。 將板密封，輕輕攪拌條件下室溫溫育2小時(shí)。-用每孔250μ 1的PBST 0. 05%將微孔清洗3次。最后一次清洗后，將板倒置，在 吸水紙上滲出以去除任何殘余緩沖液。-添加每孔100μ 1的用PBST 0. 05% +5%奶粉稀釋的檢測(cè)抗體(GNbACl或重組 片段kFv)。將板密封，輕輕攪拌條件下室溫溫育1小時(shí)。通過(guò)Squarix公司(Germany)， GNbACl用過(guò)氧化物酶標(biāo)記，ScFv用生物素標(biāo)記。-將微孔用每孔250μ 1的PBST 0. 05%清洗4次。最后一次清洗后，將板倒置，在 吸水紙上滲出以去除任何殘余緩沖液。-添加每孔100μ 1底物溶液(將1片ο-間苯二胺(OPD)稀釋于IOmlO. 05Μ磷酸 檸檬酸鹽緩沖液ρΗ5+10μ1 H20230% (最后時(shí)刻制備))。將板在室溫黑暗條件下溫育30 分鐘。-添加每孔50μ 1的終止溶液2Ν H2S04。-在反應(yīng)停止后30分鐘內(nèi)，在490nm讀取吸光度。II-Id在包被ENV抗原(如上所述的ENV-T或ENV-SU)的微板上的肓接ELISA-將微孔用每孔100μ 1的50mM碳酸氫鈉，pH 9. 6稀釋的ENV抗原包被。將板密 封，輕輕攪拌條件下37°C溫育2小時(shí)。-將微孔用每孔250μ1的PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)清洗4次。最后一次清洗后，將 板倒置，在吸水紙上滲出以去除任何殘余緩沖液。-添加每孔100μ 1的用PBS+BSA 1% (PBS，含牛血清白蛋白)稀釋的本發(fā)明 檢測(cè)抗體(GNbACl或其Fab片段)。將板密封，輕輕攪拌條件下室溫溫育1小時(shí)。-將微孔用每孔250μ 1的PBS清洗4次。最后一次清洗后，將板倒置，在吸水紙上 滲出以去除任何殘余緩沖液。-添加每孔100μ 1的用PBS+BSA 稀釋的檢測(cè)二抗(抗IgG Jackson-1/250 稀釋；或，IgG 抗人氧化物酶 perox Jackson 115_0；35-146 或，IgG 抗小鼠 perox Jackson 115-035-062，根據(jù)一抗)。將板密封，輕輕攪拌條件下室溫溫育1小時(shí)。-將微孔用每孔250μ 1的PBS清洗6次。最后一次清洗后，將板倒置，在吸水紙上 滲出以去除任何殘余緩沖液。-添加每孔100μ 1底物溶液(將1片O-間苯二胺(OPD)稀釋于IOmlO. 05Μ磷酸 檸檬酸鹽緩沖液ρΗ5+10μ1 H20230% (最后時(shí)刻制備))。將板在室溫黑暗條件下溫育30 分鐘。
-添加每孔50μ 1的終止溶液2Ν H2S04。-在反應(yīng)終止后30分鐘內(nèi)，在490nm讀取吸光度。III-結(jié)果III-I 夾心 ELISA 鼠 IgGl (GNbACl)和 ScFv
3C1D5 iot060405CS023C1D5 lot 060405CS02IgGIGNbACI過(guò)氧化物酶ScFv生物素標(biāo)記的標(biāo)記的Env SU OiSiigZmI2.6951,289Env SU 0,1 μ_Ι1.0360.656Env SU 0,02 pg/ml0,2940.455PBST 0,05%0.1010.411Env T 0,5 |jg/mi1.8071.085Env T 0,1 ug/ml0.8620.594■ili.il.ii) ΜΜ ' dK Md S 4 Env T 0,02 pg/ml0,2150,443PBST 0,05%0.1430.420表3 針對(duì)每種濃度的抗原或?qū)φ站彌_液的包被抗體對(duì)比過(guò)氧化物酶或生物素檢 測(cè)配體的濃度。結(jié)果對(duì)應(yīng)于測(cè)量的光密度。PBST 含有0.05% Tween 20的磷酸鹽緩沖鹽 水在圖3中顯示不同條件下用kFv和原始GNbAC 1平行進(jìn)行的ELISA結(jié)果。包被抗體和檢測(cè)配體的濃度均是5 μ g/ml ；鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶偶聯(lián)物稀釋 度是 1/2000。我們?cè)诳笶NV-SU和ENV-T重組蛋白的夾心ELISA中分析GNbACl和重組kFv作 為檢測(cè)配體。從圖3可以看出，在相同濃度，MAb和kFv能夠檢測(cè)ENV蛋白，其中kFv的 OD超過(guò)IgG的一半，IgG是二價(jià)和kFv是單價(jià)。因此，相對(duì)于每分子結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)目，分離 的配體產(chǎn)生比完整的鼠IgG更好的結(jié)果。因此，抗體功能不是必需的，利用所述分離配體的 改善結(jié)果是出乎意料的。II1-2 直接 ELISA :GNb ACl 和 Fab
Fab 100 μ g/mlGNb Acl 10μ g/mlEnv T 0. 5 μ g/ml2. 833. 00Env T 0.25 μ g/ml1. 852. 75Env 0. 125 μ g/ml1. 198Env T 0.0625 μ g/ml0. 77NA
權(quán)利要求
1.一種配體，其包括 SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3、SEQID No. 4、SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示序列顯示的各種互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，或-在所述序列內(nèi)具有下面所示數(shù)目的取代氨基酸的任意序列，CDR1(SEQ ID No. 1)中 0 到 3 個(gè)，CDR2 (SEQ ID No. 2)中 0 至Ij 2 個(gè)，CDR3 (SEQ ID No. 3)中 0 至Ij 2 個(gè)，CDR4 (SEQ ID No. 4)中 0 到 1 個(gè)，CDR5 (SEQ ID No. 5)中 0 到 4 個(gè)，CDR6 (SEQ ID No. 6)中 0 到 2 個(gè)，或-在SEQ ID No. 1到SEQ ID No. 6所示氨基酸序列內(nèi)用具有等同化學(xué)功能和特性的其 他氨基酸替代的氨基酸序列。
2.一種配體，包括-輕鏈可變區(qū)(VL)，其包括如SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2和SEQ IDNo. 3所示氨基酸序 列，或與所述氨基酸序列具有至少80%同一性和更優(yōu)選的90%同一性的任意序列，和-重鏈可變區(qū)(VH)，其包括如SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5和SEQ IDNo. 6所示氨基酸序 列，或與所述氨基酸序列具有至少80%同一性和更優(yōu)選的90%同一性的任意序列。
3.配體，包括-輕鏈可變區(qū)(VL)，具有如SEQ ID No. 7所示氨基酸序列，或與該序列具有至少75%同 一性，更優(yōu)選的80%和甚至更優(yōu)選的90%同一性的任意序列，和-重鏈可變區(qū)(VH)，具有如SEQ ID No. 8所示氨基酸序列，或與該序列具有至少75%同 一性，更優(yōu)選的80%和甚至更優(yōu)選的90%同一性的任意序列。
4.ScFV片段，包括如權(quán)利要求1到3所述的配體。
5.Fab片段，包括如權(quán)利要求1到3所述的配體。
6.一種抗體，包括如權(quán)利要求1到3所述的配體。
7.權(quán)利要求6的抗體，其特征在于，它是嵌合、改造或人源化的抗體。
8.權(quán)利要求6或7的抗體，其是IgG。
9.權(quán)利要求8的抗體，其是人IgGl或人IgG4。
10.一種藥物組合物，包括作為活性成分的如權(quán)利要求1到3所述的配體、如權(quán)利要求 4所述的scFV片段、如權(quán)利要求5所述的Fab片段或如權(quán)利要求6到9所述的抗體。
11.一種核酸分子，其包括如 SEQ ID No. 13、SEQ ID No. 14、SEQ IDNo. 15、SEQ ID No. 16、SEQ ID No. 17、SEQ ID No. 18所示的至少一種全長(zhǎng)核酸序列，或與所述序列具有至 少70 %和更優(yōu)選的80 %和甚至更優(yōu)選的90 %同一性的任意序列，或與其100 %互補(bǔ)的任意 序列。
12.權(quán)利要求11的核酸分子,其包括如SEQID No. 13、SEQ ID No. 14、SEQ ID No. 15、 SEQ ID No. 16,SEQ ID No. 17和SEQ ID No. 18所示的各種核酸序列，或與所述核酸序列具 有至少70 %和更優(yōu)選的80 %和甚至更優(yōu)選的90 %同一性的任意序列，或與其100 %互補(bǔ)的 任意序列。
13.一種核酸，包括如SEQ ID No. 10或12所示核酸序列中的至少一種全長(zhǎng)序列，或與 所述核酸序列具有至少70%和更優(yōu)選的80%和甚至更優(yōu)選的90%同一性的任意序列，或 與其100%互補(bǔ)的任意序列。
14.一種核酸，包括如SEQ ID No. 9或11所示核酸序列中的至少一種全長(zhǎng)序列，或與 所述序列具有至少70%和更優(yōu)選的80%和甚至更優(yōu)選的90%同一性的任意序列，或與其 100%互補(bǔ)的任意序列。
15.一種載體，包括如權(quán)利要求11到14中任意一項(xiàng)所述的核酸。
16.一種用權(quán)利要求15所述的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
17.一種用于制造如權(quán)利要求1到3所述的配體、如權(quán)利要求4所述的&FV片段、如權(quán) 利要求5所述的Fab片段或如權(quán)利要求6到9所述的抗體的方法，包括在能夠使配體、scFV 抗體、Fab片段或抗體合成的條件下培養(yǎng)如權(quán)利要求16所述宿主細(xì)胞的步驟。
18.一種治療方法，包括施用如權(quán)利要求1到3所述的配體、如權(quán)利要求4所述的scFV 片段、如權(quán)利要求5所述的Fab片段或如權(quán)利要求6到9所述的抗體，或者藥學(xué)上可接受形 式的如權(quán)利要求1到3所述的配體、如權(quán)利要求4所述的scFV片段、如權(quán)利要求5所述的 Fab片段或如權(quán)利要求6到9所述的抗體，或者如權(quán)利要求10所述的藥物組合物。
19.權(quán)利要求18的治療方法，用于治療選自以下組的MSRV相關(guān)疾病多發(fā)性硬化，精 神分裂癥，臨床孤立綜合征，慢性炎性脫髓鞘多神經(jīng)病，癲癇癥，銀屑病，癌癥，炎性胰腺炎 和糖尿病，具體而言所述糖尿病是1型糖尿病。
20.權(quán)利要求18或19中任意一項(xiàng)所述的MSRV相關(guān)疾病的治療方法，包括利用有規(guī)律 地重復(fù)注射給藥如權(quán)利要求9所述的IgG4或IgGl抗體作為慢性治療。
21.抗配體，其特征在于它由以下序列組成SEQID No. 20或SEQ IDNo. 32所示的氨基 酸序列，與SEQ ID No. 20或SEQ ID No. 32所示氨基酸序列具有至少75%序列同一性的序 列，或與SEQ ID No. 20或SEQ IDNo. 32所示氨基酸序列100%互補(bǔ)的任意序列。
22.—種檢測(cè)生物樣品中抗配體的方法，使用如權(quán)利要求1到3所述的配體、如權(quán)利要 求4所述的scFV片段、如權(quán)利要求5所述的Fab片段或如權(quán)利要求6到9所述的抗體，包 括以下步驟(a)將樣品與權(quán)利要求1到3所述的配體、如權(quán)利要求4所述的scFV片段、如權(quán)利要求 5所述的Fab片段或如權(quán)利要求6到9所述的抗體接觸，(b)檢測(cè)樣品中抗配體的存在。
23.權(quán)利要求22的檢測(cè)抗配體的方法，還包括以下步驟(c)將所述樣品與特異性結(jié)合GAG抗原的配體接觸。
24.一種檢測(cè)生物樣品中抗配體的免疫測(cè)定試劑盒，所述試劑盒包括如權(quán)利要求1到3 所述的配體、如權(quán)利要求4所述的scFV片段、如權(quán)利要求5所述的Fab片段或如權(quán)利要求6 到9所述的抗體，以及用于檢測(cè)抗配體與上述配體、scFv, Fab片段或抗原的特異性結(jié)合的 試齊LU
25.權(quán)利要求對(duì)的檢測(cè)生物樣品中抗配體的免疫測(cè)定試劑盒，所述試劑盒還包括特異 性結(jié)合GAG抗原的配體。
26.權(quán)利要求M或25的免疫測(cè)定試劑盒用于檢測(cè)MSRV相關(guān)疾病的用途，所述MSRV 相關(guān)疾病選自多發(fā)性硬化，精神分裂癥，臨床孤立綜合征，慢性炎性脫髓鞘多神經(jīng)病，癲癇 癥，銀屑病，癌癥，炎性胰腺炎和糖尿病，具體而言所述糖尿病是1型糖尿病。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種配體，其包括SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的每種互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，或在所述序列內(nèi)具有下面所示數(shù)目的取代氨基酸的序列，CDR1(SEQ ID No.1)中0到3個(gè)，CDR2(SEQ ID No.2)中0到2個(gè)，CDR3(SEQ ID No.3)中0到2個(gè)，CDR4(SEQ ID No.4)中0到1個(gè)，CDR5(SEQ ID No.5)中0到4個(gè)，CDR6(SEQ ID No.6)中0到2個(gè)，或在所述序列SEQ ID No.1到SEQ ID No.6內(nèi)用具有等同化學(xué)功能和特性的其他氨基酸替代的氨基酸的序列。
文檔編號(hào)A61K39/42GK102143975SQ200980134828
公開(kāi)日2011年8月3日 申請(qǐng)日期2009年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月8日
發(fā)明者埃爾維·貝鴻, 科里納·伯納德, 讓-巴蒂斯特·貝特朗, 阿羅伊斯·伯恩哈德特·朗 申請(qǐng)人:吉納羅公司