專利名稱：蓬莪術(shù)環(huán)二烯在制備抗腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蓬莪術(shù)環(huán)二烯在制備抗腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
侵襲、轉(zhuǎn)移行為是惡性腫瘤的本質(zhì)特征。癌轉(zhuǎn)移使局部病變擴散成全身多灶性疾 病。在臨床診斷出原發(fā)腫瘤時，約50%的患者已經(jīng)發(fā)生了遠離部位的癌轉(zhuǎn)移，現(xiàn)有的手術(shù)、 放療和化療手段在治療轉(zhuǎn)移癌時常遭失敗，導(dǎo)致患者病情惡化或死亡。侵襲、轉(zhuǎn)移是惡性腫 瘤致命性的癥結(jié)所在，防治腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移是降低腫瘤病死率的重要途徑之一。腫瘤侵襲是指惡性腫瘤細胞脫離原發(fā)部位，突破基底膜和細胞外基質(zhì)構(gòu)成的屏 障，侵襲毗鄰的正常組織，最終被侵襲的組織發(fā)生病變及壞死。轉(zhuǎn)移是指惡性腫瘤細胞借助 血管、淋巴管等途徑，在遠離的器官內(nèi)形成繼發(fā)瘤的過程。腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移是一個連續(xù)多 步驟的過程。首先是原發(fā)腫瘤快速增殖，原發(fā)病灶新生血管生成；腫瘤細胞侵潤基底膜、基 質(zhì)，穿入血管或淋巴管進入循環(huán)系統(tǒng)；腫瘤細胞栓塞并停留在遠處位點的微血管中；腫瘤 細胞穿出血管或淋巴管，最終在靶器官中形成轉(zhuǎn)移灶。蓬莪術(shù)環(huán)二烯(furanodiene，C15H20O)是存在于姜科植物蓬莪術(shù) (Curcumazedoaria(Berg)Rose)中的一種天然成分。Yu Xiao等人報道蓬莪術(shù)環(huán)二烯能夠 誘導(dǎo)人肝癌ifepG2細胞阻滯在G2ZM期，并通過MAPK信號通路及粒體-Caspase通路發(fā)生 凋亡(CancerBiology & Therapy 6 =7,1044-1050 ；2007)；此外，亦有文獻報道蓬莪術(shù)環(huán)二 烯誘導(dǎo)人白血病HL-60細胞凋亡是通過激活TNFRl信號通路完成(Cancer Letters 271 158-166 ；2008)；目前尚未見有關(guān)于蓬莪術(shù)環(huán)二烯在抗腫瘤轉(zhuǎn)移方面的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了蓬莪術(shù)環(huán)二烯在制備抗腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明進一步提供了蓬莪術(shù)環(huán)二烯在制備抗肝癌、胃癌、膀胱癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、 腎癌、食道癌、膽囊癌、卵巢癌、胰腺癌、子宮頸癌、甲狀腺癌、前列腺癌、口腔癌及肺癌轉(zhuǎn)移 的藥物中的應(yīng)用。有益效果1.蓬莪術(shù)環(huán)二烯對肝、胃、膀胱、乳房、結(jié)腸、腎、食道、膽囊、卵巢、胰腺、子宮頸、甲 狀腺、前列腺、口腔及肺癌細胞體外侵襲具有明顯的抑制作用。2.蓬莪術(shù)環(huán)二烯可抑制肝癌、胃癌及肺癌細胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達。3.蓬莪術(shù)環(huán)二烯可抑制人肝癌瘤株裸小鼠原位移植模型的腫瘤轉(zhuǎn)移。
具體實施例方式以下通過實施例對本發(fā)明作進一步的闡述，但不對本發(fā)明作任何限制。蓬莪術(shù)環(huán)二烯為莪術(shù)中提取分離經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定并且純度達到99. 7%的純品。制備例1蓬莪術(shù)環(huán)二烯的制備
3
取蓬莪術(shù)干燥的根莖1kg，通過水蒸汽蒸餾裝置進行蒸餾，共得到385g油水混合 物，用乙醚及石油醚進行萃取，分離油層，棄取水層，并濃縮，得到莪術(shù)揮發(fā)油46. 5g，用硅 膠柱進行分離，石油醚洗脫，每瓶IOOml收集，合并沈 42組分，抽去溶劑，得到黃色晶 體15. 6g，再上硅膠柱分離，石油醚洗脫，每瓶30ml，合并16 觀組分，抽去溶劑，得到白 色結(jié)晶10. 7g，HPLC分析該樣品的純度達到99.7%，高分辨質(zhì)譜分析正離子檢測表明樣 品的準分子離子峰[M+H]+為217. 1583，推斷其分子量為216. 1505，檢元素匹配，其元素 組成為C15H2tlO,誤差小于5ppm，即表明該樣品的分子式為C15H2(i0。核磁共振檢測顯示，在 δ 7. 228ppm, δ 4. 996ppm, δ 4. 691ppm, δ 3. 378ppm, δ 3. 107ppm, δ 2. 211ppm, δ 2. 104ppm, δ 1. 874ppm, δ 1. 760ppm, δ 1. 559ppm, δ 1. 200ppm處有吸收組峰，通過詳細歸屬解析，證明 該分離物為蓬莪術(shù)環(huán)二烯。制備例2蓬莪術(shù)環(huán)二烯軟膠囊的制備2. 4g蓬莪術(shù)環(huán)二烯0.2%ig大豆磷脂0. 24mg對羥基苯甲酸甲酯加入注射用大豆油溶解上述組分并定容至2細1制備取注射用大豆油1000ml，在150°C干熱滅菌1小時，放冷至25°C，取出部分 油液加入上述主藥和輔料，攪拌使其完全溶解，最后定容至2細1，用干燥的6號垂溶漏斗過 濾，灌封于軟膠囊中，紫外滅菌60分鐘，制成每粒中含蓬莪術(shù)環(huán)二烯200mg的軟膠囊。實驗例1蓬莪術(shù)環(huán)二烯對腫瘤細胞體外侵襲的抑制作用實驗材料Bel-7402肝癌細胞株、BGC-823胃癌細胞株、A549肺癌細胞株、5637膀 胱癌細胞株、MCF-7乳腺癌細胞株、Caco-2結(jié)腸癌細胞株、0S-RC-2腎癌細胞株、Eca-109食 道癌細胞株、GBC-SD膽囊癌細胞株、H08910卵巢癌細胞株、PANC-I胰腺癌細胞株、Hela宮 頸癌細胞株、SW579甲狀腺癌細胞株、PC-3前列腺癌細胞株、KB 口腔癌細胞株中科院上海 細胞庫提供，本公司臨床藥理研究室常規(guī)培養(yǎng)傳代；Cell Invasion Assay KIT(ECM550)， Chemicon公司；DMEM、RPMI-1640培養(yǎng)基，Gbico公司；胎牛血清(FBS)，杭州四季青生物工 程材料公司；DMSO，Sigma公司。實驗方法蓬莪術(shù)環(huán)二烯(按照制備例1所得)以DMSO配制成200mg/L的儲存 液，-20°C儲存?zhèn)溆?。臨用前以培養(yǎng)液稀釋至所需終濃度。收集對數(shù)生長期的腫瘤細胞，分 別用含有空白溶劑和蓬莪術(shù)環(huán)二烯(終濃度為0. 2,0. 4,0. 8mg/L，預(yù)試驗表明該系列濃度 對腫瘤細胞增殖無影響)的RPMI-1640培養(yǎng)液將細胞懸浮，制成1 X 106/ml的單細胞懸液， 按照Cell InvasionAssay Kit說明書操作。細胞在小室內(nèi)部培養(yǎng)4 后，染色，醋酸溶解 小室下方已穿透的細胞，溶解液轉(zhuǎn)移入96孔板中，酶標儀檢測560nm處吸光度(A56tl)值，以 A560值代表侵襲的細胞數(shù)，每組設(shè)3個平行孔；統(tǒng)計方法t-test。實驗結(jié)果蓬莪術(shù)環(huán)二烯分別處理不同來源癌細胞4 后，0. ang/L組的細胞侵襲 能力低于對照組細胞，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P > 0. 05) ；0. 4mg/L和0. 8mg/L組的細胞侵襲 能力明顯低于對照組(P < 0. 05或P < 0. 01)，見表1。表1蓬莪術(shù)環(huán)二烯對不同來源腫瘤細胞侵襲能力的影響(0D值)G士s)
4瘤株對照組0-2mg/L_0.4mg/L_0.8mg/L
Bel-74020. 880±0.0590.711±0.0430.566±0.057s0.193±0.055"BGC-8230. 725±0.0600.658±0.0560.601 ±0.072a0.312±0.105"A5490. 780±0.0690.611±0.0530.521 ±0.087s0.201±0.075h56370.753 ±0.0810.7M±0.0750.573±0.107a0.185 + 0.092"MCF-70.699±0.0720.601 ±0.0750.569 ±0.Illa0.327±0.115hCaco-20.825±0.0710.701 ±0.1120.571 ±0.098b0.435±0.123hOS-RC-20.833±0.0760.755±0.1090.603±0.12580.368 ±0.136hEca-1090.915±0.0580.866 + 0.0690.551±0·097b0.237±0.112bGBC-SD0.756±0.0590.688 ±0.0970.616±0.077"0.469 土 0.126bH089100.901+0.0720.845 + 0.0970.718 士 0.065b0.221 ±0.109bPANC-I0.932±0.0770.801±0.1050.725 土 0.126a0.537±0.127"Hela0.964 ±0.0920.886±0.1280.777 士 0.083b0.砧1 土 0.IOlbSW5790.776 ±0.0580.711±0.0910.561±0.056b0.381±0.IlObPC-30.758 士 0.0730.693 ±0.0590.609±0.099a0.322±0.089bKB0.822±0.0650.801±0.1080.634±0.085a0.499 ±0.079b與對照組相比，aP < 0. 05，b P < 0. 01實驗結(jié)論蓬莪術(shù)環(huán)二烯可抑制不同來源腫瘤細胞的體外侵襲能力。實驗例2蓬莪術(shù)環(huán)二烯對腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白VEGF表達的影響實驗材料Bel_7402肝癌細胞株、BGC-823胃癌細胞株、A549肺癌細胞株中 科院上海細胞庫提供，本公司臨床藥理研究室常規(guī)培養(yǎng)傳代；VEGF Enzyine Linked Immunosorbent Assay，南京建成生物工程研究所；RPMI-1640培養(yǎng)基，Gbico公司；胎牛血 清(FBS)，杭州四季青生物工程材料公司；DMSO，Sigma公司。實驗方法蓬莪術(shù)環(huán)二烯(按照制備例1所得)以DMSO配制成200mg/L的儲存 液，-20°C儲存?zhèn)溆?。臨用前以培養(yǎng)液稀釋至所需終濃度。取處于對數(shù)生長期的腫瘤細胞， 以每瓶5 X IO6個接種于細胞培養(yǎng)瓶中，37°C、5 % CO2培養(yǎng)24h后，更換以培養(yǎng)液稀釋的空白 對照溶液和蓬莪術(shù)環(huán)二烯樣品溶液，終濃度分別為0. 2,0. 4,0. 8mg/L,繼續(xù)培養(yǎng)4 后，吸 取細胞培養(yǎng)上清，離心去細胞碎片和雜質(zhì)后，上清液中VEGF蛋白濃度測定按照檢測試劑盒 說明書方法進行，于酶標儀450nm處測A值，根據(jù)標準品的A值求出標準曲線方程，并計算 出細胞上清中VEGF濃度；統(tǒng)計方法t-test。實驗結(jié)果蓬莪術(shù)環(huán)二烯對不同來源腫瘤細胞分泌VEGF的影響ELISA結(jié)果顯示， 蓬莪術(shù)環(huán)二烯作用于以上三種腫瘤細胞4 后，能夠明顯降低細胞培養(yǎng)液上清中VEGF的 量，0. 4mg/L、0. 8mg/L組與對照組相比，存在顯著性差異(P < 0. 05或P < 0. 01)，見表2。表2蓬莪術(shù)環(huán)二烯對不同來源腫瘤細胞VEGF表達的影響(I士s) (pg/ml)
權(quán)利要求
1.蓬莪術(shù)環(huán)二烯在制備抗腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中所述的腫瘤選自肝癌、胃癌、膀胱癌、乳腺癌、結(jié)腸 癌、腎癌、食道癌、膽囊癌、卵巢癌、胰腺癌、子宮頸癌、甲狀腺癌、前列腺癌、口腔癌及肺癌。
全文摘要
本發(fā)明屬于制藥領(lǐng)域，提供了蓬莪術(shù)環(huán)二烯在制備抗腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物中的應(yīng)用，特別是在制備抗肝癌、胃癌、膀胱癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、腎癌、食道癌、膽囊癌、卵巢癌、胰腺癌、子宮頸癌、甲狀腺癌、前列腺癌、口腔癌及肺癌等腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物中的應(yīng)用。蓬莪術(shù)環(huán)二烯通過抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達發(fā)揮抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用。
文檔編號A61P35/04GK102100688SQ200910155080
公開日2011年6月22日 申請日期2009年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月17日
發(fā)明者馮飛玉, 吳耀東, 孟昭珂, 楊嵐, 郭殿武, 黃濱南 申請人:杭州民生藥業(yè)有限公司