專利名稱：一種鱉甲抗肝纖維化提取物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種鱉甲抗肝纖維化有效物質(zhì)的的提取制備方法，具體是涉及一 種鱉甲中能顯著抑制肝星狀細(xì)胞(HSC)活化增殖及膠原合成、發(fā)揮防治肝纖維化作用的活 性部位的提取制備方法。
背景技術(shù)：
肝纖維化是各種原因引起的一系列損傷_修復(fù)、導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成與降 解失衡、合成沉積遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過降解吸收、以及構(gòu)成成分比例明顯改變的結(jié)果，大量ECM沉積于 肝小葉內(nèi)并逐漸形成纖維間隔，嚴(yán)重破壞了肝組織的正常結(jié)構(gòu)和功能，可致肝竇毛細(xì)血管 化，血流障礙，門脈高壓。肝纖維化是各種慢性肝病的共同病理學(xué)基礎(chǔ)，也是誘發(fā)肝硬化和 肝癌的必經(jīng)途徑。肝纖維化治療主要包括去除病因與抗纖維化治療。公認(rèn)徹底驅(qū)除原發(fā) 病因后，肝纖維化仍可繼續(xù)進(jìn)展，機(jī)理為活化的肝星狀細(xì)胞通過自分泌或旁分泌再次激活 HSC，是故有效的抗纖維化治療成為控制慢性肝病進(jìn)展和預(yù)防肝硬化肝癌、改善預(yù)后不可或 缺的重要環(huán)節(jié)?；蛑委熝芯咳〉幂^大進(jìn)展，目前存在的主要問題有基因?qū)氲陌邢蛐?、?達(dá)效率、可調(diào)控性及安全性尚未完全解決，真正應(yīng)用于臨床還待時(shí)日；目前部分用治肝纖維 化的化學(xué)藥和生物藥存在一些毒副反應(yīng)；許多以鱉甲為君藥組方的復(fù)方制劑如復(fù)方鱉甲軟 肝片、鱉甲抗纖方、鱉甲煎丸等，抗肝纖維化療效較好，但存在藥效物質(zhì)基礎(chǔ)不明確、質(zhì)量控 制標(biāo)準(zhǔn)不完善、藥物療效不穩(wěn)定、臨床服用劑量過大、價(jià)格較昂貴等弊端，難以滿足廣大患 者尤其是農(nóng)村和貧困地區(qū)患者的需求，據(jù)統(tǒng)計(jì)我國約1. 3億人患有肝病，占總?cè)丝诘?0%， 針對國情，亟待開發(fā)價(jià)廉、有效且毒副作用小的抗肝纖維化藥物。 鱉甲為常用傳統(tǒng)中藥，源于鱉科動物鱉(Trionyx sinensis Wiegmann)的背甲，具 有滋陰潛陽、軟堅(jiān)散結(jié)、退熱除蒸等功效；主治陰虛發(fā)熱、勞熱骨蒸、虛風(fēng)內(nèi)動、癥瘕、久瘧瘧 母等病癥。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，而提供一種鱉甲抗肝纖維化提取物
的制備方法，尤其是一種鱉甲抗肝纖維化有效物質(zhì)的制備方法，并鑒定了鱉甲抗肝纖維化
活性部位為分子量小于6000的肽類物質(zhì)，從而為詮釋鱉甲抗肝纖維化的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提
供了科學(xué)依據(jù)，并為將鱉甲研究開發(fā)成高科技含量抗肝纖維化藥物奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。 本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案來完成的； —種抗肝纖維化的鱉甲提取物的提取方法，該方法包括 (1)稱取常規(guī)研磨的鱉甲粉50 100重量份，加蒸餾水200 300重量份，超聲提 取5 30分鐘，抽濾，濾渣再加蒸餾水50 300重量份，超聲提取5 15分鐘，抽濾；合并 兩次產(chǎn)生的濾液，冷凍干燥后得凍干粉； (2)用加蒸餾水50 300重量份溶解上述的凍干粉，將水溶液裝于半透膜 (3. 500A)內(nèi)，置100 150重量份蒸餾水中透析1 10小時(shí)，溫度為2 l(TC;同法再透析一次，合并兩次膜外透析液，真空冷凍干燥，收集A型凍干粉0. 2 10重量份。
本發(fā)明取上述膜內(nèi)液體，將膜袋置50 100重量份蒸餾水中透析1 6小時(shí)，溫度為2 l(TC ;同法透析三次，棄去膜外透析液，將膜內(nèi)液體真空冷凍干燥，收集B型凍干粉O. 5 10重量份。 A型凍干粉為分子量小于6000的物質(zhì)，即鱉甲粗多肽成品；B型凍干粉為分子量大于6000的物質(zhì)。 本發(fā)明項(xiàng)目的藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，分子量小于6000的鱉甲多肽類物質(zhì)及其分離組分，能明顯抑制肝星狀細(xì)胞增殖，顯著下調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子！^(TGF-e》剌激的LX-1細(xì)胞I、 III型膠原、a-肌動球蛋白(a-SMA)蛋白表達(dá)，呈現(xiàn)量效關(guān)系，在較高實(shí)驗(yàn)濃度時(shí)作用顯著強(qiáng)于公認(rèn)有效的抗肝纖維化藥物/細(xì)胞因子Y-干憂素(IFN-Y)。表明鱉甲活性物質(zhì)抗肝纖維化作用可能是通過阻斷TGF-13工在HSC內(nèi)的Smad、MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，阻止HSC向肌成纖維細(xì)胞(MFB)轉(zhuǎn)化，使I、III型膠原等基因表達(dá)明顯下調(diào)，減少膠原合成分泌與促進(jìn)膠原降解，達(dá)到抗肝纖維化目的。 本發(fā)明項(xiàng)目通過多學(xué)科交叉的研究方法，應(yīng)用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)，對鱉甲抗肝纖維化的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究。采用膜分離技術(shù)和生化藥理學(xué)結(jié)合的研究方法，篩選出甲提取物分子量小于6000的物質(zhì)具有生物活性，從而確定了鱉甲抗肝纖維化的皿 。簡言之，本發(fā)明項(xiàng)目確定了鱉甲抗肝纖維化li&M^為分子量小于6000的多肽類物質(zhì)，從而詮釋了鱉甲抗肝纖維化的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)；結(jié)合本課題組同期動物實(shí)驗(yàn)研究確定的鱉甲抗肝纖維化藥效學(xué)的有效性，為藥食同源的傳統(tǒng)中藥鱉甲用于臨床治療肝纖維化疾患提供了科學(xué)依據(jù)，并進(jìn)一步為將鱉甲研發(fā)成中藥保健食品和中藥新制劑奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
具體實(shí)施例方式
以下通過實(shí)例來進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明。本發(fā)明所述的抗肝纖維化的鱉甲提取物的提取方法，該方法包括 (1)稱取常規(guī)研磨的鱉甲粉50 100重量份，加蒸餾水200 300重量份，超聲提取5 30分鐘，抽濾，濾渣再加蒸餾水50 300重量份，超聲提取5 15分鐘，抽濾；合并兩次產(chǎn)生的濾液，冷凍干燥后得凍干粉； (2)用加蒸餾水50 300重量份溶解上述的凍干粉，將水溶液裝于3. 500A的半透膜內(nèi)，置100 150重量份蒸餾水中透析1 10小時(shí)，溫度為2 l(TC ;同法再透析一次，合并兩次膜外透析液，真空冷凍干燥，收集A型凍干粉0. 2 10重量份。
本發(fā)明取上述膜內(nèi)液體，將膜袋置50 100重量份蒸餾水中透析1 6小時(shí)，溫度為2 l(TC ;同法透析三次，棄去膜外透析液，將膜內(nèi)液體真空冷凍干燥，收集B型凍干粉O. 5 10重量份。 A型凍干粉為分子量小于6000的物質(zhì)，即鱉甲粗多肽成品；B型凍干粉為分子量大于6000的物質(zhì)。
實(shí)施例1 —種抗肝纖維化的鱉甲提取物的制備步驟 (1)稱取鱉甲粉100g，加蒸餾水200ml，超聲提取二十分鐘，抽濾，濾渣再加蒸餾水100ml，超聲提取十分鐘，抽濾；合并兩次濾液，冷凍干燥，得凍干粉；
(2)加蒸餾水10ml溶解上述制得的凍干粉，將水溶液裝于3. 500A的半透膜內(nèi)，截留分子量6000，置100ml蒸餾水中透析五小時(shí)(4t:，5min搖一次)；同法再透析一次，合并兩次膜外透析液，真空冷凍干燥，收集A型0. 4g凍干粉。 (3)取膜內(nèi)液體，將膜袋置500ml蒸餾水中透析三小時(shí)(4。C，磁力攪拌)；同法透析三次，棄去膜外透析液，將膜內(nèi)液體真空冷凍干燥，收集B型3. 2g凍干粉。
A型凍干粉為分子量小于6000的物質(zhì)(鱉甲粗多肽成品)，B型凍干粉為分子量大于6000的物質(zhì)。 本發(fā)明的其它實(shí)施例可以通過前述的技術(shù)方案中所公開的配比范圍，以及溫度等范圍的選擇得到多種實(shí)施例，因這種選擇對本領(lǐng)域技術(shù)人員是容易的，為此不作更具體的描述。 本發(fā)明提取分離得到的分子量小于6000的肽類物質(zhì)具有顯著的抑制肝星狀細(xì)胞活化增殖及膠原合成的生物活性，因此可以確定為鱉甲抗肝纖維化的有效部位物質(zhì)，詳見下述試驗(yàn)。 實(shí)施試驗(yàn)例1 :鱉甲提取物分子量小于6000的肽類物質(zhì)對HSC-Te細(xì)胞增殖的影響
1.材料與方法 細(xì)胞系肝星狀細(xì)胞系HSC-T6購自上海中醫(yī)藥大學(xué)肝病研究所，為SV40轉(zhuǎn)染的Sprague-Dauley大鼠肝星狀細(xì)胞，其表現(xiàn)型為活化的HSC，表達(dá)高水平的I型膠原、TMP-lmRNA等。 主要試劑細(xì)胞培養(yǎng)試劑羥乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、胰蛋白酶(trypsin)、L-谷氨酰胺等(美國Sigma公司)，DMEM培養(yǎng)基(高糖、低糖)(美國GIBCO公司)，小牛血清(fetal calf serum， FCS)(武漢亞法生物技術(shù)公司)，青霉素、鏈霉素(華北制藥股份公司)，碳酸氫鈉(湖北化工廠)，二氧化碳(C02)(武漢無機(jī)鹽廠)。細(xì)胞增殖檢測用試劑二甲基亞砜(DMSO)、噻唑藍(lán)(MTT) (Sigma公司)。 試劑配制DMEM液1L的DMEM高糖及低糖培養(yǎng)基干粉各一包，并稱取2. 38gHEPES、2. Og NaHC03溶于2L三蒸水中，調(diào)pH為7. 2，0. 22 y m濾膜抽濾除菌，分裝置4"備用，用前加入10% FCS， 1% L-谷氨酰胺，100ii /ml青霉素，即為完全培養(yǎng)基。MTT的配制稱取MTT10mg，37。C溫浴中溶解于2ml 0. Olmol/L PBS， 4，即為5mg/ml的MTT溶液，0. 22 ii m過濾除菌，背棕色小瓶中，4t:冰箱保存。 HSC-T6的培養(yǎng)及傳代HSC-T6培養(yǎng)于37°C、5% C02的含10%胎牛血清、100 y /ml青霉素、100mg/ml鏈霉素、l^L-谷氨酰胺的DMEM(低糖與高糖比例為l : l)培養(yǎng)液中，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞長到亞單層或細(xì)胞密度約80% 90%時(shí)，是HSC-T6傳代的標(biāo)志，吸棄培養(yǎng)基，加入0. 25%胰蛋白酶4 5ml，以浸沒細(xì)胞為宜，37°C消化5 7min，待細(xì)胞回縮，瓶壁有少量細(xì)胞脫落，即用含10X小牛血清培養(yǎng)基終止，收集細(xì)胞懸液于50ml消毒離心管中，1700rpm，4t:離心7min，棄上清，加入含10%小牛血清的DMEM用吸管反復(fù)吹打、分散細(xì)胞，取10 yl細(xì)胞懸液光鏡下計(jì)數(shù)，完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度，以1X107ml傳代。
MTT比色法測定HSC_T6增殖傳代HSC_T6細(xì)胞按1 X 105的密度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加lOOii l，細(xì)胞貼壁長滿孔底12h后，換含5% FCS的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)12h，加入不同濃度的鱉甲提取物(以含5% FCS的DMEM培養(yǎng)基倍比稀釋成14. 0000mg/ml、7. OOOOmg/ml、3. 5000mg/ml、l. 7500mg/ml、0. 8750mg/ml、0. 4375mg/ml、0. 2188mg/ml、0. 1094mg/ml，0. 45iim濾膜過濾)共同培養(yǎng)48h、72h，4孔重復(fù)，另設(shè)空白對照組(含5% FCS的DMEM培養(yǎng)基)，去培養(yǎng)基(翻板)，每孔加20iUMTT溶液，pH7. 2PBS，濃度為5mg/ml，過濾除菌，置棕色小瓶中，4t:冰箱保存。孵育4h，每孔加入二甲基亞砜(匿SD)100iU，在微型混合器上振蕩2min， 10min后于酶標(biāo)儀上測定0D490值。存活率=(藥物組OD值/對照組OD值)X 100% 。抑制率=(1-藥物組OD值/對照組OD值)X 100 % 。
統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)以X±S表示，進(jìn)行方差分析和組間q檢驗(yàn)，P < 0. 05為差異具
有顯著性意義。 2.試驗(yàn)結(jié)果 鱉甲提取物分離物質(zhì)組分對肝星狀細(xì)胞(HSC-T6)增殖影響的試驗(yàn)結(jié)果表明，分子量小于6000的肽類物質(zhì)組MTT法的OD值明顯低于空白組和分子量大于6000的物質(zhì)組，中位值差異均非常顯著(P < 0. 01 0. 001)。當(dāng)大鼠肝星狀細(xì)胞系(HSC-T6)與鱉甲提取物分離物質(zhì)組分分別共同培養(yǎng)48小時(shí)和72小時(shí)，鱉甲提取物分子量大于6000的物質(zhì)組分對肝星狀細(xì)胞增殖的抑制率分別為-119. 76%和-58. 91%;分子量小于6000物質(zhì)組分的抑制率則為5.89% 68. 74% (培養(yǎng)72小時(shí)結(jié)果)，中位抑制率51. 67% 。從而確定了鱉甲提取物中分子量小于6000的物質(zhì)組分為其抗肝纖維化的有效物質(zhì)部位。
實(shí)施試驗(yàn)例2 :鱉甲提取物分子量小于6000的肽類物質(zhì)對TGF- P工剌激的LX_1細(xì)胞活化及膠原合成的影響 y-干憂素(IFN-y)是目前已知的作用最強(qiáng)的抗肝纖維化細(xì)胞因子。以往的體外及動物實(shí)驗(yàn)均證實(shí)IFN-y可有效地改善日本血吸蟲、四氯化碳、二甲基亞硝胺等引起的肝纖維化。本實(shí)驗(yàn)通過Western blot法檢測鱉甲粗多肽成品(分子量< 6000) 、 IFN-y等各作用組、對照組對TGF-I3 :剌激的LX-1細(xì)胞I、III型膠原和a -SMA表達(dá)的影響，探討鱉甲中多肽類成分抗肝纖維化的活性和作用機(jī)制。
1.材料與方法 細(xì)胞系人肝星狀細(xì)胞系LX-1由美國Mount Sinai醫(yī)學(xué)院肝病科Friedman SL教
授惠贈。 主要試劑IFN-y、 TGF-I^(美國R&D公司)，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Hyclone公司)，P-肌動蛋白(P-actin)多克隆抗體、羊抗III型膠原多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，小鼠抗a -SMA和I型膠原單克隆抗體(美國Sigma Aldrich公司)，IgG-HRP羊抗兔、兔抗羊和抗小鼠第二抗體(美國Santa Cruz公司)，SDS-PAGE蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜試劑，Western-blot試劑，PVDF膜，ECL顯色劑，Re-blot洗膜試劑。
LX-1細(xì)胞的培養(yǎng)按文獻(xiàn)的方法培養(yǎng)LX-1細(xì)胞系，于37t:、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)5% C02條件下，含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。 膜透析法提取分離鱉甲分子量小于6000的肽類物質(zhì)的制備方法同"發(fā)明內(nèi)容"項(xiàng)下"l. (1)、 (2)"。 藥物處理、Western-blot法檢測將LX-1按1 X 106接種于10cm的培養(yǎng)皿，待細(xì)胞貼壁，加入含不同濃度藥物的培養(yǎng)基(2XFCS-DMEM，培養(yǎng)時(shí)間48h)預(yù)處理2h后，加入800pg/ml重組TGF-13 p37。C、5X C02培養(yǎng)72h。加200iil/dish的細(xì)胞裂解液，用機(jī)械法收集細(xì)胞，冰浴30min， 10000rpm離心10min，收集上清液用BCA protein assay試劑盒進(jìn)行總蛋白定量。取40ug蛋白加上樣緩沖液煮沸10min變性，進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)移至醋酸纖維素膜，5X脫脂奶粉室溫封閉2h，加入相應(yīng)的一抗(Santa Cruz)分別以封閉液適當(dāng)稀釋，將PVDF膜浸泡其中，搖床緩慢4t:反應(yīng)過夜；洗膜4次每次10min，加辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(1 : 2000， Santa Cruz)，室溫反應(yīng)2h ;洗膜5次后ECL化學(xué)發(fā)光顯色、曝光，膠片作激光密度掃描，結(jié)果以I型膠原、III型膠原、a-SMA與對應(yīng)的P-肌動蛋白(Actin)的密度積分比值來表示蛋白的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)以Actin為內(nèi)參照，作空白對照、TGF-13 i剌激對照和hIFN- y對照。
統(tǒng)計(jì)學(xué)方法同"實(shí)施試驗(yàn)例1"項(xiàng)下"1."。
2.試驗(yàn)結(jié)果 Western blot法檢測鱉甲粗多肽成品對TGF_ P i剌激的LX_1細(xì)胞活化及膠原合成影響的試驗(yàn)結(jié)果顯示TGF-P !剌激組LX-1細(xì)胞Col I、 Col III、 a -SMA表達(dá)顯著高于空白對照組(P < 0. 01) ;LX-1細(xì)胞IFN-y及鱉甲粗多肽成品10、5、lmg/ml作用組三種蛋白表達(dá)顯著低于TGF-P工剌激對照組(P < 0. 01);鱉甲粗多肽成品10、5mg/ml組三種蛋白表達(dá)顯著低于IFN-y作用組(P < 0. 05);鱉甲粗多肽成品10mg/ml組三種蛋白表達(dá)顯著低于空白對照組(P < 0. 05);鱉甲粗多肽抑制TGF-P i剌激的LX-1細(xì)胞Col I、 Col III、a -SMA蛋白表達(dá)在實(shí)驗(yàn)濃度范圍呈現(xiàn)量效依賴關(guān)系。 采用Western blot法，以目前抗肝纖維化作用最強(qiáng)的藥物IFN_ Y作為對照，檢測鱉甲提取物中分子量小于6000的肽類物質(zhì)對TGF-P i剌激的LX-1細(xì)胞I、 III型膠原和a-SMA蛋白表達(dá)的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，鱉甲提取物分子量小于6000的肽類物質(zhì)能有效抑制肝星狀細(xì)胞激活及膠原合成，從而阻抑肝纖維化的發(fā)展，其抑制效果呈現(xiàn)量效關(guān)系，高中劑量的抑制效果明顯優(yōu)于對照藥物IFN-y ，從而進(jìn)一步確定了鱉甲提取物分子量小于6000的肽類化合物為其抗肝纖維化的有效物質(zhì)部位。
權(quán)利要求
一種鱉甲抗肝纖維化提取物的制備方法，其特征在于該方法包括(1)稱取常規(guī)研磨的鱉甲粉50---100重量份，加蒸餾水100-300b量份，超聲提取5--30分鐘，抽濾，濾渣再加蒸餾水100-300重量份，超聲提取5--15分鐘，抽濾；合并兩次產(chǎn)生的濾液，冷凍干燥后得凍干粉；(2)用加蒸餾水0.1-5重量份溶解上述制得的凍干粉，將水溶液裝于的半透膜內(nèi)，置100-150重量份蒸餾水中透析1--10小時(shí)，溫度為2-10℃；同法再透析一次，合并兩次膜外透析液，真空冷凍干燥，收集A型凍干粉0.1-1.0重量份。F2009101547927C0000011.tif
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的鱉甲抗肝纖維化提取物的制備方法，其特征在于取上述膜內(nèi)液體，將膜袋置50-100重量份蒸餾水中透析l一6小時(shí)，溫度為2-10°C ;同法透析三次，棄去膜外透析液，將膜內(nèi)液體真空冷凍干燥，收集B型凍干粉0. 5-10重量份。
全文摘要
一種鱉甲抗肝纖維化提取物的制備方法，該方法包括(1)稱取常規(guī)研磨的鱉甲粉50---100重量份，加蒸餾水100-300重量份，超聲提取5--30分鐘，抽濾，濾渣再加蒸餾水100-300重量份，超聲提取5--15分鐘，抽濾；合并兩次產(chǎn)生的濾液，冷凍干燥后得凍干粉；(2)用加蒸餾水0.1-5重量份溶解上述制得的凍干粉，將水溶液裝于的半透膜內(nèi)，置100-150重量份蒸餾水中透析1--10小時(shí)，溫度為2-10℃；同法再透析一次，合并兩次膜外透析液，真空冷凍干燥，收集A型凍干粉0.1-1.0重量份；本發(fā)明確定了鱉甲抗肝纖維化活性部位為分子量小于6000的多肽類物質(zhì)，從而為詮釋鱉甲抗肝纖維化的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了科學(xué)依據(jù)，為將鱉甲提取物的活性肽類物質(zhì)開發(fā)成高科技含量抗肝纖維化藥物和保健食品奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
文檔編號A61K35/56GK101708189SQ20091015479
公開日2010年5月19日 申請日期2009年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月8日
發(fā)明者劉焱文, 張赤志, 邵志華, 高建蓉 申請人:浙江衢化醫(yī)院;湖北中醫(yī)學(xué)院;巨化集團(tuán)公司