利用發(fā)酵和催化相結(jié)合的方法制備己二酸和己二酸鹽的替代合成路徑的制作方法
【專利說(shuō)明】利用發(fā)酵和催化相結(jié)合的方法制備己二酸和己二酸鹽的替 代合成路徑
[0001] 序列表
[0002] 本申請(qǐng)包含序列表，已通過(guò)EFS-Web提交了 ASCII格式文本，并通過(guò)整體引用的方 式包含于本申請(qǐng)中。所述ASCII副本，創(chuàng)制于2013年9月10日，名稱為DNP-10-1205W0_ SL. txt，文件大小為9164字節(jié)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本申請(qǐng)涉及制備己二酸鹽和己二酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0004] 目前，許多含碳的化學(xué)物質(zhì)都源自于石油資源。依賴于石油資源的化學(xué)原料導(dǎo)致 石油資源的枯竭以及與石油鉆探相關(guān)的不良環(huán)境影響。
[0005] 通過(guò)糖發(fā)酵獲得的某些碳質(zhì)產(chǎn)品有望替代源于石油的化學(xué)原料，用于制造含碳的 化學(xué)物質(zhì)。上述碳質(zhì)產(chǎn)品包括己二酸和己二酸鹽。
[0006] 在目前石油源化學(xué)原料主導(dǎo)的工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域中，己二酸具有很大的市場(chǎng)空間，如 3-酮己二酸鹽、3-羥基己二酸鹽和己烯二酸鹽的己二酸鹽也可用作生產(chǎn)許多功能性二酸 的前體物質(zhì)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 我們提供了一種制備己二酸或己二酸鹽的方法，包括以下步驟：a)縮合α -酮戊 二酸鹽與乙酰輔酶A制得高檸檬酸鹽；b)通過(guò)至少一個(gè)化學(xué)反應(yīng)使高檸檬酸鹽轉(zhuǎn)化為己二 酸鹽或己二酸；以及c)可選地，分離己二酸鹽或己二酸。
[0008] 我們還提供了一種制備己二酸或己二酸鹽的方法，包括以下步驟：a)準(zhǔn)備高檸檬 酸鹽；b)高檸檬酸鹽脫羧基制得3-酮己二酸鹽；以及c)直接或通過(guò)選自3-羥基己二酸鹽 和己烯二酸鹽中的至少一種中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)化3-酮己二酸鹽制得己二酸或己二酸鹽。
[0009] 我們還提供了一種制備己二酸酯的方法，包括以下步驟：a)準(zhǔn)備高檸檬酸鹽；b) 高檸檬酸鹽脫羧基制得3-酮己二酸鹽；c) 3-酮己二酸鹽轉(zhuǎn)化為3-酮己二酸酯；d)直接或 通過(guò)選自3-羥基己二酸酯和己烯二酸酯中的至少一種中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)化3-酮己二酸酯制得己 二酸酯；以及e)可選地，將己二酸酯轉(zhuǎn)化為己二酸。
[0010] 我們進(jìn)一步提供了一種制備己二酸鹽或其酸的方法，包括以下步驟：a)準(zhǔn)備 高檸檬酸鹽；b)處理高檸檬酸鹽制得高檸檬酸內(nèi)酯；c)高檸檬酸內(nèi)酯脫氫制得4-羧 基-粘康酸內(nèi)酯；d) 4-羧基-粘康酸內(nèi)酯脫羧基制得5-甲酯基-丁內(nèi)酯_4_烯 (5-carbomethoxy-GBL-4_ene) ;e) 5-甲酯基-丁內(nèi)酯-4-烯互變異構(gòu)制得3-酮己二酸鹽； 以及f)可選地，將3-酮己二酸鹽轉(zhuǎn)化為己二酸鹽或己二酸。
【附圖說(shuō)明】 toon] 圖1示意性說(shuō)明由高檸檬酸鹽制備己二酸鹽和己二酸的合成路徑。
[0012] 圖2示意性說(shuō)明將高檸檬酸鹽經(jīng)高檸檬酸內(nèi)酯轉(zhuǎn)化為己二酸或己二酸鹽。
[0013] 圖3為質(zhì)粒PBA006的示意圖，該質(zhì)粒包含大腸桿菌密碼子優(yōu)化的高檸檬酸合酶 (nifV)和高異檸檬酸脫氫酶（aksF_Mm)基因。
[0014] 圖4為質(zhì)粒PBA066的示意圖，該質(zhì)粒包含大腸桿菌密碼子優(yōu)化的高檸檬酸合酶 (nifV)和高異檸檬酸脫氫酶（aksF_C5)基因。
[0015] 圖5為與對(duì)照細(xì)胞（BL21)相對(duì)比，高檸檬酸合酶在BA066原溶解產(chǎn)物中的活性結(jié) 果。
[0016] 圖6為與對(duì)照細(xì)胞（BL21)相對(duì)比，經(jīng)質(zhì)粒pBA066轉(zhuǎn)導(dǎo)的BA066細(xì)胞溶解產(chǎn)物中 不溶部分和可溶部分的SDS-PAGE電泳結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 與多步驟的生化途徑相比，結(jié)合生物學(xué)和熱化學(xué)方法制備化工原料是一種更為快 捷和經(jīng)濟(jì)的途徑。該途徑經(jīng)常能夠獲得具有商業(yè)價(jià)值的中間產(chǎn)物。上述方法可應(yīng)用于制備 己二酸、己二酸鹽和己二酸酯。例如，我們提供了一些利用高檸檬酸鹽和3-酮己二酸鹽作 為初始化合物和/或化學(xué)中間體的化學(xué)途徑和生化途徑。
[0018] 公開(kāi)的生化途徑可包括一種或多種蛋白質(zhì)或酶的活性，尤其是異源性酶，該蛋白 質(zhì)或酶可催化反應(yīng)使反應(yīng)底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)品或中間產(chǎn)物。利用本領(lǐng)域現(xiàn)有的技術(shù)可修飾微生 物使其表達(dá)一種或多種蛋白質(zhì)或酶。相應(yīng)的，我們提供了工程代謝途徑、分離核酸或工程核 酸、多肽或工程多肽、宿主細(xì)胞或基因工程宿主細(xì)胞、由碳源制得目標(biāo)化合物或中間產(chǎn)物的 方法以及原料。
[0019] 適合作為本發(fā)明生物合成途徑起始點(diǎn)的碳源包括碳水化合物和合成中間體。例如 細(xì)胞能夠代謝的碳水化合物包括糖類，如葡萄糖、葡聚糖、甘油三酯和脂肪酸。代謝途徑的 中間產(chǎn)品，如2-酮戊二酸鹽也可用作起始物。
[0020] 本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在此示例的工程路徑是相對(duì)于，但并不限于，菌種的 特定基因并包括核酸或氨基酸序列的同源染色體或同源基因。當(dāng)利用本領(lǐng)域已知方法進(jìn)行 比對(duì)時(shí)，同源染色體和同源基因序列擁有高度的序列一致性/相似性。
[0021] 本發(fā)明的方法和微生物的特征涉及"基因修飾"或重組的微生物或宿主細(xì)胞，所述 微生物或宿主細(xì)胞經(jīng)過(guò)工程改造而具有新的代謝功能或新代謝途徑。此處使用的術(shù)語(yǔ)"基 因修飾"的微生物包括具有至少一種基因改變的微生物，例如重組基因的表達(dá)，而在引用的 菌種的野生株中通常不存在這種基因改變。在一些實(shí)施例中，將基因工程微生物在代謝途 徑的關(guān)鍵點(diǎn)上進(jìn)行工程改造來(lái)表達(dá)或過(guò)度表達(dá)至少一種特定酶，和/或抑制或限制其他酶 的活性，以克服或避免代謝瓶頸。
[0022] 我們提供了基因修飾宿主細(xì)胞或微生物，以及利用其由α -酮酸制備己二酸和己 二酸鹽的方法。此處所述的"宿主細(xì)胞"是指真核細(xì)胞、原核細(xì)胞或來(lái)源于作為單細(xì)胞實(shí)體 進(jìn)行培養(yǎng)的多細(xì)胞生物（如細(xì)胞系）的細(xì)胞。所述宿主細(xì)胞可以是原核的（如細(xì)菌如大腸 桿菌或枯草芽孢桿菌）或真核的（如酵母菌、哺乳動(dòng)物或昆蟲(chóng)細(xì)胞）。例如，宿主細(xì)胞可以 是細(xì)菌細(xì)胞（如大腸桿菌，枯草芽孢桿菌，分支桿菌，結(jié)核分支桿菌，或其他合適的細(xì)菌細(xì) 胞），古生菌（例如甲烷球菌或海藻甲烷球菌或其他合適的古細(xì)胞），酵母菌細(xì)胞（例如酵 母屬菌種，如啤酒酵母、粟酒裂殖酵母、Picchia酵母，念珠菌屬如白色念珠菌，或其他合適 的酵母菌種）。優(yōu)選宿主細(xì)胞包括大腸桿菌。
[0023] 代謝工程細(xì)胞可通過(guò)向宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)入至少一種編碼包含在工程代謝途徑中 的酶的核苷酸序列來(lái)獲得。此處所述"核苷酸序列"、"核酸序列"和"遺傳結(jié)構(gòu)"可相互替 換使用，并且表示RNA或DNA的聚合體，單鏈或雙鏈，可選地包含合成的、非天然的或經(jīng)改變 的核苷酸堿基。核苷酸序列可包含一個(gè)或多個(gè)cDNA、基因組DNA、合成DNA或RNA的片段。
[0024] 在優(yōu)選實(shí)施例中，編碼代謝過(guò)程中的酶或蛋白質(zhì)的核苷酸序列是經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化 的，從而反映宿主細(xì)胞的典型的密碼子選擇而不改變通過(guò)核苷酸序列編碼的多肽。在優(yōu)選 實(shí)施例中，術(shù)語(yǔ)"密碼子優(yōu)化"或者"密碼子優(yōu)化的"是指修飾核酸序列的密碼子內(nèi)容，而不 修飾該核酸編碼的多肽序列，以增強(qiáng)在特定宿主細(xì)胞中的表達(dá)。在優(yōu)選實(shí)施例中，該術(shù)語(yǔ)旨 在包含通過(guò)修飾核酸序列的密碼子內(nèi)容的方法來(lái)控制多肽的表達(dá)水平（如提高或降低表 達(dá)水平）。
[0025] 在一些實(shí)施例中，代謝工程細(xì)胞可表達(dá)一種或多種具有酶活性的多肽,而這些酶 活性是實(shí)施下述步驟所必須的。比如，特定細(xì)胞可包含一、二、三、四、五或更多個(gè)核酸序列， 每個(gè)核酸序列都編碼相應(yīng)的多肽，這些多肽都是反應(yīng)途徑中由底物向產(chǎn)品轉(zhuǎn)化過(guò)程中所必 須的，如由α-酮戊二酸鹽或高檸檬酸鹽轉(zhuǎn)化為己二酸或己二酸鹽的反應(yīng)途徑。或者，單獨(dú) 的核酸分子可編碼一個(gè)或多個(gè)多肽。例如，單獨(dú)的核酸分子可包含能夠編碼二、三、四個(gè)或 更多不同多肽的核酸序列。
[0026] 用于在此描述的方法和微生物的核酸序列可從不同來(lái)源獲得，例如，cDNA序列的 擴(kuò)增，DNA信息庫(kù)，全程合成，和/或一個(gè)或多個(gè)基因組片段的切除。然后將從上述來(lái)源獲 得的序列利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)和/或重組DNA技術(shù)進(jìn)行修飾從而制備具有期望變異的核酸 序列。核酸序列的示例性修飾方法包括，例如，定向誘變，PCR突變形成，切除，嵌入，置換， 利用限制性內(nèi)切酶對(duì)序列進(jìn)行內(nèi)部切換，與綁定點(diǎn)選擇性結(jié)合，同源重組，位點(diǎn)特異性重組 或其不同組合。在其他實(shí)例中，核酸序列可以是合成的核酸序列。合成多核苷酸序列可通 過(guò)許多方法制得，這些方法在美國(guó)專利7, 323, 320中有詳細(xì)敘述，相關(guān)的主題以整體引用 的方式包含于本申請(qǐng)中。
[0027] 轉(zhuǎn)化細(xì)菌、植物和動(dòng)物細(xì)胞的方法是已知的。常用的細(xì)菌轉(zhuǎn)化方法包括電穿孔和 化學(xué)修飾。
[0028] 通過(guò)化學(xué)途徑，利用本領(lǐng)域已知的技術(shù)可對(duì)化學(xué)產(chǎn)品進(jìn)行分離和處理。
[0029] 在本領(lǐng)域中眾所周知，己二酸鹽能夠很容易的轉(zhuǎn)化為己二酸，反過(guò)來(lái)，己二酸也能 夠輕易的轉(zhuǎn)化為己二酸鹽。因此，可以理解，術(shù)語(yǔ)"己二酸鹽"和術(shù)語(yǔ)"己二酸"是可以替換 使用的，在此處，二者可以輕易的相互轉(zhuǎn)化或替代對(duì)方。同樣的，本申請(qǐng)中所提及的其他具 有酸和鹽形式的化合物，描述其酸和鹽形式的術(shù)語(yǔ)也是可以替換使用的。因此，例如，本領(lǐng) 域技術(shù)人員能夠理解一個(gè)反應(yīng)途徑的中間產(chǎn)物或產(chǎn)品為一種化合物的酸，則該反應(yīng)途徑也 同樣可以用于制備該化合物的鹽。
[0030] 圖1所示為由2-酮戊二酸鹽生物合成己二酸和己二酸鹽的示例性生物和/或 化學(xué)途徑。利用生物技術(shù)能夠容易的制備高檸檬酸鹽（圖1中步驟Α)。高檸檬酸合酶 (EC2. 3. 3. 14)催化化學(xué)反應(yīng)：乙酰輔酶Α+Η20+2-酮戊二酸鹽〇高檸檬酸鹽+輔酶Α。所得產(chǎn) 品，高檸檬酸鹽，也被稱為（R) -2-羥基丁烷-1，2, 4-三羧酸鹽。
[0031] 例如，高檸檬酸合酶askA可從甲烷球菌得到。甲烷球菌是一種嗜熱產(chǎn)甲烷菌，該 菌中的輔酶B途徑要求的溫度條件為50-60°C。因此，來(lái)源于甲烷球菌的酶，如高檸檬酸合 酶askA，在50-60°C左右的高溫條件下具有峰值效率。然而，也可以使用來(lái)源于在較低溫度 條件下增值的其他產(chǎn)甲烷菌的替代AksA蛋白同系物。
[0032] 在一些優(yōu)選實(shí)施例中，高檸檬酸鹽的合成可以被高檸檬酸合酶NifV或NifV 同系物所催化。NifV的同系物存在于多種生物體中，包括但不限于，棕色固氮菌， 肺炎桿菌，圓褐固氮菌，弗蘭克氏菌（strain FaCl),魚(yú)腥藻（strain PCC 7120)，巴 西固氮螺菌，巴氏梭菌，球形紅細(xì)菌，莢膜紅細(xì)菌，弗蘭克氏菌，carboxyldothermus hydrogenoformans(strain Z-2901/DSM 6008)，項(xiàng)圈藻（strain PCC 7120)，聚團(tuán)腸桿 菌，歐文氏菌亞種· Atroseptica(Pectobacterium atrosepticum)，綠硫菌，固氮弧菌屬 (strain BH72)，磁螺菌，慢生根瘤菌（strain 0RS278)，慢生根瘤菌（strain BTAi 1/ATCC BAA-1182)，克氏梭菌（strain ATCC 8527/DSM 555/NCMB 10680)，克氏梭菌（strain ATCC 8527/DSM 555/NCMB 10680)，丁酸梭菌5521，臺(tái)灣貪銅菌（strain R1/LMG 19424)，臺(tái)灣羅 爾斯通菌（strain LMG 19424)，肉毒桿菌（strain Eklund 17B/type B)，肉毒桿菌（strain Alaska E43/type E3)，聚球藻屬（strain JA-2-3B'a(2-13))(黃石B-Prime藍(lán)藻細(xì)菌），聚 球藻屬（strain JA-3-3Ab)(黃石A-Prime藍(lán)藻細(xì)菌），嗜鐵土壤細(xì)菌和運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌。 在優(yōu)選實(shí)施例中，高檸檬酸合酶為來(lái)源于棕色固氮菌的NifV，其可包含根據(jù)SEQ ID NO: 1 的氨基酸序列。
[0033] 在另一些優(yōu)選實(shí)施例中，高檸檬酸合酶為來(lái)源于棕色固氮菌的NifV，并由根據(jù)SEQ ID NO :2的核苷酸序列編碼，并經(jīng)過(guò)了在大腸桿菌中的密碼子優(yōu)化表達(dá)。在另一些實(shí)施例 中，反應(yīng)途徑的第一步驟被設(shè)計(jì)為經(jīng)高朽1檬酸合酶Lys 20或Lys 21催化。Lys 20和Lys 21是兩種與啤酒酵母中賴氨酸生物合成途徑的第一步驟相關(guān)聯(lián)的高檸檬酸合酶同工酶。 Lys 20或Lys 21同系物存在于多種生物體中，如樹(shù)干畢赤酵母和嗜熱細(xì)菌中。
[0034] 在一些實(shí)施例中，在以乙酰輔酶A和α-酮酸作為底物的反應(yīng)中，用于催化使 α-酮戊二酸轉(zhuǎn)化為高檸檬酸的酶（如EC 2.3.3)可來(lái)源于產(chǎn)甲烷古生菌。產(chǎn)甲烷古生菌 中包含三種密切相關(guān)的AksA同系物：2_異丙基蘋(píng)果酸合酶（LeuA)和能夠縮合乙酰輔酶A 和丙酮酸鹽的檸蘋(píng)酸鹽（2-甲基蘋(píng)果酸鹽）合酶（CimA)。上述酶被確認(rèn)參與了在產(chǎn)甲烷 菌及可能的缺乏蘇氨酸脫水酶的其他菌種中的異亮氨酸的生物合成過(guò)程。在一些實(shí)施例 中，?；D(zhuǎn)移酶為isopromylate合酶（如LeuA，EC 2. 3. 3. 13)或檸蘋(píng)酸合酶（如CimA，EC 2.3. 1. 182)。然后，細(xì)胞中間體，高檸檬酸鹽可經(jīng)由多種途徑轉(zhuǎn)化為己二酸鹽或己二酸，參 見(jiàn)圖1。
[0035] 如圖1所示，高檸檬酸鹽可利用不同類型的脫羧酶通過(guò)生物轉(zhuǎn)化為3-羥基己二酸 鹽（步驟B)或3-酮己二酸鹽（步驟C)。脫羧酶可從目標(biāo)底物中移除二氧化碳。事實(shí)上， 高檸檬酸鹽脫羧基經(jīng)歷了一系列的反應(yīng)。高檸檬酸鹽首先經(jīng)脫水獲得順式-高烏頭酸。順 式-高烏頭酸再水化制得蘇-異-高檸檬酸。經(jīng)過(guò)此水化/脫水反應(yīng)之后C3羥基轉(zhuǎn)移到 了 C2位。最終，蘇-異-高檸檬酸脫羧基制得終產(chǎn)物2-酮基己二酸鹽。
[0036] 然而，如圖1所示，步驟B，高檸檬酸可在脫羧酶作用下轉(zhuǎn)化為3-羥基己二酸 鹽，該脫羧酶具有從-羥基羧酸鹽中消除CO 2的活性，因此可用于催化高檸檬酸鹽轉(zhuǎn)化 為3-羥基己二酸鹽的反應(yīng)。例如，-乙酰乳酸脫羧酶（EC 4. I. 1. 5)可使乙酰乳酸脫羧 基制得乙偶姻（Goupil-Feuillerat, N ;Cocaign_Bousquet, M ;Godon, J-J ;Ehrlich, S. D ; Renault, P. J. Bacteriol. 1997, 179, 6285)。有報(bào)道稱來(lái)源于產(chǎn)氣桿菌的-乙酰乳酸脫羧 酶能夠催化使用非天然的2-羥基-2-乙基-3-氧代丁酸鹽作為底物的反應(yīng)（Stormer，F(xiàn). C. Methods Enzymol. 1975, 41B, 518)。有報(bào)道稱 Arylmalonate 脫竣酶（EC4. I. 1. 76) 能夠催化由-芳基丙二酸至-芳基羧酸的轉(zhuǎn)化反應(yīng)。Arylmalonate脫羧酶具有高活 性，因此該酶在生物催化過(guò)程中不需要輔助因子來(lái)提高其潛能（Miyam 〇t〇，K;Ohta，H. Eur. J. Biochem. 1992, 210, 475)。最近，結(jié)構(gòu)引導(dǎo)的定向進(jìn)化已被用于改造該酶的特 異性（Okrasa，K ;Levy，C ;Wilding，M ;Godall，M ;Baudendistel，N ;Hauer，B ;Leys，D ; Micklefield, J. Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 7691) 〇
[0037] 如圖I所示，步驟C，高檸檬酸鹽可通過(guò)氧化脫羧機(jī)制轉(zhuǎn)化為3-酮己二酸鹽。除 了釋放二氧化碳，這種特殊類型的脫羧酶能夠同時(shí)將-羥基氧化成氧代官能團(tuán)。如在脂肪 酸降解途徑中發(fā)現(xiàn)的該種酶。例如，來(lái)源于大腦微粒體的α-羥基酸脫羧酶被報(bào)道可催 化-羥基硬脂酸的脫羧反應(yīng)（Levis, G. M ;Mead，J. F. J. Biol. Chem. 1964, 239, 77)。在另一 個(gè)實(shí)施例中，編碼非血紅素鐵加氧酶的CloR被報(bào)道可在clorobiocin的單一生物合成途 徑中催化兩個(gè)連續(xù)的氧化脫羧反應(yīng)（Pojer, F ;Kahlich, R ;Kammerer, B ;Li, S. M ;Heide, L. J. Biol. Chem. 2003, 278, 30661)。近期已利用功能模型對(duì)C