專(zhuān)利名稱(chēng)：蚯蚓纖溶酶抗肝纖維化的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蚯頓纖溶酶(即蚓激酶)抗肝纖維化的應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
二背景技術(shù)：
1.肝纖維化是一切慢性肝病的共同的病理基礎(chǔ)，是發(fā)展到肝硬化必經(jīng)的中 心環(huán)節(jié)。肝纖維化是肝細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)(主要為膠原蛋白、其次為結(jié)構(gòu)糖蛋 白、糖胺多糖和彈性蛋白)的分泌大于降解，因而造成細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積的 病理過(guò)程。
肝纖維化的病因大致可分為感染性(慢性乙型、丙型和丁型病毒性肝炎、 血吸蟲(chóng)病等)，化學(xué)代謝缺陷(慢性酒精性肝病、慢性藥物性肝病)，先天性 代謝缺陷以及自身免疫性肝炎等。
單就乙型肝炎而言，全世界乙型肝炎表面抗原(HBsAg)攜帶者超過(guò)2.8億；我 國(guó)是乙型肝炎高流行區(qū)，有1.3億人口是HBsAg攜帶者，慢性乙型肝炎患者超過(guò)3000 萬(wàn)，其中25-40%的患者可發(fā)展為肝硬化或肝癌。每年我國(guó)死于乙肝后肝硬化、肝癌 患者達(dá)40萬(wàn)人。肝穿刺標(biāo)本分析表明，輕型慢性肝炎患者發(fā)生肝纖維化者占62.6%， 中度、重度慢性肝炎患者100%出現(xiàn)肝纖維化。
近年的基礎(chǔ)和臨床研究表明，肝纖維化尤其早期肝纖維化是一種可逆的病理過(guò) 程，除了有效的病因治療，如果能直接抑制肝細(xì)胞外基質(zhì)的合成和/或促進(jìn)其降 解，則已經(jīng)形成的肝纖維化甚至早期肝硬化也是可以逆轉(zhuǎn)的。因此，抗纖維化治 療已成為國(guó)內(nèi)外肝病專(zhuān)家關(guān)注的熱點(diǎn)。
徹底治療慢性肝炎的原發(fā)病不能完全代替抗纖維化治療，如同有的患者HBeAg 已轉(zhuǎn)陰，但肝纖維化仍在進(jìn)展。抗纖維化藥物的作用分為抑制膠原蛋白的合成、分泌 與沉積以及促進(jìn)細(xì)胞外已經(jīng)沉積的膠原蛋白的降解。因此抗纖維化治療主要針對(duì)兩個(gè) 方面進(jìn)行(1)抑制肝星狀細(xì)胞活化，抑制肝星狀細(xì)胞的膠原合成，促進(jìn)肝星狀細(xì) 胞凋亡；(2)抑制細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix, ECM)合成、增加細(xì)胞外基質(zhì)降 解；抑制基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物(tissue inhibitor metalloproteinase-l TIMP-1)的 合成、提高基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metal-loproteinase， MMPs)活性。對(duì)于慢性肝纖維化的治療尚無(wú)理想藥物，目前主要用干擾素-Y、甘草甜素、秋水 仙堿、中成藥安絡(luò)化纖丸。前者屬于抗病毒治療，前兩種藥肌肉或靜脈注射，6個(gè)月 為一療程；秋水仙堿口服有療效但毒副作用較大、需連服一年；安絡(luò)化纖丸日服 12-16g、有一定療效、有一定副作用。
我們前一階段用多組分的蚯蚓粗提物-"地龍2號(hào)"進(jìn)行了抗肝纖維化試驗(yàn)Wistar 雄性大鼠每周2次皮下注射C-C14制造肝纖維化動(dòng)物模型，陽(yáng)性對(duì)照組以秋水仙堿灌 胃，試驗(yàn)組用不同劑量"地龍2號(hào)"灌胃、每日l(shuí)次，試驗(yàn)共8周。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)取大鼠 肝臟、作組織切片、HE染色、顯微鏡觀察。結(jié)果顯示"地龍2號(hào)"灌胃產(chǎn)生顯著的 抗肝纖維化效果，優(yōu)于秋水仙堿的治療效果，而且未見(jiàn)明顯毒付作用。通過(guò)免疫組化 和RT-PCR方法，對(duì)各組大鼠肝組織中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-13)與基質(zhì)金屬蛋白 酶組織抑制物(TIMP-1)的蛋白含量以及mRNA的表達(dá)進(jìn)行分析"地龍2號(hào)"治療組 MMP-13的表達(dá)明顯升高，TIMP-1的表達(dá)顯著下降，MMP-13 / TIMP-1的mRNA 表達(dá)的比值也顯著下降。同時(shí)，試驗(yàn)組肝星狀細(xì)胞的活化受到明顯的抑制。由此， 我們?cè)?jīng)推測(cè)，可能是"地龍2號(hào)"中含量較高的兩種蛋白酶一蚯蚓膠原酶、蚯蚓纖 溶酶(即衂激酶)口服產(chǎn)生的效果；同時(shí)推測(cè)，與細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分-膠原蛋白 對(duì)應(yīng)的蚯蚓膠原酶、可能是抗肝纖維化的最主要成分。這當(dāng)然只是未經(jīng)驗(yàn)證的推測(cè)， 它無(wú)法確定哪一種蛋白酶或者兩種活性物質(zhì)怎樣的配比才真正有效，更無(wú)法確定抗 肝纖維化新藥的配方與含量。本發(fā)明通過(guò)大量的后續(xù)系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推翻了前一階段 的推測(cè)。
2.人體膠原酶(MMPs)以無(wú)活性的酶原形式分泌，纖溶酶是激活人體膠原酶原
的重要因子，同時(shí)又是血清蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)通路與MMPs介導(dǎo)的通路之間的交換蛋
白酶，它能有效激活MMP-1和MMP-3 (Murphy G，Stanton H，Co麗ll S，et al.，
Mechanisms for pro matrix metalloproteinase Activation. APMIS， 1999， 107(l):38-44.)。
己知蚯蚓纖溶酶口服可進(jìn)入血流并保持纖溶酶活性，已作為口服溶血栓藥用于臨床。 但是它能否水解纖維化肝臟的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)或/和激活MMPs的酶原、從而加 速肝臟膠原蛋白的降解？尚無(wú)這方面的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明的目的在于提供一種毒副作用低、療效顯著的抗肝纖維化新藥或保
肝保健食品。在前一階段"地龍2號(hào)"抗肝纖維化試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)進(jìn)一步分離、 提純、測(cè)定以及動(dòng)物試驗(yàn)，闡明多組分的地龍?zhí)崛∥?"地龍2號(hào)"中，真正有效的 抗肝纖維化成分以及有效的口服劑量。 技術(shù)方案
蚯蟲(chóng)引纖溶酶在制備抗肝纖維化藥品或保肝保健食品中的應(yīng)用?？诜行┝繛?1000-3000尿激酶單位uku/人.日。所述蚯蚓纖溶酶包括提純的蚯蚓纖溶酶、不含 蚯蚓膠原酶的蚯蚓纖溶酶的提取物、含蚯蚓纖溶酶的多組分的蚯蚓粗提物、蚯蚓凍干 粉、蚯頓低溫干燥粉或含蚯蚓纖溶酶的復(fù)方制劑。
有益效果多組分的"地龍2號(hào)"為原料，分別提取兩種含量較高的活性物質(zhì)一虹蚓 膠原酶、蚯蚓纖溶酶，分別在體外和動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)和研究
① 膠原蛋白(I型為主)是肝纖維化-肝硬化肝臟的細(xì)胞外基質(zhì)的最主要成分。 分別提取蚯蚓膠原酶、蚯蚓纖溶酶，在體外檢測(cè)它們水解膠原蛋白的活性。
② 基質(zhì)金屬蛋白酶是細(xì)胞外基質(zhì)降解過(guò)程中最重要的一組蛋白酶，膠原酶是其 家族的主要成員之一。這組蛋白酶通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)的主要成份一膠原蛋白，對(duì)抑 制肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展起著重要作用。已知蚯蚓膠原酶至少有3個(gè)同功酶、分子量 在92KD左右，它們可特異性地降解膠原蛋白，但是口服能否進(jìn)入血流并在肝臟發(fā)揮其 生物活性？最直接、最可靠的驗(yàn)證方法是提取蚯蚓膠原酶、給肝纖維化病變過(guò)程中 的大鼠灌胃，比較觀察它對(duì)肝纖維化進(jìn)程的影響。
③ 已知赤子愛(ài)勝蚓的纖溶酶(蚓激酶)至少有6個(gè)同功酶，口服有15%左右可進(jìn) 入血流并保持生物活性，可直接、間接降解血栓的主要成份-纖維蛋白，已用于血栓病 的臨床治療。但是它們能否直接、間接降解肝細(xì)胞外基質(zhì)的膠原蛋白或/和激活肝臟 膠原蛋白酶(MMPs)的酶原？最直接、最可靠的驗(yàn)證方法依然是提取蚯蚓纖溶酶、 給肝纖維化病變過(guò)程中的大鼠灌胃，比較觀察它對(duì)肝纖維化進(jìn)程的影響。
將前一階段的試驗(yàn)材料一 "地龍2號(hào)"經(jīng)S印hadex G75凝膠層析，分離膠 原酶組分和纖溶酶組分，分別在膠原蛋白平板、(牛血)纖維蛋白平板測(cè)定各組分的 活性和含量；同時(shí)分別測(cè)定目前的試驗(yàn)材料一蚯蚓膠原酶、蚯蚓纖溶酶的活性，依據(jù) 前后數(shù)批抗肝纖維化動(dòng)物試驗(yàn)的結(jié)果，確定抗肝纖維化的有效劑量范圍。
我們?cè)?jīng)推測(cè)，可能是"地龍2號(hào)"中含量較高的兩種蛋白酶一蚯蟲(chóng)引膠原酶、蚯 蚓纖溶酶(即蚓激酶)口服產(chǎn)生的效果；理論上推測(cè)，與細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分-膠原蛋白對(duì)應(yīng)的蚯蚓膠原酶應(yīng)該是抗肝纖維化的最主要成分。這些當(dāng)然只是未經(jīng)驗(yàn)證的 推斷，基于推斷也無(wú)法確定哪一種蛋白酶或者兩種活性物質(zhì)怎樣的配比才真正有效， 更無(wú)法確定抗肝纖維化新藥的配方與含量。本發(fā)明通過(guò)大量的后續(xù)系列實(shí)驗(yàn)，取得了 意想不到的效果，推翻了前面的理論推測(cè)。試驗(yàn)結(jié)果表明(1)在體外，蚯蚓纖溶酶(蚓激酶)可以降解膠原蛋白，而且比蚯蚓膠原酶和膠原酶 標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma I型)表現(xiàn)更高的生物活性。用蚯蚓纖溶酶灌胃，可顯著減輕肝纖維 化試驗(yàn)大鼠的癥狀，顯著減輕肝纖維化增生程度，而且無(wú)明顯毒副作用。該酶多年來(lái) 被用作溶血栓藥(博洛克、普恩福)以及改善微循環(huán)的保健食品(龍舒泰精制地龍膠 囊)，實(shí)踐證明它口服安全、無(wú)明顯毒副作用，因此它更可能成為一種理想的抗肝纖 維化新藥或保肝保健食品。(2) 蚯弼l膠原酶，口服抗大鼠肝纖維化效果不顯著，在抗肝纖維化新藥或保肝保健食 品生產(chǎn)過(guò)程中可將該組分分離出來(lái)另作它用。(3) 蚯頓纖溶酶口服抗肝纖維化的有效劑量為1000-3000uku/人.日。 四

圖l.地龍2號(hào)及其膠原酶組分和纖溶酶組分的蛋白酶活性左圖(L)為(牛血)纖維蛋白平板，右圖(R)為膠原蛋白(Sigma I型)平板；酶液10u l注入小孔、3fC反應(yīng)8h.，考馬斯亮藍(lán)染色、7%冰乙酸脫色。L-1.地龍2號(hào)可水解纖維蛋白；L-2.地龍2號(hào)的膠原酶組分不能水解纖維蛋白； L-3.地龍2號(hào)的纖溶酶組分可水解纖維蛋白。R-l.地龍2號(hào)可水解膠原蛋白；R-2.地龍2號(hào)的膠原酶組分可水解膠原蛋白；R-3.地龍2號(hào)的纖維蛋白組分具有較高的水解纖維蛋白的活性。 圖2.在膠原蛋白平板測(cè)定蚯蚓膠原酶和纖溶酶的活性l一3 :膠原酶標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma I型)1000u/ml 、 2000u/ml、 4000u/ml;4一6 :蚯蚓纖溶酶的膠原酶活性^1500u/mg;7—12 :地龍2號(hào)的膠原酶組分和蚯頓膠原酶， 后者的膠原酶活性在450u/mg左右。 圖3.在纖維蛋白平板測(cè)定蚯蚓膠原酶和纖溶酶的活性l一3 :尿、激酶標(biāo)準(zhǔn)品50uku/ml、 100uku/ml、 200uku/ml;4 :膠原酶標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma I型、2000u/ml)不能溶解(牛血)纖維蛋白；5_6 :蚯蚓膠原酶也不能溶解(牛血)纖維蛋白；7—12 :地龍2號(hào)的纖溶酶組分和蚯蚓纖溶酶， 后者的纖溶活性在200uku/mg左右。 圖4.抗肝纖維化試驗(yàn)大鼠肝組織切片 HE染色X2001. 正常對(duì)照組肝細(xì)胞排列整齊，無(wú)變性壞死，無(wú)纖維結(jié)締組織增生。2. 模型組肝細(xì)胞排列紊亂，部分肝細(xì)胞呈嗜酸性變，纖維結(jié)締組織增生明顯，有假小葉形成，纖維間隔寬，局部尚見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。3. 秋水仙堿組肝細(xì)胞排列尚整齊，見(jiàn)細(xì)胞水腫和脂肪變性，纖維結(jié)締組織增生并形成間隔，但間隔較細(xì)。4. 蚯頓纖溶酶組肝細(xì)胞排列整齊，見(jiàn)輕度脂肪變性，纖維結(jié)締組織增生不甚明顯。6五具體實(shí)施方式
1.測(cè)定"地龍2號(hào)"及其中纖溶酶與膠原酶組分的活性稱(chēng)取"地龍2號(hào)"溶于0.01mol/L pH 7.2 Tris-HCl成10%溶液，Sephadex G75 凝膠層析柱用相同Tris-HCl緩沖液平衡，分批上樣，相同緩沖液洗脫，分別收集、合 并洗脫i峰、洗脫n峰，分別計(jì)量洗脫液體積，作如下測(cè)定① 參照蚓激酶生物活性測(cè)定方法(郝蘇麗，沈佳等，蚓激酶生物活性測(cè)定方法的研究，中國(guó)藥事[J].1996,10(6):403-405)制備纖維蛋白-瓊脂糖平板。平板置室溫l 小時(shí)，打孔、每孔點(diǎn)樣1(HU 、 37QC孵育8 h ,小心取出平板，考馬斯亮藍(lán)染色，7%冰乙酸脫色,纖維蛋白被降解的部位不被著色。實(shí)驗(yàn)證明多組分的"地龍2號(hào)"溶液、可以溶解(牛血)纖維蛋白；"地龍2號(hào)" 溶液通過(guò)凝膠層析，蚯蚓膠原酶(MW92KD左右)所在的洗脫I峰不能溶解纖維蛋白； 蚯蚓纖溶酶(MW25-45KD)所在的洗脫II峰仍溶解纖維蛋白。(圖1-L)進(jìn)而用國(guó)際通用的測(cè)定尿激酶的纖維蛋白平板法、以尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋為參 照，按下面(五-2-④)的方法分別測(cè)定兩個(gè)組分的纖溶酶活性、計(jì)算"地龍2號(hào)"中纖 溶酶含量。(圖3)② 參照蚓激酶生物活性測(cè)定法制備膠原蛋白平板。先將膠原蛋白(Sigmal型) 溶于少量0.5mol/LHAC，待水浴溶化的瓊脂糖凝固前、兩者按比例混合均勻并澆平 板。平板含膠原蛋白0.25%、瓊脂糖1%，置室溫1小時(shí)，打孔、每孔點(diǎn)樣10^1 、 37^孵育8小時(shí)，小心取出膠原蛋白平板、考馬斯亮藍(lán)染色、7%冰乙酸脫 色，膠原蛋白被降解的部位不被著色。實(shí)驗(yàn)證明，多組分的"地龍2號(hào)"溶液、可以溶解膠原蛋白；"地龍2號(hào)"溶液通 過(guò)凝膠層析，蚯蚓膠原酶所在的洗脫I峰能溶解膠原蛋白；蚯蚓纖溶酶所在的洗脫II 峰也能溶解膠原蛋白而且溶解圈大于前者，盡管II峰在280nm的OD值比I峰低。(圖1. R-3 )進(jìn)而在膠原蛋白平板、以膠原酶標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma I型)倍比稀釋為參照，按下面 (五-2-③)的方法分別測(cè)定兩個(gè)組分的膠原酶活性、計(jì)算"地龍2號(hào)"中膠原酶的含 量。(圖2)2. 提取蚯蚓纖溶酶、蚯蚓膠原酶并測(cè)定蛋白酶活性①制備蚯蚓纖溶酶"地龍2號(hào)，，溶于0.01mol/L pH7.2 Tris-HCl成10%溶 液，通過(guò)SephadexG75凝膠層析，分別收集、合并洗脫I峰、II峰。洗脫II峰過(guò) DEAE-CelMose柱0.01mol/LpH7.2 Tris-HCl洗滌，0.3-0.6mol/LNaCl溶液梯度洗脫，合并纖溶酶活性洗脫峰，透析、濃縮、凍干，得蚯蚓纖溶酶。② 制備蚯蚓膠原酶稱(chēng)取I型膠原蛋白(粉末)加入0.01mol/L pH7.2 Tris-HCl 成10%溶液，緩緩攪拌2h,使充分溶脹(不會(huì)溶解)，1500g、 4QC、離心15分、棄上 清，加少許Tris-HCl緩沖液攪拌、得膠原蛋白懸浮液。加入上一項(xiàng)(四-2-①)制備 的洗脫I峰，4GC攪拌吸附0.5h ， 1500g、 4QC、離心、棄上清；加Tris-HCl緩沖液 40c攪拌、洗滌沉淀，離心收集沉淀。加入沉淀物體積2倍的lmol/LNaCl、 4QC攪拌 15分鐘、解吸附；4QC、 4000g、離心20分、收集上清，透析、濃縮、凍干，得蚯蚓 膠原酶。③ 測(cè)定蚯蚓纖溶酶、蚯蚓膠原酶的膠原酶活性用上述(四-l-②)的方法制備 膠原蛋白平板，打孔，以I型膠原酶標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma 125u/mg)倍比稀釋為參照，每 孔點(diǎn)樣l(HU , 37^孵育8小時(shí)。考馬斯亮藍(lán)染色、7%冰醋酸脫色，測(cè)量水解圈直 徑，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)的對(duì)數(shù)與水解圈面積(兩個(gè)垂直直徑的乘積)的回歸方程，計(jì)算 待測(cè)樣品的膠原酶效價(jià)。測(cè)定結(jié)果顯示蚯蚓膠原酶凍干粉的膠原酶效價(jià)， 一般在450u/mg左右，遠(yuǎn)高于 Sigma標(biāo)準(zhǔn)品的125u/mg與200u/mg，比精制前"地龍2號(hào)"的膠原酶效價(jià)提高5倍 以上。蚯蚓纖溶酶凍干粉的膠原酶效價(jià)，普遍高達(dá)1500u/mg或以上， 一般為同批制 備的蚯蚓膠溶酶效價(jià)的4倍左右。(圖2) 測(cè)定蚯躬l纖溶酶、膠原酶的纖溶酶活性利用國(guó)際通用的測(cè)定尿激酶的纖維 蛋白平板法，測(cè)定兩種蛋白酶的纖溶活性(牛血)纖維蛋白原溶解于0.1mol/L pH7.2 PBS，加入適量溶于PBS的凝血酶，迅速混勻，澆注平板，纖維蛋白的終末濃度0.5%。 待充分凝固后，以尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋為參照，在平板表面點(diǎn)樣，每樣10p 1 ， 37QC 孵育8小時(shí)，測(cè)量尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品與待測(cè)樣品的溶解窩直徑。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)的對(duì)數(shù)與 溶解窩面積(兩個(gè)垂直直徑的乘積)的回歸方程，計(jì)算待測(cè)樣品的纖溶酶效價(jià)。測(cè)定結(jié)果顯示尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品與蚯蚓纖溶酶均在纖維蛋白平板形成溶解窩。蚯蚓 纖溶酶的纖溶活性穩(wěn)定在200uku/mg左右(尿激酶單位、相當(dāng)蚓激酶單位20萬(wàn)u/mg)， 比精制前"地龍2號(hào)"的纖溶酶效價(jià)提高10倍左右。膠原酶標(biāo)準(zhǔn)品(Sigmal型)和 蚯頓膠原酶在纖維蛋白平板均不能形成溶解窩，即兩者都不具備降解纖維蛋白的活 性。(圖3 )3.抑制大鼠實(shí)驗(yàn)性肝纖維化試驗(yàn) (1)材料與方法①材料i雄性Wistar大鼠體重160士10g、共38只。ii 75% CCU-花生油混合液，40。/。CCl4-花生油混合液。iii秋水仙堿(昆明制藥有限公司)、lmg/片、單蒸水配置。iv蚯蚓膠原酶，按上述(五-2-②)方法制備、440u/mg，臨用時(shí)單蒸水配制。v蚯頓纖溶酶，按上述(五-2-①)方法制備、185uku/mg，臨用時(shí)單蒸水配置。② 試驗(yàn)動(dòng)物分組i模型組7只，首次背部皮下注射75。/。CC14-花生油混合液0.5ml/100g、以后注射 40% CC14-花生油0.2ml/100g、 2次/周；每日單蒸水灌胃10ml/Kg、 l次/日、 共8周。ii陰性對(duì)照組7只，背部皮下注射花生油，每日單蒸水灌胃，劑量、方法同模型組， 共8周。iii陽(yáng)性對(duì)照組8只，秋水仙堿灌胃0.1mg/kg、 l次/日，其余同模型組。 iv蚯蚓膠原酶組8只，蚯蚓膠原酶灌胃2000u/Kg、 l次/日，其余同模型組。 v蚯躬l纖溶酶組8只，蚯蚓纖溶酶灌胃200uku/Kg、 l次/日，其余同模型組。③ 肝臟組織切片各組試驗(yàn)大鼠于第8周末處死，取相同部位的肝臟組織塊、10%中性緩沖福 爾馬林液中固定，隨機(jī)編號(hào)，送醫(yī)院病理科石蠟包埋、切片、HE染色、顯微鏡觀察 并進(jìn)行肝纖維化程度分級(jí)。
肝臟纖維化程度判斷-無(wú)成纖維細(xì)胞增生；+小葉內(nèi)偶見(jiàn)細(xì)纖維間隔、匯管區(qū)擴(kuò)大無(wú)隔；++小 葉內(nèi)易見(jiàn)細(xì)纖維間隔、匯管區(qū)擴(kuò)大有隔；+++假小葉形成、間隔致密較寬；++++ 假小葉明顯、纖維間隔較寬、大于半個(gè)高倍視野。統(tǒng)計(jì)資料用秩和檢驗(yàn)。 (2)試驗(yàn)結(jié)果① 動(dòng)物體況i陰性對(duì)照組大鼠生長(zhǎng)發(fā)育良好，活潑好動(dòng)。ii模型組大鼠生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，消瘦，皮毛松弛、毛色黯淡，精神差、活動(dòng)少。 iii蚯頓纖溶酶組大鼠健康狀況相對(duì)良好，皮毛柔順有光澤，灌胃時(shí)動(dòng)物表現(xiàn)較兇 猛。iv陽(yáng)性組(秋水仙堿組)界于模型組與蚯蚓纖溶酶組之間。 V蚯蚓膠原酶組界于模型組與秋水仙堿組之間。② 大體標(biāo)本觀察模型組肝臟表面光亮度下降，顏色灰暗，邊緣不規(guī)則，質(zhì)脆，表面可見(jiàn)粗細(xì)不 等的結(jié)節(jié)。蚯蚓纖溶酶組肝組織紅潤(rùn)，呈花斑狀，柔軟，未見(jiàn)結(jié)節(jié)。 陽(yáng)性組(秋水仙堿組)界于模型組與蚯蚓纖溶酶組之間。 蚯蚓膠原酶組界于模型組與秋水仙堿組之間。 ③顯微鏡檢査(表l、圖4)1. 正常對(duì)照組肝細(xì)胞排列整齊，無(wú)變性壞死，無(wú)纖維結(jié)締組織增生。2. 模型組肝細(xì)胞排列紊亂，部分肝細(xì)胞呈嗜酸性變，纖維結(jié)締組織增生明顯，有假小葉形成，纖維間隔寬，局部尚見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。3. 秋水仙堿組肝細(xì)胞排列尚整齊，見(jiàn)細(xì)胞水腫和脂肪變性， 纖維結(jié)締組織增生并形成間隔，但間隔較細(xì)。4. 蚯弼l纖溶酶組肝細(xì)胞排列整齊，見(jiàn)輕度脂肪變性，纖維結(jié)締組織增生不甚明顯。5. 蚯蚓膠原酶組肝纖維化病變程度介于模型組與秋水仙堿組之間。 表l各組大鼠肝纖維化增生程度的分級(jí)肝纖維化增生程度分級(jí)組 另u齊U 量例數(shù)_+++陰性對(duì)照組花生油皮下注射 共8周770000模型組CC14-花生油皮下注射 共8周700232陽(yáng)性對(duì)照aCC14-花生油皮下注射 灌秋水仙堿0.1mg/Kg/d802231蚯蚓膠原酶bCC14-花生油皮下注射 灌膠原酶2000u./Kg/d801232蚯弼l纖溶酶eCC14-花生油皮下注射 灌纖溶酶250uku/Kg/d.813310a.與模型組相比p<0. 05 ; b.與模型組相比p>0. 05 ;c.與模型組相比p〈0.01 ，與陽(yáng)性對(duì)照組相比p〈0.05。 (3)試驗(yàn)小結(jié)① 蚯蝴纖溶酶口服可顯著減輕實(shí)驗(yàn)性肝纖維化動(dòng)物的癥狀，有效抑制肝臟纖維結(jié)締組織增生，效果比秋水仙堿組更顯著；② 蚯頓纖溶酶口服對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物未產(chǎn)生明顯毒副作用；③ 在大鼠蚯蚓纖溶酶灌胃劑量200uku/kg左右(相當(dāng)1920uku/人.日)產(chǎn)生上述較理想的抗肝纖維化效果； 口服蚯弼l膠原酶抗肝纖維化效果不顯著。
權(quán)利要求
1、蚯蚓纖溶酶在制備抗肝纖維化藥品或保肝保健食品中的應(yīng)用。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述蚯蚓纖溶酶在制備抗肝纖維化藥品或保健食品中的應(yīng)用，其特征在于，口服有效劑量為1000-3000尿激酶單位uku/人.日。
3、 權(quán)利要求1或2所述蚯蚓纖溶酶包括提純的蚯蚓纖溶酶、不含蚯蚓膠原酶的蚯蚓纖溶酶的提取物、含蚯蚓纖溶酶的多組分的蚯蚓粗提物、蚯蚓凍干粉、蚯蚓低溫干燥粉或含蚯蚓纖溶酶的復(fù)方制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及蚯蚓纖溶酶在制備抗肝纖維化藥品或保肝保健食品中的應(yīng)用。屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。蚯蚓纖溶酶口服抗肝纖維化的有效劑量為1000-3000尿激酶單位/人.日。試驗(yàn)證明，蚯蚓膠原酶可降解膠原蛋白但它不能降解(牛血)纖維蛋白；蚯蚓纖溶酶可降解(牛血)纖維蛋白，更可降解膠原蛋白，活性高于蚯蚓膠原酶與膠原酶標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma I型)。在大鼠進(jìn)行的抗肝纖維化實(shí)驗(yàn)證明，口服蚯蚓纖溶酶抗肝纖維化效果顯著而且無(wú)明顯毒副作用，但口服蚯蚓膠原酶抗肝纖維化效果不顯著。
文檔編號(hào)A61K38/48GK101628113SQ20091018433
公開(kāi)日2010年1月20日 申請(qǐng)日期2009年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月18日
發(fā)明者張曉蓉, 張治國(guó), 連桂芳 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)