專利名稱：一種抗肝纖維化有效劑型的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鱉甲抗肝纖維化有效劑型的制備方法，具體涉及鱉甲微粉與鱉甲水煎
液抗肝纖維化有效劑型的制備方法。
背景技術(shù)：
肝纖維化是各種原因引起的一系列損傷_修復(fù)、導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成與降解失衡、合成沉積遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過降解吸收、以及構(gòu)成成分比例明顯改變的結(jié)果，大量ECM沉積于肝小葉內(nèi)并逐漸形成纖維間隔，嚴(yán)重破壞了肝組織的正常結(jié)構(gòu)和功能，可致肝竇毛細(xì)血管化，血流障礙，門脈高壓。肝纖維化是各種慢性肝病的共同病理學(xué)基礎(chǔ)，也是誘發(fā)肝硬化肝癌的必經(jīng)途徑。肝纖維化治療主要包括去除病因與抗纖維化治療。公認(rèn)徹底驅(qū)除原發(fā)病因后，肝纖維化仍可繼續(xù)進(jìn)展，機(jī)理為活化的肝星狀細(xì)胞(HSC)通過自分泌或旁分泌再次激活HSC，是故有效的抗纖維化治療成為控制慢性肝病進(jìn)展和預(yù)防肝硬化肝癌、改善預(yù)后不可或缺的重要環(huán)節(jié)?；蛑委熝芯咳〉幂^大進(jìn)展，目前存在的主要問題是基因?qū)氲陌邢蛐?、表達(dá)效率、可調(diào)控性及安全性尚未完全解決，真正應(yīng)用于臨床還待時日；目前部分用治肝纖維化的化學(xué)藥和生物藥存在一些毒副反應(yīng)；許多以鱉甲為君藥組方的復(fù)方制劑如復(fù)方鱉甲軟肝片、鱉甲抗纖方、鱉甲煎丸等，抗肝纖維化療效較好，但價格較昂貴(主要原因是其中天然鱉甲資源有限)，難以滿足廣大患者尤其是農(nóng)村和貧困地區(qū)的需求，據(jù)統(tǒng)計(jì)我國約1.3億人患有肝病，占總?cè)丝诘?0%，針對國情，亟待開發(fā)價廉、有效且毒副作用小的抗肝纖維化藥物。 鑒于鱉甲"軟堅(jiān)散結(jié)"、抗肝纖維化藥用的傳統(tǒng)劑型至今仍缺乏科學(xué)依據(jù)，臨床應(yīng)用頗多爭議，其單方效用及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)更有待闡明，查新檢索結(jié)果表明該諸方面的研究尚未見報道。本發(fā)明旨在通過系統(tǒng)的體內(nèi)、外藥理藥效學(xué)比較研究，明確鱉甲抗肝纖維化的有效劑型、并驗(yàn)證其藥效學(xué)及物質(zhì)基礎(chǔ)、作用機(jī)制，為藥食同源的傳統(tǒng)中藥鱉甲用于抗肝纖維化臨床醫(yī)療、中藥新藥及保健品研發(fā)、鱉甲活性物質(zhì)開發(fā)為肽類藥物奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)和提供科學(xué)依據(jù)。 鱉甲為常用傳統(tǒng)中藥，源于鱉科動物鱉(Trionyx sinensis Wiegmann)的背甲，具有滋陰潛陽、軟堅(jiān)散結(jié)、退熱除蒸等功效；主治陰虛發(fā)熱、勞熱骨蒸、虛風(fēng)內(nèi)動、癥瘕、久瘧瘧母等病癥。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，而提供一種抗肝纖維化有效劑型的制備方法。 它通過對中藥"軟堅(jiān)散結(jié)"、抗肝纖維化代表性藥物、復(fù)方中的常用"君藥"鱉甲之歷來存在爭議的劑型微粉與水煎液進(jìn)行系統(tǒng)的體內(nèi)、外藥理藥效學(xué)對比研究，為鱉甲用于臨床治療肝纖維化疾患用藥的傳統(tǒng)劑型提供科學(xué)依據(jù)，闡明其有效劑型、并驗(yàn)證其藥效學(xué)與物質(zhì)基礎(chǔ)、作用機(jī)制，從而為藥食同源的傳統(tǒng)中藥鱉甲用于抗肝纖維化臨床醫(yī)療、中藥新
3藥及保健品研發(fā)、鱉甲活性物質(zhì)開發(fā)為肽類藥物奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)和提供科學(xué)依據(jù)。 本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案來完成的；一種抗肝纖維化有效劑型的制備方
法，它包括下列步驟 (1)鱉甲研粉，過八十目篩，氣流粉碎機(jī)處理，收集超微粉； (2)將上述超微粉與藥學(xué)上常規(guī)的賦形劑一起制成各種常規(guī)劑型。
或包括下列步驟 (1)鱉甲研粉，過八十目篩，氣流粉碎機(jī)處理，收集超微粉；
(2)取鱉甲超微粉進(jìn)行煎煮，煎煮1. 5-5個小時，收集混懸液；
(3)將上述混懸液與藥學(xué)上常規(guī)的賦形劑一起制成各種常規(guī)劑型。
或包括下列步驟 (1)稱取常規(guī)研磨的鱉甲粉81-—100份，加蒸餾水0. 1-5份，超聲提取5-30分 鐘，抽濾，濾渣再加蒸餾水O. l-5份，超聲提取5—15分鐘，抽濾；合并兩次產(chǎn)生的濾液，冷凍 干燥后得凍干粉； (2)用加蒸餾水O. l-5份溶解上述制得的凍干粉，將水溶液裝于半透膜(3. 500 A )內(nèi)，置0. 2-5份蒸餾水中透析I一IO小時，溫度為2-10°C;同法再透析一次，合并兩次膜外 透析液，真空冷凍干燥，收集A型凍干粉0. 2-10份； (3)取上述膜內(nèi)液體，將膜袋置0.2-10份蒸餾水中透析l一6小時，溫度為2-l(TC; 同法透析三次，棄去膜外透析液，將膜內(nèi)液體真空冷凍干燥，收集B型凍干粉l-20份；
(4)將上述A型凍干粉或B型凍干粉與藥學(xué)上常規(guī)的賦形劑一起制成各種常規(guī)劑 型。 A型凍干粉為分子量小于6000的物質(zhì)(鱉甲粗多肽成品)，B型凍干粉為分子量 大于6000的物質(zhì)。 本發(fā)明項(xiàng)目通過多學(xué)科交叉的研究方法，采用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)，對鱉甲進(jìn)行了較系 統(tǒng)的抗肝纖維化有效劑型、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)制研究，結(jié)果表明，鱉甲抗肝纖維化的 藥效物質(zhì)基礎(chǔ)為小分子肽類物質(zhì)、氨基酸；鱉甲水煎液抗肝纖維化的作用明顯優(yōu)于鱉甲微 粉，認(rèn)為鱉甲經(jīng)煎煮后，對肝星狀細(xì)胞活化增殖膠原合成起負(fù)抑制效應(yīng)的大分子蛋白變性， 變性蛋白質(zhì)易受胃腸道內(nèi)多種水解酶類的協(xié)同催化作用而被消化，轉(zhuǎn)變?yōu)楹唵蔚男》肿与?類物質(zhì)，符合發(fā)揮抗肝纖維化作用的肽段分子量標(biāo)準(zhǔn)及氨基酸序列，與鱉甲中原本存在的 少量小分子肽類物質(zhì)一起，共同發(fā)揮抑制肝星狀細(xì)胞活化增殖膠原合成、抗肝纖維化的作 用。從而為鱉甲用于臨床治療肝纖維化疾患用藥的傳統(tǒng)劑型提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為鱉甲用于 抗肝纖維化臨床醫(yī)療、中藥新藥及保健品研發(fā)、鱉甲活性物質(zhì)開發(fā)為肽類藥物奠定堅(jiān)實(shí)基 礎(chǔ)和提供科學(xué)依據(jù)。
具體實(shí)施例方式
以下通過實(shí)例來進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明。 本發(fā)明所述的一種抗肝纖維化有效劑型的制備方法，它可以按照以下三種方法制 備； 第一種方法制備鱉甲微粉，包括下列步驟 (1)鱉甲研粉，過八十目篩，氣流粉碎機(jī)處理，收集超微粉；
(2)將上述超微粉與藥學(xué)上可接受的、常規(guī)的賦形劑一起制成各種常規(guī)劑型。 第二種方法制備鱉甲水煎液，包括下列步驟 (1)鱉甲研粉，過八十目篩，氣流粉碎機(jī)處理，收集超微粉； (2)取鱉甲超微粉進(jìn)行煎煮，煎煮1. 5-5個小時，收集混懸液； (3)將上述混懸液與藥學(xué)上可接受的、常規(guī)的賦形劑一起制成各種常規(guī)劑型。 第三種方法附設(shè)制備鱉甲粗提物質(zhì)(用以藥理藥效學(xué)對比分析研究、藥效物質(zhì)基
礎(chǔ)研究)，包括下列步驟 (1)稱取常規(guī)研磨的鱉甲粉81-—100份，加蒸餾水0. 1-5份，超聲提取5-30分 鐘，抽濾，濾渣再加蒸餾水O. l-5份，超聲提取5—15分鐘，抽濾；合并兩次產(chǎn)生的濾液，冷凍 干燥后得凍干粉； (2)用加蒸餾水0. 1-5份溶解上述制得的凍干粉，將水溶液裝于半透膜(3. 500 A )內(nèi)，置0. 2-5份蒸餾水中透析I一IO小時，溫度為2-10°C;同法再透析一次，合并兩次膜外 透析液，真空冷凍干燥，收集A型凍干粉0. 2-10份； (3)取上述膜內(nèi)液體，將膜袋置0.2-10份蒸餾水中透析l一6小時，溫度為2-l(TC; 同法透析三次，棄去膜外透析液，將膜內(nèi)液體真空冷凍干燥，收集B型凍干粉l-20份；
(4)將上述A型凍干粉或B型凍干粉與藥學(xué)上可接受的、常規(guī)的賦形劑一起制成各 種常規(guī)劑型。 A型凍干粉為分子量小于6000的物質(zhì)(鱉甲粗多肽成品)，B型凍干粉為分子量 大于6000的物質(zhì)。 本發(fā)明對鱉甲抗肝纖維化的傳統(tǒng)劑型進(jìn)行了系統(tǒng)的體內(nèi)、外藥理藥效學(xué)對比研 究，結(jié)果表明，鱉甲水煎液抗肝纖維化作用顯著，而鱉甲微粉無此作用，聯(lián)系課題組同期研 究得出的鱉甲抗肝纖維化的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)為小分子肽類物質(zhì)的結(jié)論，從而明確了鱉甲抗肝 纖維化的有效劑型與藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、作用機(jī)制。詳見下述試驗(yàn)。
實(shí)施試驗(yàn)例1 :本發(fā)明的"體外實(shí)驗(yàn)鱉甲微粉與鱉甲水煎液藥物血清(附設(shè)鱉甲 粗提物質(zhì)組分)對離體HSC-T6細(xì)胞增殖的影響"
1.材料與方法 動物健康雄性SD大鼠12只，體重200g士20g，購自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí) 驗(yàn)動物中心。飼養(yǎng)溫度23°〇左右，相對濕度60.0% ±10.0%。 細(xì)胞系肝星狀細(xì)胞系HSC-T6購自上海中醫(yī)藥大學(xué)肝病研究所，為SV40轉(zhuǎn) 染的Sprague-Dauley大鼠星狀細(xì)胞，其表現(xiàn)型為活化的HSC，表達(dá)高水平的I型膠原、 TMP-lmRNA等。 主要試劑細(xì)胞培養(yǎng)試劑羥乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、胰蛋白酶(trypsin)、 L-谷氨酰胺等(美國Sigma公司)，DMEM培養(yǎng)基(高糖、低糖)(美國GIBCO公司)，小牛血 清(fetal calf serum， FCS)(武漢亞法生物技術(shù)公司)，青霉素、鏈霉素(華北制藥股份公 司)，碳酸氫鈉(湖北化工廠)，二氧化碳(C02)(武漢無機(jī)鹽廠)。細(xì)胞增殖檢測用試劑二 甲基亞砜(DMSO)、噻唑藍(lán)(MTT) (Sigma公司)。 主要儀器設(shè)備電熱恒溫水浴鍋(H. H. Sl 1-2型，上海醫(yī)療器械五廠)，水浴恒溫振 蕩器(SHZ-B，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)，倒置顯微鏡(IMT-2B型，日本Olymplus公司)，高速臺 式離心機(jī)(L110，上海)，C02培養(yǎng)箱(18201R，美國Shel-Lab公司)，塑料培養(yǎng)板(24孔，96
5孔，丹麥Nunc公司)，塑料培養(yǎng)皿(lOOmm，丹麥Nunc公司)，超凈工作臺(GH02-2型，天津市 醫(yī)藥凈化設(shè)備廠)，高壓消毒鍋(Autoclave SM52，美國Yamatoscientif ic公司)，分析天平 (TG328A型，湘儀天平儀器廠)，-80。C低溫冰箱(ULT FREEZER725型，F(xiàn)orma Solentif ic)， 紫外分光光度計(jì)(753BI型，上海光學(xué)儀器廠)，多功能酶標(biāo)儀(352型，芬蘭Labsystem公 司)。 試劑配制DMEM液1L的DMEM高糖及低糖培養(yǎng)基干粉各 一 包，并稱取 2. 38gHEPES、2. 0g NaHC03溶于2L三蒸水中，調(diào)pH為7. 2，0. 22 y m濾膜抽濾除菌，分裝置 4。C備用，用前加入10% FCS，1% L-谷氨酰胺，100y/ml青霉素，即為完全培養(yǎng)基。MTT的 配制稱取MTT10mg， 37。C溫浴中溶解于2ml 0. Olmol/L PBS， PH7. 4，即為5mg/ml的MTT溶 液，0. 22 m過濾除菌，置棕色小瓶中，4t:冰箱保存。 鱉甲粗提樣品的制備(l)稱取鱉甲粉100g，加蒸餾水200ml，超聲提取二十分鐘， 抽濾，濾渣再加蒸餾水100ml，超聲提取十分鐘，抽濾；合并兩次濾液，冷凍干燥，得凍干粉；
(2)用加蒸餾水200ml溶解上述制得的凍干粉，將水溶液裝于半透膜(3. 500 A ) 內(nèi)(截留分子量6000)，置100ml蒸餾水中透析五小時(4t:，5min搖一次)；同法再透析一 次，合并兩次膜外透析液，真空冷凍干燥，收集A型0. 4g凍干粉。 (3)取膜內(nèi)液體，將膜袋置500ml蒸餾水中透析三小時(4。C，磁力攪拌)；同法透 析三次，棄去膜外透析液，將膜內(nèi)液體真空冷凍干燥，收集B型3. 2g凍干粉。
A型凍干粉為分子量小于6000的物質(zhì)(鱉甲粗多肽成品)，B型凍干粉為分子量 大于6000的物質(zhì)。 鱉甲微粉與鱉甲水煎液藥物血清的制備實(shí)驗(yàn)用大鼠隨機(jī)分成三組，每組4只。鱉 甲研粉，過80目篩，JGM-T50型氣流粉碎機(jī)處理，收集超微粉。取鱉甲超微粉及其煎煮混懸 液(煎煮1. 5h)分別按成人10倍劑量(即生藥含量27. 0g kg—1 d—0配成藥液(1. 35g/ ml)，以及生理鹽水，分別給大鼠灌胃，2ml，2/dX3。第3天給藥后lh，無菌無熱源污染條件 下心臟采血，分離血清，56。C滅活30min，分裝凍存。 HSC_T6的培養(yǎng)及傳代HSC_T6培養(yǎng)于37°C、5% C02的含10%胎牛血清、100 ii /ml 青霉素、100mg/ml鏈霉素、l^L-谷氨酰胺的DMEM(低糖與高糖比例為l : l)培養(yǎng)液中，在 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞長到亞單層或細(xì)胞密度約80% 90%時，是HSC-T6傳代的標(biāo)志，吸 棄培養(yǎng)基，加入0. 25%胰蛋白酶4 5ml，以浸沒細(xì)胞為宜，37°C消化5 7min，待細(xì)胞回 縮，瓶壁有少量細(xì)胞脫落，即用含10X小牛血清培養(yǎng)基終止，收集細(xì)胞懸液于50ml消毒離 心管中，1700rpm，4t:離心7min，棄上清，加入含10%小牛血清的DMEM用吸管反復(fù)吹打、分 散細(xì)胞，取10 yl細(xì)胞懸液光鏡下計(jì)數(shù)，完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度，以1X107ml傳代。
實(shí)驗(yàn)分組及藥物處理待細(xì)胞長滿培養(yǎng)板底后，換用5% FCS的DMEM培養(yǎng)基， 培養(yǎng)24h后分別加入不同濃度的鱉甲粗提物質(zhì)(以含5% FCS的匿EM培養(yǎng)基倍比稀釋 成14. 0000mg/ml、7. 0000mg/ml、3. 5000mg/ml、l. 7500mg/ml、0. 8750mg/ml、0. 4375mg/ml、 0. 2188mg/ml、0. 1094mg/ml，0. 45 y m濾膜過濾)以及不同濃度鱉甲微粉與鱉甲水煎液藥物 血清(分設(shè)2. 5%、5%、10%、15%、20%五個濃度)，4孔重復(fù)，設(shè)空白對照組(含5% FCS 的DMEM培養(yǎng)基)以及相應(yīng)濃度生理鹽水對照血清組。 MTT比色法測定HSC-T6增殖傳代HSC_T6細(xì)胞按1 X 105的密度接種于96孔培養(yǎng) 板，每孔加100iil，細(xì)胞貼壁長滿孔底12h后，換含5% FCS的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)12h，加入鱉甲粗提物質(zhì)(以含5XFCS的DMEM培養(yǎng)液倍比稀釋，0. 45ym濾膜過濾)和鱉甲微粉與鱉 甲水煎液藥物血清共同培養(yǎng)48h、72h，每一濃度設(shè)4復(fù)孔，另設(shè)空白對照組及生理鹽水血清 組，去培養(yǎng)基(翻板)，每孔加20 ii 1MTT溶液，2PBS，濃度為5mg/ml，過濾除菌，置棕色 小瓶中，4t:冰箱保存。孵育4h，每孔加入二甲基亞砜(匿SD)100iU，在微型混合器上振蕩 2min， 10min后于酶標(biāo)儀上測定0D490值。存活率=(藥物組OD值/對照組OD值)X 100% 。 抑制率=(1-藥物組OD值/對照組OD值)X 100 % 。 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)以X±S表示，進(jìn)行方差分析和組間q檢驗(yàn)，P < 0. 05為差異具
有顯著性意義。 2.試驗(yàn)結(jié)果 傳代培養(yǎng)的大鼠肝星狀細(xì)胞系HSC-T6與鱉甲粗提物質(zhì)(分子量大于和小于6000 的物質(zhì))以及鱉甲微粉與鱉甲水煎液藥物血清分別共同培養(yǎng)48h、72h后，采用MTT比色法 測定各濃度組HSC增殖情況，見表1、2。結(jié)果顯示鱉甲分子量小于6000物質(zhì)組MTT0D值低 于空白對照組(培養(yǎng)72h結(jié)果)和分子量大于6000物質(zhì)組(培養(yǎng)48h、72h結(jié)果)，中位值 差異均非常顯著，P < 0. 01-0. 001。與空白對照組相比，中位抑制率(培養(yǎng)48h、72h結(jié)果)， 分子量大于6000物質(zhì)組分別為-119. 76%、 -58. 91% ;培養(yǎng)72h結(jié)果，分子量小于6000物 質(zhì)組在各實(shí)驗(yàn)濃度均產(chǎn)生抑制效應(yīng)(抑制率5. 89% 68. 74% )，中位抑制率51. 67%。
鱉甲水煎液藥物血清組MTTOD值低于相應(yīng)濃度生理鹽水對照血清組和鱉甲微粉 藥物血清組，中位值差異均非常顯著，P < 0. 001。與相應(yīng)濃度生理鹽水對照血清組相比，中 位抑制率(培養(yǎng)48h、72h結(jié)果)，鱉甲微粉藥物血清組分別為1. 36%、 -23. 21%，鱉甲水煎 液藥物血清組分別為51. 43% 、48. 76%。 實(shí)施試驗(yàn)例2 :本發(fā)明的"體外實(shí)驗(yàn)鱉甲提取物分子量小于6000的肽類物質(zhì)對 TGF-P工剌激的LX-1細(xì)胞活化及膠原合成的影響 y-干憂素(IFN-y)是目前已知的作用最強(qiáng)的抗肝纖維化細(xì)胞因子。以往的體外 及動物實(shí)驗(yàn)均證實(shí)IFN-y可有效地改善日本血吸蟲、四氯化碳、二甲基亞硝胺等引起的肝 纖維化。本實(shí)驗(yàn)通過Western blot法檢測鱉甲粗多肽成品(分子量< 6000) 、IFN_ y等各作 用組、對照組對TGF-P :剌激的LX-1細(xì)胞I、III型膠原和a -平滑肌肌動球蛋白(a -SMA) 表達(dá)的影響，探討鱉甲中多肽類成分抗肝纖維化的活性和作用機(jī)制。
1.材料與方法 細(xì)胞系人肝星狀細(xì)胞系LX-1由美國Mount Sinai醫(yī)學(xué)院肝病科Friedman SL教
授惠贈。 主要試劑IFN-y、 TGF-h(美國R&D公司)，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(美國 Hyclone公司)，P-肌動蛋白(P-actin)多克隆抗體、羊抗III型膠原多克隆抗體(美國 Santa Cruz公司)，小鼠抗a -SMA和I型膠原單克隆抗體(美國Sigma Aldrich公司)， IgG-HRP羊抗兔、兔抗羊和抗小鼠第二抗體(美國Santa Cruz公司)，SDS-PAGE蛋白電泳 及轉(zhuǎn)膜試劑，Western-blot試劑，PVDF膜，ECL顯色劑，Re-blot洗膜試劑。
LX-1細(xì)胞的培養(yǎng)按文獻(xiàn)的方法培養(yǎng)LX-1細(xì)胞系，于37t:、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù) 5% C02條件下，含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。 膜透析法提取分離鱉甲分子量小于6000的肽類物質(zhì)的制備方法同"發(fā)明內(nèi)容"項(xiàng) 下"第三種方法"之"(l)、 (2)"。
7
藥物處理、Western-blot法檢測將LX-1按1 X 106接種于10cm的培養(yǎng)皿，待細(xì) 胞貼壁，加入含不同濃度藥物的培養(yǎng)基(2XFCS-DMEM，培養(yǎng)時間48h)預(yù)處理2h后，加入 800pg/ml重組TGF-13 p37。C、5X C02培養(yǎng)72h。加200iil/dish的細(xì)胞裂解液，用機(jī)械法 收集細(xì)胞，冰浴30min， 10000rpm離心10min，收集上清液用BCA protein assay試劑盒進(jìn)行 總蛋白定量。取40ug蛋白加上樣緩沖液煮沸10min變性，進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳后，電轉(zhuǎn) 移至醋酸纖維素膜，5X脫脂奶粉室溫封閉2h，加入相應(yīng)的一抗(Santa Cruz)分別以封閉 液適當(dāng)稀釋，將PVDF膜浸泡其中，搖床緩慢4t:反應(yīng)過夜；洗膜4次每次10min，加辣根過氧 化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(1 : 2000， Santa Cruz)，室溫反應(yīng)2h ;洗膜5次后ECL化學(xué)發(fā)光 顯色、曝光，膠片作激光密度掃描，結(jié)果以I型膠原、III型膠原、a-SMA與對應(yīng)的P-肌動 蛋白(Actin)的密度積分比值來表示蛋白的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)以Actin為內(nèi)參照，作空白 對照、TGF-13!剌激對照和hIFN- y對照。
統(tǒng)計(jì)學(xué)方法同"實(shí)施試驗(yàn)例1"項(xiàng)下"1."。
2.試驗(yàn)結(jié)果 Western blot法檢測鱉甲粗多肽成品對TGF_ P工剌激的LX_1細(xì)胞活化及膠原合 成影響的試驗(yàn)結(jié)果顯示TGF-P !剌激組LX-1細(xì)胞Col I、 Col III、 a -SMA表達(dá)顯著高于 空白對照組(P < 0. 01) ;LX-1細(xì)胞IFN-y及鱉甲粗多肽成品10、5、lmg/ml作用組三種蛋 白表達(dá)顯著低于TGF-P工剌激對照組(P < 0. 01);鱉甲粗多肽成品10、5mg/ml組三種蛋白 表達(dá)顯著低于IFN-y作用組(P < 0. 05);鱉甲粗多肽成品10mg/ml組三種蛋白表達(dá)顯著 低于空白對照組(P < 0. 05);鱉甲粗多肽抑制TGF-P i剌激的LX-1細(xì)胞Col I、 Col III、 a -SMA蛋白表達(dá)在實(shí)驗(yàn)濃度范圍呈現(xiàn)量效依賴關(guān)系。 采用Western blot法，以目前抗肝纖維化作用最強(qiáng)的藥物IFN_ y作為對照，檢 測鱉甲提取物中分子量小于6000的肽類物質(zhì)對TGF-P i剌激的LX-1細(xì)胞I、 III型膠原 和a-SMA蛋白表達(dá)的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，鱉甲提取物分子量小于6000的肽類物質(zhì)能有 效抑制肝星狀細(xì)胞激活及膠原合成，從而阻抑肝纖維化的發(fā)展，其抑制效果呈現(xiàn)量效關(guān)系， 高中劑量的抑制效果明顯優(yōu)于對照藥物IFN-y ，從而進(jìn)一步確定了鱉甲提取物分子量小于 6000的肽類化合物為其抗肝纖維化的有效物質(zhì)部位。
"實(shí)施試驗(yàn)例1 、 2 "討論 肝纖維化是各種原因引起的一系列損傷-修復(fù)、導(dǎo)致ECM合成與降解失衡、合成沉 積遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過降解吸收、以及構(gòu)成成分比例明顯改變的結(jié)果，大量ECM沉積于肝小葉內(nèi)并逐 漸形成纖維間隔，嚴(yán)重破壞了肝組織的正常結(jié)構(gòu)和功能，可致肝竇毛細(xì)血管化，血流障礙， 門脈高壓。在肝纖維化形成發(fā)展過程中，HSC激活的啟動維持、增殖及大量合成ECM是中心 環(huán)節(jié)。HSC在各種損肝因子持續(xù)剌激下轉(zhuǎn)化為具有增生性、纖維原性及可收縮性的肌成纖 維樣細(xì)胞(MFB)，表達(dá)a -SMA(HSC活化的標(biāo)志，其表達(dá)面積、強(qiáng)度與HSC激活程度及肝纖維 化程度正相關(guān))和多種細(xì)胞因子及其受體，并大量合成以I、III型膠原為主的多種ECM ;且 HSC還通過合成和分泌基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP》、抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPS) 活性從而抑制ECM的降解。大量研究表明，許多因子參與了 HSC的激活，而其中TGF-P工為 最強(qiáng)剌激因子，通過激活HSC以及剌激肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞等使ECM過度形成與沉 積，剌激HSC等細(xì)胞合成分泌血小板衍生生長因子(PDGF)等細(xì)胞因子并增強(qiáng)PDGFR等細(xì)胞 因子受體表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)PDGF等對HSC的增殖作用，活化Smad、 MAPK信號系統(tǒng)誘導(dǎo)膠原表達(dá)，抑制MMPS而促進(jìn)TIMPS合成分泌以阻礙膠原降解，從而促進(jìn)肝纖維化形成發(fā)展。
鱉甲為鱉科動物鱉Trionyx sinensis Wiegmann的背甲。鱉甲含有動物膠(以骨 膠原為主)、多糖、角質(zhì)、蛋白、碘質(zhì)、維生素D及鐵、銅、鋅、鎂、磷等10余種微量元素，蛋白含 量為50%以上，組成蛋白質(zhì)、多肽的氨基酸有17種，其中以脯氨酸和甘氨酸為主。
本發(fā)明實(shí)施試驗(yàn)結(jié)果顯示，鱉甲小分子提取物(粗多肽成品，分子量< 6000)及鱉 甲水煎液藥物血清具有顯著的抑制HSC活化、增殖及膠原合成的作用。表明鱉甲活性物質(zhì) 通過阻斷TGF- P i在HSC內(nèi)的Smad、MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，阻止HSC向MFB轉(zhuǎn)化，使I、III型膠原 等基因表達(dá)明顯下調(diào)，減少膠原合成分泌與促進(jìn)膠原降解，達(dá)到抗肝纖維化目的。鱉甲微粉 藥物血清無抗纖維化作用(可排除鱉甲多糖發(fā)揮抗纖維化作用的可能性，因其系由P-葡 萄糖借13 -1， 4糖苷鍵組成的高分子多糖類纖維素，分子量通常在幾十萬至上百萬，不溶于 水等一些普通溶劑，人體消化液不含水解P-l，4糖苷鍵的纖維素酶，所以不被消化利用)。 而鱉甲大分子提取物(鱉甲蛋白為主，分子量> 6000)對HSC活化、增殖則起負(fù)抑制效應(yīng)； 給大鼠注射白蛋白或血清是免疫損傷性肝纖維化造模常用方法，其機(jī)理與III型變態(tài)反應(yīng) 有關(guān)；作為異種抗原的白蛋白或血清進(jìn)入大鼠體內(nèi)后，剌激其產(chǎn)生相應(yīng)抗體，當(dāng)抗原再次進(jìn) 入機(jī)體后，抗原抗體結(jié)合形成免疫復(fù)合物激活補(bǔ)體；由于抗原的反復(fù)長期剌激，過量的循環(huán) 免疫復(fù)合物來不及被清除，沉積于肝小葉間微血管壁內(nèi)外，使肝小葉周圍出現(xiàn)廣泛的進(jìn)行 性的慢性炎癥病變，導(dǎo)致肝細(xì)胞變性壞死、成纖維細(xì)胞增殖和膠原纖維病理性增生，形成肝 纖維化及至肝硬化。臨床上鱉甲研粉生用治療肝纖維化，效果不佳，認(rèn)為未經(jīng)煎煮的鱉甲因 其蛋白分子量大，而人體胃腸道消化功能所限，以致蛋白質(zhì)雖經(jīng)一定程度分解吸收，但仍未 能達(dá)到與符合抗肝纖維化的肽段分子量標(biāo)準(zhǔn)及氨基酸序列，因而難以顯效；而鱉甲經(jīng)煎煮 后，起負(fù)抑制效應(yīng)的大分子蛋白變性，變性蛋白質(zhì)易受胃腸道內(nèi)多種水解酶類的協(xié)同催化 作用而被消化，轉(zhuǎn)變?yōu)楹唵蔚男》肿与念愇镔|(zhì)，符合發(fā)揮抗肝纖維化作用的肽段分子量標(biāo) 準(zhǔn)及氨基酸序列，與鱉甲中原本存在的少量小分子肽類物質(zhì)一起，共同發(fā)揮抑制肝星狀細(xì) 胞活化增殖膠原合成、抗肝纖維化的作用。 本發(fā)明實(shí)施試驗(yàn)為鱉甲用于臨床治療肝纖維化疾患用藥的傳統(tǒng)劑型提供了科學(xué) 依據(jù)，明確了鱉甲抗肝纖維化的有效劑型，并驗(yàn)證了其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)為小分子肽類物質(zhì)，從 而為鱉甲用于抗肝纖維化臨床醫(yī)療、中藥新藥及保健品研發(fā)、鱉甲活性物質(zhì)開發(fā)為肽類藥 物奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)和提供科學(xué)依據(jù)。
實(shí)施試驗(yàn)例3 :本發(fā)明的"體內(nèi)實(shí)驗(yàn)鱉甲微粉與鱉甲水煎液抗大鼠肝纖維化的藥
理藥效學(xué)比較研究" 1.實(shí)驗(yàn)材料 1. 1實(shí)驗(yàn)動物雄性SD大鼠110只，體重200g士20g，購自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)
院實(shí)驗(yàn)動物中心。
1. 2實(shí)驗(yàn)試劑 主要試劑一抗I、 III、 IV型膠原(Col I、Col III、Col IV)、層粘蛋白(LN)、 轉(zhuǎn)化生長因子-l^ (TGF-13》、血小板衍生生長因子-BB (PDGF-BB)、基質(zhì)金屬蛋白 酶-13(匪P-13)、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-l(TIMP-l)多克隆抗體(博士德公司產(chǎn)品， 編號BA0325、 BA0326、 BA2174、 BA1761、 BA0290、 BA0519、 BA2204、 BA0575) ， a -平滑肌肌 動球蛋白(a -SMA)、核因子-k B(NF-k B)p65單克隆抗體分別為博士德公司、Santa Cruz公司產(chǎn)品(克隆號c-20) ;a-SMA和NF-kb p65_抗為鼠抗，其余為兔抗；a-SMA、 NF_ k b p65、匪P-13、TIMP-l的工作滴度為1 : 70，其余為1 : 50。 主要試劑配方蘇木素液蘇木素2. 5g，硫酸鋁鉀50g，氧化汞1. 25g，無水乙醇 25ml ，冰醋酸25ml ，加雙蒸水500ml 。伊紅染液醇溶性伊紅2g， 95%酒精500ml 。天狼猩紅 染液天狼猩紅O. 25g，飽和苦味酸500ml。 1 %鹽酸酒精鹽酸lml， 75%酒精99ml?？乖?復(fù)液0. 38g擰檬酸，2. 4g檸檬酸三鈉，加雙蒸水lOOOml。 PBS液:KC1 0. 20g， KH2P040. 2g， NaCl 8. OOg， Na2HP04 7H20 1. 56g，加雙蒸水lOOOml，調(diào)至PH 7.4。四氯化碳(CC14)分析 純購自武漢亞法生物技術(shù)有限公司，以食用色拉油配制成40%溶液。 1. 3實(shí)驗(yàn)儀器切片機(jī)(德國Leca公司)，OLYMPUS CHK型生物顯微鏡， LeicaDLMB(MP60)顯微照相系統(tǒng)，63_5型電熱恒溫培養(yǎng)箱，格蘭氏微波爐，HPIAS-IOOO型高 清晰度彩色病理圖文報告分析系統(tǒng)，JOEL 100X100CXII型透射電鏡，日立7170型自動生 化分析儀，550nm、412nm的分光光度計(jì)，可調(diào)式恒溫水浴鍋，臺式離心機(jī)，可調(diào)式移液器，酶 標(biāo)儀等。 1. 4供試藥物制備將鱉甲微粉加適量水煎煮1. 5h得混懸液。
2.實(shí)驗(yàn)方法 2. 1動物實(shí)驗(yàn)和分組將110只大鼠隨機(jī)分為6組正常對照組10只，CClJ莫型對 照組、鱉甲水煎液預(yù)防組和治療組、鱉甲微粉預(yù)防組和治療組各20只。除正常對照組外，均 給予40% CC14 0. 30ml/100g體重背部皮下注射，2/周，共12周；正常對照組給予等量等滲 鹽水背部皮下注射。每周末處死造模而未用藥物處理的大鼠5只觀察肝組織病理改變。實(shí) 驗(yàn)第4周末，中等度肝纖維化形成(纖維隔形成并互相連接，深入小葉內(nèi)，小葉結(jié)構(gòu)保留或 紊亂，但無肝硬化)。藥物預(yù)防組于造模同期分別給以鱉甲微粉煎煮混懸液(煎煮1. 5h)、 鱉甲微粉混懸液2. 7g生藥/100g體重灌胃，1/日；藥物治療組于造模第5周開始給以上述 藥液灌胃。正常對照組與模型對照組給予生理鹽水lml/100g體重灌胃，1/日。實(shí)驗(yàn)12周 末，各組隨機(jī)取10只大鼠，2%戊巴比妥那麻醉后，心臟采血，分離血清備檢；冰等滲鹽水原 位洗滌肝臟，分別用中性10%甲醛、2.5%戊二醛固定及_701:凍存?zhèn)錂z。
2. 2病理檢查肝組織標(biāo)本用中性10%甲醛固定，石蠟包埋，4咖連續(xù)切片，常規(guī)作 HE染色、天狼紅染色，觀察組織學(xué)變化，將肝纖維化分為0-4期；按2002中華肝臟學(xué)會肝 纖維化組《肝纖維化診斷與療效評估共識》進(jìn)行肝纖維化組織學(xué)半定量計(jì)分系統(tǒng)(SSS)標(biāo) 準(zhǔn)計(jì)分；肝膠原含量測定參考Jimenez等報道的測試方法，計(jì)算方法如下膠原P g/切片 (cm2) = (A540nm-7. 78% A630nm) X 1000/37。 2. 3免疫組化肝組織石蠟切片，脫蠟至水，3% H202 (30min)阻斷內(nèi)源性過氧化物 酶，PBS液洗3次，抗原修復(fù)液(0. 38g檸檬酸，2.4g檸檬酸三鈉，加雙蒸水1000ml)中微波 修復(fù)，封閉非特異性抗原。加一抗，濕盒內(nèi)置37t:孵育2小時，加二抗PicTureTM(Zymed公 司)，37t:孵育1小時，PBS液洗3次，DAB (Zymed公司)顯色10分鐘，流水終止反應(yīng)，蘇木 素復(fù)染，封片。每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)PBS空白對照和正常血清取代一抗的陰性對照，觀察各蛋白的 表達(dá)，蛋白表達(dá)的定量結(jié)果用HIPAS-1000型高清晰度彩色病理圖文報告分析系統(tǒng)在低倍 鏡下(100X)計(jì)算陽性面積百分比(％ )。匪P-13表達(dá)的定量結(jié)果在高倍鏡下(400X)計(jì) 數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)。 2. 4肝組織氧化指標(biāo)超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶
10(GSH-Px)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。 肝組織SOD、 GSH-Px酶活力檢測將10 %的肝勻漿，用生理鹽水稀釋成0. 25 %的 濃度，嚴(yán)格按S0D、GSH-Px測定試劑盒提供的方法操作，雙蒸水調(diào)零，分別于550nm波長下比 色、412nm處測各管光密度值(OD值)，計(jì)算公式分別為
組織'I'SOD活力—對照管吸光度一測定管吸光度.5。。, ^反應(yīng)液總體積.待測勻漿屮蚩白 L 」((〃附伊to,) = 對照管吸光度 t °X取樣量(W) ■含量(mgpro,/m/)
組織cs/z- 對照敦灘-測定tp施x標(biāo)準(zhǔn)管濃度x稀釋倍數(shù)二反應(yīng)吋1￥>(待測樣本蛋白含暴取樣韻
*活力 —標(biāo)準(zhǔn)管OD值-空白管O灘(20戸o〃i) (5*) 肝組織MDA檢測將10%的肝勻漿，離心10分鐘，取上清，嚴(yán)格按MDA測定試劑盒
提供的方法操作，雙蒸水調(diào)零，532nm處測各管吸光度值，計(jì)算公式為
「M9W繩^屮MD力含量測定管吸光度一 對照管吸光度:標(biāo)準(zhǔn)品濃度 待測勻漿蛋白含量 0090 ("o//mgproO—標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-空白管吸光度X (10"附o//附/)—gpro;/ w/) 2. 5血清肝功能、血脂、透明質(zhì)酸指標(biāo)自動生化分析儀檢測肝功能及血脂；放免 法檢測血清透明質(zhì)酸，試劑盒購自上海海軍醫(yī)學(xué)研究所，方法嚴(yán)格按試劑盒操作程序進(jìn)行。
2. 6透射電鏡檢查將新鮮肝組織切成lmm3小塊，用2. 5%戊二醛固定24小時，經(jīng) 梯度酒精脫水至100%丙酮30分鐘，用90%丙酮/包埋劑(1 : l)包埋過夜后，用純包埋 劑包埋5小時，低粘度spurr包埋劑6(TC過夜，在Ultracut E型切片機(jī)下切成的超薄切片 經(jīng)醋酸鈾和硝酸鉛染色，在JOEL 100X 100CXII型透射電鏡下觀察結(jié)果。
2. 7統(tǒng)計(jì)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以；± S表示，進(jìn)行方差分析和組間q檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用 Ridit檢驗(yàn)，P < 0. 05為差異具有顯著性意義。
3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果 3. 1大鼠一般情況、肝臟標(biāo)本外觀 —般情況正常組大鼠生長良好，體重自然增加，被毛光滑潤澤致密，二便如常。鱉 甲微粉預(yù)防組和治療組與模型組無顯著差異，精神萎糜，喜睡少動，或易怒好斗，胡須下垂， 被毛枯萎穢黯，食欲下降，體重增加減少，甚至較前下降，尿色黃，可有腹瀉，可有腹水出現(xiàn)。 鱉甲水煎液預(yù)防組和治療組一般情況介于兩者之間，近似正常組。
肝臟標(biāo)本外觀正常組大鼠肝臟紅褐色，表面光滑，邊緣銳利，質(zhì)地柔軟。鱉甲微粉
預(yù)防組和治療組與模型組無顯著差異，肝臟縮小，顏色較蒼灰，表面呈顆粒結(jié)節(jié)狀，油膩，邊
緣鈍，質(zhì)地硬韌。鱉甲水煎液預(yù)防組和治療組肝臟外觀介于兩者之間，近似正常組，肝表面
未見明顯顆粒結(jié)節(jié)。 3. 2病理檢查結(jié)果 鱉甲微粉預(yù)防組和治療組與模型組無顯著差異，大鼠肝組織HE、天狼紅染色可見 大量肝細(xì)胞脂肪變性存在，正常肝小葉結(jié)構(gòu)遭到破壞；匯管區(qū)和小葉間有大量粗大增生的 膠原纖維，組織切片中有大量假小葉形成；與正常組相比，纖維化分期、SSS計(jì)分顯著增高 (P < 0. 01)。與模型組及鱉甲微粉組相比，鱉甲水煎液預(yù)防組和治療組大鼠肝細(xì)胞脂肪變 性程度減弱，匯管區(qū)擴(kuò)張，有纖維隔，但多數(shù)尚未連接；纖維化分期、SSS計(jì)分顯著降低(P < 0. 01)。 3.3免疫組化結(jié)果 正常組肝臟匪P-13不表達(dá)，a-SMA、Col I、Col I工I、Co1 IV、LN、TGF-P !、NF kB 11p65、 PDGF-BB、 TIMP-1低水平表達(dá)，TGF_P工表達(dá)部位局限于肝細(xì)胞槳，PDGF-BB、 TIMP-1表 達(dá)部位局限于肝竇，其余各蛋白表達(dá)部位局限于匯管區(qū)和肝竇。鱉甲微粉預(yù)防組和治療組 與模型組無顯著差異，上述各蛋白表達(dá)較正常組顯著增強(qiáng)(P < 0.05-0. 01) ， TGF-h主要 表達(dá)在變性的肝細(xì)胞漿；NFk B p65主要表達(dá)在肝細(xì)胞漿，肝竇旁細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、膽管 上皮細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞也有表達(dá)；PDGF-BB、 TIMP-1主要表達(dá)在肝細(xì)胞漿，肝竇旁細(xì)胞和 肌成纖維細(xì)胞也有表達(dá)；匪P-13主要表達(dá)在肌成纖維細(xì)胞，肝竇旁細(xì)胞少量表達(dá)；a -SMA、 Col I、Col III、 Col IV、 LN主要表達(dá)在纖維間隔、肝竇壁、血管內(nèi)皮細(xì)胞和膽管上皮細(xì) 胞，肝細(xì)胞漿少量表達(dá)。鱉甲水煎液預(yù)防組和治療組表達(dá)特點(diǎn)同模型組及鱉甲微粉組，但 匪P-13陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)量呈不同程度減少，其余各蛋白表達(dá)面積和強(qiáng)度顯著減少和減弱 (P < 0. 05-0. 01)。
3.4肝組織氧化指標(biāo) 鱉甲微粉預(yù)防組和治療組與模型組無顯著差異，與正常組相比，S0D、 GSH-Px顯著 下降(P < 0. 05-0. 01) ， MDA顯著上升(P < 0. 01);與模型組及鱉甲微粉組相比，鱉甲水煎 液預(yù)防組和治療組SOD、 GSH-Px顯著上升(P < 0. 01) ， MDA顯著下降(P < 0. 05-0. 01)。
3. 5血清肝功能、血脂、透明質(zhì)酸指標(biāo) 鱉甲微粉預(yù)防組和治療組與模型組無顯著差異，與正常組相比，血清總膽紅 素(TBIL)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(AKP) 、 r-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶 (r-GT)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、透明質(zhì)酸(HA)顯著上升，白蛋白(ALB)下降(P < 0. 05-0. 01)。與模型組及鱉甲微粉組相比，鱉甲水煎液預(yù)防組和治療組TBIL、ALT、AST、 AKP、 r-GT、 TC、 TG、 HA顯著下降(P < 0. 05-0. 01)。
3.6透射電鏡檢查結(jié)果 鱉甲微粉預(yù)防組和治療組與模型組無明顯差異，肝細(xì)胞內(nèi)可見大小不等脂滴，大 時可擠壓整個胞漿；線粒體腫脹，部分外膜破裂和嵴斷裂；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒，嚴(yán)重時線粒 體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和溶酶體等細(xì)胞器均溶解消失；肝竇區(qū)肝星狀細(xì)胞增生，膠原產(chǎn)生增加；Disse 間隙消失，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞下基底膜形成。與模型組及鱉甲微粉組相比，鱉甲水煎液預(yù)防組和 治療組肝細(xì)胞內(nèi)脂滴較小、少，上述病變較輕微。 實(shí)施試驗(yàn)例4 :本發(fā)明的"體內(nèi)實(shí)驗(yàn)鱉甲水煎液對兩種肝纖維化大鼠模型的實(shí)驗(yàn) 研究" 1.材料與方法
1.1動物雄性SD大鼠330只，體重200g士20g，購自浙江省醫(yī)科院實(shí)驗(yàn)動物中心。
1.2實(shí)驗(yàn)用藥物 鱉甲微粉煎煮混懸液(煎煮1.5h)。注射用重組人Y-干擾素，上海克隆生物高技
術(shù)有限公司產(chǎn)品[(98)衛(wèi)藥準(zhǔn)字(滬克隆)S-01號]，批號970521， 100萬IU/支，臨用前
以lml注射用水溶解。扶正化瘀膠囊，上海中醫(yī)藥大學(xué)肝病研究所研制，上?，F(xiàn)代中醫(yī)藥技
術(shù)發(fā)展有限公司出品，批號國藥準(zhǔn)字Z20020073、 Z20020074， 0. 5g/粒。 1.3大鼠分組及實(shí)驗(yàn)步驟 1. 3. 1四氯化碳(CC14)大鼠肝纖維化模型組 四氯化碳(CC14)分析純購自武漢亞法生物技術(shù)有限公司，以食用色拉油配制成40%溶液。 190只大鼠隨機(jī)分為10組正常對照組10只，CC^模型對照組、鱉甲水煎液高、低
劑量預(yù)防組和治療組、扶正化瘀膠囊預(yù)防組和治療組、IFN-y預(yù)防組和治療組各20只。除
正常對照組外，均給予40%(1:14 0. 30ml/100g體重背部皮下注射，2/周，共12周；正常對照
組給予等量等滲鹽水背部皮下注射。每周末處死造模而未用藥物處理的大鼠5只觀察肝組
織病理改變。實(shí)驗(yàn)第4周末，中等度肝纖維化形成(纖維隔形成并互相連接，深入小葉內(nèi)，
小葉結(jié)構(gòu)保留或紊亂，但無肝硬化)。藥物預(yù)防組于造模同期分別給以鱉甲微粉煎煮混懸液
(煎煮1.5h)1.8g生藥/100g體重灌胃、1/日(低劑量組)、2/日(高劑量組)，扶正化瘀膠
囊(內(nèi)置藥粉用生理鹽水溶解)O. 046g生藥/100g體重灌胃、1/日，IFN-Y2.5萬IU/100g
體重肌肉注射，1/日；藥物治療組于造模第5周開始每日給以上述劑量藥物。正常對照組
與模型對照組給予生理鹽水lml/100g體重灌胃，1/日。實(shí)驗(yàn)12周末，各組隨機(jī)取10只大
鼠，2%戊巴比妥那麻醉后，心臟采血，分離血清備檢；冰等滲鹽水原位洗滌肝臟，分別用中
性10%甲醛、2. 5%戊二醛固定及-7(TC凍存?zhèn)錂z。 1.3.2 二甲基亞硝胺(DMN)大鼠肝纖維化模型組 二甲基亞硝胺(DMN)分析純購自天津市化學(xué)試劑研究所。 150只大鼠隨機(jī)分為8組正常對照組10只，DMN模型對照組、鱉甲水煎液預(yù)防組 和治療組、扶正化瘀膠囊預(yù)防組和治療組、IFN-y預(yù)防組和治療組各20只。除正常對照 組外，均給予1% DMN10mg/kg體重腹腔內(nèi)注射，共13次，實(shí)驗(yàn)第1周連續(xù)用藥3日，1/日； 后5周每周連續(xù)用藥2日，1/日，共6周，每周末處死造模而未用藥物處理的大鼠5只觀察 肝組織病理改變，直至中度肝纖維化形成。實(shí)驗(yàn)第4周末，中度肝纖維化模型建成。藥物 處理預(yù)防組于造模同期直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，鱉甲按1. 3. 1高劑量組每日劑量給藥，扶正化瘀膠 囊、IFN-y組每日給藥劑量同1.3.1;治療組于造模第5周開始給藥4周，實(shí)驗(yàn)共8周。實(shí) 驗(yàn)結(jié)束標(biāo)本采集同1.3. 1。
1.4檢測指標(biāo)
1.4. l病理檢查 肝組織標(biāo)本用10%福爾馬林液固定24h取材，常規(guī)石蠟切片，切片厚度5um，HE染 色、天狼紅染色，光鏡觀察。試劑天狼紅(DIRECT RED 80)購自SIGMA公司。參照2002年 中華肝臟病學(xué)會肝纖維化學(xué)組制定的《肝纖維化診斷與療效評估供識》，將肝纖維化程度分 為0-4期(HE切片觀察)，按肝纖維化組織學(xué)半定量計(jì)分系統(tǒng)(SSS)標(biāo)準(zhǔn)計(jì)分(天狼紅切片 觀察)。 1.4.2免疫組化 肝組織標(biāo)本用10%福爾馬林液固定24h取材，常規(guī)石蠟切片，切片厚度5um，免疫 組化染色采用POWERVISION 二步法，光鏡觀察。 一抗Col I、Col IV、LN、TMP-l、Smad 2/3、Smad 7抗體購自博士德公司(BA0325、 BA2170、 BA1399、 BA1761、 BA0575、 BA1395) ， TGF-P工、NF-k B、 Bax、 Bcl-2抗體購自Santa Cruz公司(1ot.A031、lot.C2008、lot.F1008、)，Co1 III、 a-SMA、PDGF_BB抗體購自ABCAM 公司(AB-59436、 Lot. 150745、 AB-21234) ， a-SMA和NF-k B —抗為鼠抗，其余為兔抗。 POWERVISION試劑購自北京中杉金橋公司。步驟切片脫蠟至水，3% H202 (10min)阻斷內(nèi)源 性過氧化物酶，PBS洗5minX3，Co1 I、Col IV、 Smad 7組滴加0. 1 %胰酶，Col III組滴加樹膠封片。
每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)PBS空白對照和正常血清取代一抗的陰性對照，觀察各蛋白的表 達(dá)，蛋白表達(dá)的定量結(jié)果采用LEICA QWIN圖像分析系統(tǒng)，每張切片在100倍鏡下取5個視 野，計(jì)算陽性面積百分比(％ ) ;TGF-l^、PDGF-BB、TIMP-l、Bax、Bcl-2表達(dá)的定量結(jié)果，每 張切片在400倍視野下，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)。
1. 4. 3肝組織氧化指標(biāo)、羥脯氨酸 超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、羥脯氨酸 (Hyp)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。 肝組織SOD、 GSH-Px酶活力檢測將10 %的肝勻漿，用生理鹽水稀釋成0. 25 %的 濃度，嚴(yán)格按S0D、GSH-Px測定試劑盒提供的方法操作，雙蒸水調(diào)零，分別于550nm波長下比 色、412nm處測各管光密度值(0D值)，計(jì)算公式分別為 「 ，組織屮soz)活力_對照管吸光度一測定管吸光度.5()|;/"::反應(yīng)液總體積.待測勻漿中蛋白
("/zngp加) = 玩照管吸光虔 '°X取樣量(W)'含量(w朋to〃/w/)
「01321組織G訓(xùn)—P, —M^l^i^^寧x標(biāo)準(zhǔn)管濃度x稀釋倍數(shù)二反應(yīng)吋f^(待測樣木蛋白含S取樣韻 酶活力 標(biāo)準(zhǔn)管09但-空白管0￡>值(20/wo〃i) (5*) 肝組織MDA檢測將10%的肝勻漿，離心10分鐘，取上清，嚴(yán)格按MDA測定試劑盒 提供的方法操作，雙蒸水調(diào)零，532nm處測各管吸光度值，計(jì)算公式為
組,、中AfZ^含量—測定管吸光度一對照管吸光度x標(biāo)準(zhǔn)品濃度 待測勻漿蛋白含量
("腳〃，嚴(yán)o,)—標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-空白管吸光度X (10鵬o〃m/)—砂ro〃附/) 肝組織HYP測定(樣本堿水解法)嚴(yán)格按HYP測定試劑盒提供的方法操作，將 10%的肝勻槳，離心10分鐘，取上清，550nm處，lcm光徑，雙蒸水調(diào)零，測各管吸光度值，計(jì) 算公式為
羥脯氨酸含量^_測定管吸光度一空白管吸光度x標(biāo)準(zhǔn)管含量x水解液總體積(w/) (收/mg濕重)—標(biāo)準(zhǔn)管吸光度一空白管吸光度X (5Mg/m/) X 組織重量—g) ~ 1. 4. 4血清肝功能、血脂、透明質(zhì)酸指標(biāo) 自動生化分析儀檢測肝功能及血脂；放免法檢測血清透明質(zhì)酸，試劑盒購自上海 海軍醫(yī)學(xué)研究所，方法嚴(yán)格按試劑盒操作程序進(jìn)行。
1.4. 5統(tǒng)計(jì)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以；±s表示，進(jìn)行方差分析和組間q檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用Ridit檢驗(yàn)，P
<0. 05為差異具有顯著性意義。 2.結(jié)果 2. l病理檢查結(jié)果 HE染色，正常組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞無脂肪變性等病變，匯管區(qū)未見纖維 組織增生及炎癥細(xì)胞浸潤；天狼紅染色，正常組僅在匯管區(qū)及中央靜脈見少量纖維組織。
CC14模型對照組大鼠肝組織HE、天狼紅染色可見肝細(xì)胞重度脂肪變性，正常肝小 葉結(jié)構(gòu)遭到破壞；匯管區(qū)、中央靜脈和小葉間有大量粗大增生的膠原纖維，并有淋巴細(xì)胞浸 潤，組織切片中有大量大小不等的假小葉形成；DMN模型對照組大鼠肝組織小葉結(jié)構(gòu)不清，
14肝細(xì)胞索排列紊亂，肝細(xì)胞輕度水腫及脂肪變性，間質(zhì)有淋巴細(xì)胞浸潤，匯管區(qū)及肝細(xì)胞間 有纖維組織增生，部分區(qū)域呈網(wǎng)狀分布。模型對照組肝纖維化分期、SSS計(jì)分較正常組顯 著增高(P<0.01)。與相應(yīng)模型對照組相比，各藥物處理組上述病變有不同程度減輕，肝 小葉結(jié)構(gòu)趨向正常，纖維間隔明顯變薄，纖維化分期、SSS計(jì)分顯著降低(P < 0. 05-0. 01)。 藥物處理組間比較，肝纖維化分期CC14模型組中，鱉甲治療組高劑量預(yù)防組較之扶正化瘀 膠囊、y-干擾素相應(yīng)處理組顯著降低(P<0.05) ;D麗模型組中，鱉甲預(yù)防、治療組較之 y-干擾素相應(yīng)處理組顯著降低(P<0.05)。 SSS計(jì)分CCl4模型組中，鱉甲預(yù)防組較之相 應(yīng)劑量治療組，鱉甲預(yù)防、治療組較之扶正化瘀膠囊相應(yīng)處理組，鱉甲治療組較之y-干擾 素治療組顯著降低，P < 0. 05-0. 01。
2.2免疫組化結(jié)果 Col I、Col III、 Col IV、 a-SMA、Smad 7，陽性物質(zhì)定位于纖維組織內(nèi)，部分肝細(xì) 胞胞漿也有陽性表達(dá)；正常鼠肝僅在匯管區(qū)及中央靜脈壁見少量Col I、Col III、C01IV、 a -SMA陽性纖維，模型對照組在假小葉周圍及匯管區(qū)見大量陽性纖維、部分區(qū)域肝細(xì)胞間 也可見陽性纖維、部分肝細(xì)胞也有陽性表達(dá)。LN、Smad 2/3，陽性物質(zhì)定位于肝竇內(nèi)襯細(xì)胞 及炎性細(xì)胞胞漿內(nèi)。TGF-13 ^PDGF-BB、TIMP-1，陽性物質(zhì)主要定位于肝細(xì)胞胞漿內(nèi)。
正常組肝臟a-SMA、天狼紅膠原染色、Col I、 Col III、 Col IV、 LN、 TGF-P ^ PDGF-BB低水平表達(dá)，TMP-1未見表達(dá)；模型對照組上述各蛋白表達(dá)較正常組顯著增強(qiáng)(P <0.01);各藥物處理組上述蛋白表達(dá)面積和強(qiáng)度較相應(yīng)模型對照組顯著減少和減弱(P < 0. 05-0. 01)。藥物處理組間比較，天狼紅膠原染色表達(dá)CC14模型組中，鱉甲預(yù)防、治療 組較之扶正化瘀膠囊、y _干擾素相應(yīng)處理組，鱉甲高劑量預(yù)防、治療組較之低劑量相應(yīng)處 理組，顯著減少和減弱，P < 0. 05-0. 01 ;DMN模型組中，鱉甲治療組較之y-干擾素治療組 顯著減少和減弱(P < 0. 05) 。 Col I表達(dá)CCl4模型組中，鱉甲高劑量預(yù)防組較之低劑量 組、扶正化瘀膠囊、y-干擾素預(yù)防組，鱉甲高劑量治療組較之y-干擾素治療組，顯著減少 和減弱，P < 0. 05 ;DMN模型組中，鱉甲預(yù)防組較之治療組、扶正化瘀膠囊預(yù)防組，顯著減少 和減弱，P〈0.05。 Col III表達(dá)CCh模型組中，鱉甲預(yù)防組較y-干擾素預(yù)防組、鱉甲 高劑量治療組較y-干擾素治療組，顯著減少和減弱，P < 0.05。 LN表達(dá)CCh模型組中， 鱉甲高劑量預(yù)防組較之高劑量治療組顯著減少和減弱，P < 0. 05。 a -SMA表達(dá)CC14模型 組中，鱉甲高劑量預(yù)防組較之扶正化瘀膠囊、y-干擾素預(yù)防組，鱉甲治療組較之y-干擾 素治療組，顯著減少和減弱，P<0. 05-0.01 ;D麗模型組中，鱉甲預(yù)防組較之治療組，鱉甲 治療組較之扶正化瘀膠囊、y-干擾素治療組，顯著減少和減弱，P〈0.05。 TGF-I^表達(dá) CC14模型組中，鱉甲高劑量預(yù)防組較之高劑量治療組、低劑量預(yù)防組、扶正化瘀膠囊、y -干 擾素預(yù)防組，鱉甲高劑量治療組較之扶正化瘀膠囊、y-干擾素治療組，顯著減少和減弱，P <0. 05-0. 01。TGF-P i下游信號通道蛋白Smad表達(dá)正常肝組織內(nèi)有一定量Smad 7表達(dá)而 Smad 3較少；模型對照組較正常組Smad 3表達(dá)顯著增強(qiáng)(P < 0. 01);各藥物處理組較相應(yīng) 模型對照組Smad 3表達(dá)顯著減少和減弱(P < 0. 05) ;CC14模型組中，鱉甲治療組Smad 3表 達(dá)較之扶正化瘀膠囊、y-干擾素治療組顯著減少和減弱(P<0.05) ;CCl4模型組中，扶正 化瘀膠囊治療組較之模型對照組Smad 7表達(dá)顯著增強(qiáng)，P〈0. 05。TIMP-1表達(dá)CClJ莫型組 中，鱉甲高劑量預(yù)防組較之低劑量組，鱉甲低劑量預(yù)防組較之治療組，鱉甲高劑量治療組較 之低劑量組、扶正化瘀膠囊、y-干擾素治療組，顯著減少和減弱，P〈0. 05-0.01 ;D^a莫型
15組中，鱉甲預(yù)防組較之治療組、扶正化瘀膠囊、y-干擾素預(yù)防組，鱉甲治療組較之y-干擾 素治療組，顯著減少和減弱，P < 0. 05。 Bax表達(dá)正常組未見表達(dá)；模型組主要表達(dá)在肝細(xì) 胞漿，其次在纖維間隔、肝竇和中央靜脈，模型組較正常組表達(dá)顯著增強(qiáng)(P<0.01) ;Bcl-2 表達(dá)正常組在肝細(xì)胞漿、肝竇和中央靜脈低水平表達(dá)，模型組主要表達(dá)在纖維間隔、匯管 區(qū)，其次在肝細(xì)胞漿、肝竇和中央靜脈，模型組較正常組顯著增強(qiáng)(P<0.01);各藥物處理
組較相應(yīng)模型對照組顯著減少和減弱(P< 0.05-0. 01) ;CCl4模型組中，鱉甲高劑量預(yù)防組 較之高劑量治療組、低劑量預(yù)防組、扶正化瘀膠囊、y -干擾素預(yù)防組，鱉甲治療組較之扶正 化瘀膠囊、y-干擾素治療組，顯著減少和減弱，P < 0. 05-0. 01 ;Bax/Bcl-2比值CClJ莫型 組中，鱉甲高劑量預(yù)防組較之高劑量治療組、低劑量預(yù)防組、扶正化瘀膠囊、y-干擾素預(yù)防 組，鱉甲治療組較之扶正化瘀膠囊、y-干擾素治療組，顯著增高，P < 0. 05-0. 01。
2. 3肝組織氧化指標(biāo)、羥脯氨酸檢測結(jié)果 模型組較之正常組，GSH-Px顯著下降，MDA、Hyp顯著上升，P < 0. 01。各藥物處理 組較之相應(yīng)模型對照組，SOD、GSH-Px顯著上升，MDA、Hyp顯著下降，P < 0. 05-0. 01。 CC14模 型組中，鱉甲高劑量預(yù)防組，較之高劑量治療組GSH-Px顯著上升，較之鱉甲低劑量預(yù)防組、 扶正化瘀膠囊預(yù)防組Hyp顯著下降，P < 0. 05-0. 01 ;鱉甲低劑量預(yù)防組較之低劑量治療組 GSH-Px顯著上升，P < 0. 05 ;鱉甲高劑量治療組較之扶正化瘀膠囊治療組MDA顯著下降，鱉 甲治療組較之扶正化瘀膠囊、y _干擾素治療組，Hyp顯著下降，P〈 0.05。 DMN模型組中， 鱉甲預(yù)防組較之治療組、扶正化瘀膠囊預(yù)防組，GSH-Px顯著上升，P < 0. 01 ;鱉甲治療組較 之扶正化瘀膠囊治療組SOD、 GSH-Px顯著上升，較之y _干擾素治療組GSH-Px顯著上升，P < 0. 05。 2. 4血清肝功能、血脂、透明質(zhì)酸指標(biāo) 模型組較之正常組TBIL、ALT、AST、AKP、r-GT、TBA、HA顯著上升，CC14模型對照組 TC、TG及DMN模型對照組TC較之正常組顯著上升，P < 0. 05-0. 01。各藥物處理組較之相應(yīng) 模型對照組，TBIL、ALT、AST、AKP、r-GT、TBA、HA顯著下降，P < 0. 05-0. 01 ;CC14模型組中， 鱉甲、y-干擾素處理組較之模型對照組TC顯著下降，鱉甲預(yù)防組及扶正化瘀膠囊、y-干 擾素處理組較之模型對照組TG顯著下降，P < 0. 05 ;D麗模型組中，鱉甲預(yù)防組、y _干擾 素處理組較之模型對照組TC顯著下降，P < 0. 05。藥物處理組間比較，CC14模型組中，鱉甲 高劑量預(yù)防組，較之高劑量治療組TBIL、AKP、r-GT、TBA顯著下降，較之低劑量預(yù)防組TBIL、 ALT、AST、r-GT、TBA、HA顯著下降，較之扶正化瘀膠囊預(yù)防組TBIL、ALT、r-GT、TBA顯著下降， 較之y-干擾素預(yù)防組TBIL、ALT、AST、r-GT、TBA顯著下降，P < 0.05-0. 01 ;鱉甲低劑量預(yù) 防組，較之低劑量治療組TBIL、 ALT、 AKP、 r_GT、 TBA顯著下降，較之扶正化瘀膠囊、y _干擾 素預(yù)防組TBA顯著下降，P < 0. 05-0. 01 ;鱉甲高劑量治療組，較之低劑量治療組ALT、r-GT、 TBA、 HA顯著下降，較之扶正化瘀膠囊治療組r-GT、 TBA、 HA顯著下降，較之y _干擾素治療 組ALT、AST、r-GT、TBA顯著下降，P < 0. 05-0. 01 ;鱉甲低劑量治療組，較之扶正化瘀膠囊治 療組TBA顯著下降，較之y-干擾素治療組AST、 TBA顯著下降，P < 0.05-0. 01。 D麗模型 組中，鱉甲預(yù)防組，較之治療組AST、AKP、r-GT、HA顯著下降，較之扶正化瘀膠囊預(yù)防組TBIL 顯著下降，較之y _干擾素預(yù)防組TBIL、 ALT、 AST顯著下降，P < 0. 05-0. 01 ;鱉甲治療組， 較之扶正化瘀膠囊治療組TBIL、 ALT、 r-GT顯著下降，較之y _干擾素治療組TBIL、 ALT顯 著下降，P < 0. 05-0. 01。
16例3、4"討論 在肝纖維化形成發(fā)展過程中，肝星狀細(xì)胞(HSC)的"持續(xù)性"活化、增殖及大量 合成細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)是中心環(huán)節(jié)。a-平滑肌肌動球蛋白(ci-SMA)是活化HSC的特 異性標(biāo)志，且其表達(dá)強(qiáng)度與HSC激活程度、肝纖維化程度明顯正相關(guān)。HSC的激活過程， 是多種細(xì)胞因子旁分泌和自分泌協(xié)同作用的結(jié)果，其中起關(guān)鍵作用的因子是轉(zhuǎn)化生長因 子-13 i (TGF-13》和血小板衍生生長因子-BB (PDGF-BB) 。 TGF- P :被認(rèn)為是最重要的促肝纖 維化因子，TGF-13 i及其II型受體(TGF-13 311)、以及TGF- P :信號通道蛋白Smad在肝纖維 化形成進(jìn)展中起著重要作用；肝內(nèi)TGF-13工與TGF- P ^11結(jié)合后，繼而活化TGF- P ^1，活性 TGF-I^RI的激酶區(qū)直接使Smad 2、3自動磷酸化，與共同介質(zhì)型Smad 4形成異源寡聚體復(fù) 合物，該復(fù)合物隨即轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，介導(dǎo)TGF-I3工的生物學(xué)效應(yīng)；TGF-P J秀發(fā)肝纖維化的機(jī) 制主要包括活化HSC，并剌激肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞以及肝細(xì)胞等合成ECM，剌激HSC 等細(xì)胞合成分泌PDGF-BB等細(xì)胞因子并增強(qiáng)PDGFR等細(xì)胞因子受體表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)PDGF-BB 等對HSC的增殖作用，同時，TGF-13工抑制MMPS而促進(jìn)TIMPS合成分泌以阻礙膠原降解，抑制 肝細(xì)胞再生和誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，影響肝功能；而抑制型Smad 6、7是細(xì)胞中TGF_|3 型受 體拮抗蛋白，能牢固地與TGF-P 型受體結(jié)合，使之無法將Smad 2、3磷酸化而阻斷信號 轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。PDGF-BB作為最強(qiáng)有絲分裂原，有顯著的促進(jìn)HSC活化、分裂、增殖、合成膠原等 作用；上調(diào)TMPS而抑制MMPS活性，減少ECM降解。TGF- P :與PDGF-BB都以正反饋方式作 用于HSC活化通路的信號傳導(dǎo)，形成級聯(lián)放大效應(yīng)，導(dǎo)致HSC的不斷激活和肝纖維化的發(fā)生 發(fā)展。 肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)為肝星狀細(xì)胞的廣泛激活，肝纖維化逆轉(zhuǎn)機(jī)理之一為活 化的肝星狀細(xì)胞(肌成纖維細(xì)胞，MFB)凋亡加強(qiáng)。Bcl-2是抗凋亡蛋白，主要通過防止線 粒體內(nèi)釋放出凋亡因子(AIF、 Cytochrome C、 pro-caspase-2、-3、 _9等)來發(fā)揮抗凋亡作 用，是阻遏細(xì)胞凋亡的核心分子；Bax為促凋亡蛋白，主要通過與Bcl-2形成異二聚體，以使 Bcl-2滅活，由此決定具有活性的Bcl-2分子數(shù)，實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Bax、 Bcl-2在模型組表達(dá)均顯著高于正常組，Bax表達(dá)增強(qiáng)提示肝細(xì)胞凋亡有所增強(qiáng)。Bcl-2在 纖維間隔區(qū)表達(dá)高于其他區(qū)域符合應(yīng)激情況下Bcl-2表達(dá)加強(qiáng)有助于促進(jìn)肝細(xì)胞存活、再 生的觀點(diǎn)。有研究報道，y-干擾素對整個肝組織和纖維間隔中的Bax、Bcl-2的作用不同， 能抑制整個肝組織Bax、Bcl-2的表達(dá)但對Bax/Bcl-2比值(此比值被認(rèn)為是一重要的凋亡 消長決定因素)無明顯作用，能顯著抑制纖維間隔(其中的細(xì)胞主要為MFB)的Bcl-2表達(dá) 但對Bax表達(dá)無明顯影響由此Bax/Bcl-2比值有上升趨勢，從而促進(jìn)MFB凋亡，推測y-干 擾素對肝中不同細(xì)胞的凋亡起不同的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示出藥物處理組類似的對MFB凋 亡的調(diào)節(jié)效應(yīng)。 核因子-k B p65(NF-k B p65)是真核細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄中重要的調(diào)控因子，經(jīng)有毒物 質(zhì)氧化應(yīng)激產(chǎn)物誘導(dǎo)激活后，通過調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)，剌激細(xì)胞因子釋放而促進(jìn)HSC活化，并 抑制HSC凋亡。 肝臟ECM的代謝主要由mPs及其抑制因子TMPS調(diào)節(jié)，MMPS促進(jìn)ECM降解，而TMPS 通過抑制匪Ps從而阻止ECM的降解。多項(xiàng)研究表明，匪Ps在肝纖維化形成過程中變化復(fù)雜， 與病程、檢測方法、酶原、活化與結(jié)合狀態(tài)等因素有關(guān)；研究發(fā)現(xiàn)，增加膠原酶的數(shù)量不是影 響ECM降解的最主要因素，提高膠原酶活性可能對ECM的降解更有意義。TIMP工是最重要的
17基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子，它可與活化的匪P-9，匪P-1及匪P-13等以1 : l的比例形 成復(fù)合物，使后者活性下降，造成ECM主要成分I 、 111型膠原降解減少、沉積增加，促進(jìn)肝纖 維化的發(fā)展。 肝纖維化形成的自由基機(jī)制還認(rèn)為，單純肝細(xì)胞損傷不足以誘導(dǎo)肝纖維化，氧化 應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化是諸多病因引起肝損傷向肝纖維化發(fā)展的中間必經(jīng)環(huán)節(jié)。脂質(zhì)過氧化反 應(yīng)的一系列醛類產(chǎn)物如丙二醛(MDA)等不僅可活化Kupffer細(xì)胞、釋放多種細(xì)胞因子繼而 激活HSC，還可直接剌激HSC活化增殖，轉(zhuǎn)化為肌成纖維樣細(xì)胞并大量合成膠原。實(shí)驗(yàn)證實(shí)， HSC胞內(nèi)氧化物含量與HSC活化水平正相關(guān)，而抗氧化劑如過氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘 肽過氧化物酶(GSH-Px)等則能抑制HSC的活化、增殖和膠原的沉積。 抑制HSC活化和促進(jìn)MFB凋亡、減少膠原合成和促進(jìn)膠原降解是逆轉(zhuǎn)肝纖維化的 關(guān)鍵，保護(hù)肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能、抗氧化應(yīng)激等為防治肝纖維化重要環(huán)節(jié)。
本發(fā)明實(shí)施試驗(yàn)，采用抗肝纖維化研究的常用模型，CC14、 DMN分別誘導(dǎo)大鼠肝纖 維化，旨在從不同視角了解鱉甲對不同原因引起肝纖維化的預(yù)防治療作用(在觀察肝纖維 化模型的形成過程中，于染毒后每周各解剖5只大鼠觀察肝組織病理改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CCl4 組大鼠在肝纖維化形成前，肝臟病變以脂肪變性為主，而D^a且大鼠則以出血、壞死為主要 病理改變)。研究結(jié)果顯示，與模型對照組相比，鱉甲水煎液處理組能顯著改善肝纖維化大 鼠肝組織病理，抑制a-SMA、Col I、Col III、Col IV、 LN等表達(dá)，降低Hyp及血清HA ;下調(diào) TGF-P p PDGF-BB，并作用于TGF_|3工下游信號通道蛋白，抑制Smad 3等因子表達(dá)，提升肝 內(nèi)Smad 7，從而作用于TGFU勺正、負(fù)反饋環(huán)路，在各階段阻斷TGF-h發(fā)揮病理作用；通 過抑制TIMP-1蛋白表達(dá)，有利于改善膠原酶活性，促進(jìn)ECM降解；顯著抑制主要定位于纖 維間隔的Bcl-2的表達(dá)，對Bax的表達(dá)無明顯影響，Bax/Bcl-2的比值升高，推測可能是促 進(jìn)MFB凋亡的作用機(jī)制之一 ；通過抑制NF- k B含量和活性及其所調(diào)控的細(xì)胞因子釋放，間 接抑制HSC的活化和增殖，促進(jìn)活化HSC的凋亡；同時具有保護(hù)肝細(xì)胞、改善肝功能、抗氧化 應(yīng)激等作用，顯著降低肝組織MDA水平，提高SOD、 GSH-Px活性，對于CC14、 D麗兩種肝纖維 化大鼠模型均具有明顯的預(yù)防和治療綜合效應(yīng)，作用相當(dāng)或優(yōu)于公認(rèn)有效的抗肝纖維化藥 物Y-干擾素、扶正化瘀膠囊，預(yù)防組及高劑量組效果尤佳。研究結(jié)果同時表明，鱉甲微粉 藥液無抗大鼠肝纖維化藥理藥效學(xué)作用。從而進(jìn)一步為歷來存在爭議的鱉甲臨床用藥的傳 統(tǒng)劑型提供了科學(xué)依據(jù)，驗(yàn)證了其有效劑型——鱉甲水煎液抗肝纖維化的藥理作用，結(jié)合 課題組同期研究證實(shí)的鱉甲抗肝纖維化的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)為小分子肽類物質(zhì)，認(rèn)為鱉甲經(jīng)煎 煮后，對肝星狀細(xì)胞活化增殖膠原合成起負(fù)抑制效應(yīng)的大分子蛋白變性，變性蛋白質(zhì)易受 胃腸道內(nèi)多種水解酶類的協(xié)同催化作用而被消化，轉(zhuǎn)變?yōu)楹唵蔚男》肿与念愇镔|(zhì)，符合發(fā) 揮抗肝纖維化作用的肽段分子量標(biāo)準(zhǔn)及氨基酸序列，與鱉甲中原本存在的少量小分子肽類 物質(zhì)一起，共同發(fā)揮抑制肝星狀細(xì)胞活化增殖膠原合成、抗肝纖維化的作用。從而為藥食同 源的傳統(tǒng)中藥鱉甲用于抗肝纖維化臨床醫(yī)療、中藥新藥及保健品研發(fā)、鱉甲活性物質(zhì)開發(fā) 為肽類藥物奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)和提供科學(xué)依據(jù)。
權(quán)利要求
一種抗肝纖維化有效劑型的制備方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1)鱉甲研粉，過八十目篩，氣流粉碎機(jī)處理，收集超微粉；(2)將上述超微粉與藥學(xué)上常規(guī)的賦形劑一起制成各種常規(guī)劑型；或(2)取鱉甲超微粉進(jìn)行煎煮，煎煮1.5-5個小時，收集混懸液；將上述混懸液與藥學(xué)上常規(guī)的賦形劑一起制成各種常規(guī)劑型。
2. —種抗肝纖維化有效劑型的制備方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1) 稱取常規(guī)研磨的鱉甲粉81—100份，加蒸餾水O. l-5份，超聲提取5—30分鐘，抽濾，濾渣再加蒸餾水0. 1-5份，超聲提取5—15分鐘，抽濾；合并兩次產(chǎn)生的濾液，冷凍干燥后得凍干粉；(2) 用加蒸餾水O. l-5份溶解上述制得的凍干粉，將水溶液裝于3.500A半透膜內(nèi)，置0. 2-5份蒸餾水中透析I一IO小時，溫度為2-l(TC;同法再透析一次，合并兩次膜外透析液，真空冷凍干燥，收集A型凍干粉0. 2-10份；(3) 取上述膜內(nèi)液體，將膜袋置0. 2-10份蒸餾水中透析l一6小時，溫度為2-10°C ;同法透析三次，棄去膜外透析液，將膜內(nèi)液體真空冷凍干燥，收集B型凍干粉1-20份；(4) 將上述A型凍干粉或B型凍干粉與藥學(xué)上常規(guī)的賦形劑一起制成各種常規(guī)劑型。
全文摘要
一種抗肝纖維化有效劑型的制備方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1)鱉甲研粉，過八十目篩，氣流粉碎機(jī)處理，收集超微粉；(2)將上述超微粉與藥學(xué)上常規(guī)的賦形劑一起制成各種常規(guī)劑型；或(2)取鱉甲超微粉進(jìn)行煎煮，煎煮1.5-5個小時，收集混懸液；將上述混懸液與藥學(xué)上常規(guī)的賦形劑一起制成各種常規(guī)劑型；鱉甲經(jīng)煎煮后，大分子蛋白變性，變性蛋白質(zhì)易受胃腸道內(nèi)多種水解酶類的協(xié)同催化作用而被消化，轉(zhuǎn)變?yōu)楹唵蔚男》肿与念愇镔|(zhì)，符合發(fā)揮抗肝纖維化作用的肽段分子量標(biāo)準(zhǔn)及氨基酸序列，與鱉甲中原本存在的少量小分子肽類物質(zhì)一起，共同發(fā)揮抗肝纖維化的作用；從而為藥食同源的傳統(tǒng)中藥鱉甲用于抗肝纖維化臨床醫(yī)療、中藥新藥及保健品研發(fā)、鱉甲活性物質(zhì)開發(fā)為肽類藥物奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)和提供科學(xué)依據(jù)。
文檔編號A61P1/16GK101703523SQ20091015479
公開日2010年5月12日 申請日期2009年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月8日
發(fā)明者劉焱文, 張赤志, 邵志華, 高建蓉 申請人:浙江衢化醫(yī)院;湖北中醫(yī)學(xué)院;巨化集團(tuán)公司