苯甲酰多羥基環(huán)己烯在制備藥物組合物中的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥學(xué)領(lǐng)域，涉及苯甲酰多羥基環(huán)己烯在制備藥物組合物中的用途，具 體涉及在制備抗外泵耐藥金葡菌協(xié)同作用的藥物組合物中的用途；尤其是苯甲酰多羥基環(huán) 己烯在制備對(duì)外泵型耐氟喹諾酮類耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA)藥物中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 耐甲氧西林金黃葡萄球菌（Methicillin-ResistantStaphylococcus aureus，MRSA)為醫(yī)院內(nèi)最常見的傳染病菌之一。如今，MRSA對(duì)所有內(nèi)酰胺類抗生素如青霉 素等藥物都具有耐藥性，而且對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類，氟喹諾酮類，四環(huán)素類等抗生素也都產(chǎn)生了耐 藥性，這使得它的感染變得更加難以治療。目前，可用于治療MRSA的抗生素只有萬古霉素， 然而不幸的是，2002年在美國已經(jīng)出現(xiàn)了完全抗萬古霉素MRSA菌株。近年來，我國由于抗 生素廣泛的使用，甚至是濫用，特別是在萬古霉素成為多家醫(yī)院常規(guī)抗生素類用藥之后，這 一形勢變得愈加嚴(yán)峻。除了通過采取限制濫用抗生素的相關(guān)措施以減緩耐藥MRSA增長的 速度外，同時(shí)必須加速研發(fā)新的抗耐藥MRSA藥物，以防現(xiàn)有的抗菌藥物無法起作用時(shí)，出 現(xiàn)細(xì)菌的大規(guī)模爆發(fā)。
[0003] 細(xì)菌耐藥性（DrugResistance)的產(chǎn)生具有多種原因，其中細(xì)菌對(duì)藥物產(chǎn)生外排 作用而導(dǎo)致的外泵（efflux)耐藥性是最重要的耐藥性機(jī)制之一。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的報(bào) 告，具有多藥耐藥外排泵的細(xì)菌引起的感染已經(jīng)占到了院內(nèi)感染的60%。
[0004] 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌有多種耐藥機(jī)制，除了具有染色體為40kb的耐 藥基因（mecA)通過編碼甲氧西林接合蛋白（PenicilinBindingProtein，PBP)產(chǎn)生 對(duì)(6-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性之外，還對(duì)多種類型抗生素產(chǎn)生耐藥性。對(duì)氟喹諾酮類 (fluoroquinolones)通過過度表達(dá)NorA[1]外泵蛋白產(chǎn)生耐藥性。細(xì)菌細(xì)胞通過外排泵 將普遍使用的絕大多數(shù)抗生素泵出細(xì)胞外，使細(xì)胞內(nèi)的抗生素濃度降低而無法起到抗菌作 用。
[0005] 諾氟沙星是一種氟喹諾酮類抗生素，1986年開始被用于臨床[2]。因它對(duì)革蘭氏陽 性菌及革蘭氏陰性菌，尤其是金黃色葡萄球菌，具有較強(qiáng)的抑制作用而廣泛用于尿道、呼吸 道等的抗感染治療 [3]。也正因?yàn)橹Z氟沙星在臨床及畜牧業(yè)的廣泛應(yīng)用，細(xì)菌對(duì)其產(chǎn)生了嚴(yán) 重耐藥性，從而限制了諾氟沙星的應(yīng)用[4]。產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制多樣，其中之一便是細(xì)菌外排 泵 [2,5]。因此，選擇具有NorA外泵基因的MRSA細(xì)菌株作為外泵抑制劑的篩選靶標(biāo)是尋找具 有外泵抑制作用的抗耐藥金葡菌抗生素增敏劑的一種重要途徑。
[0006] 本申請的發(fā)明人，擬通過使用天然成分EllipeiopsolB和Zeylenol分別與諾氟沙 星配伍成組合藥物，使降低諾氟沙星的最低抑菌濃度，對(duì)諾氟沙星產(chǎn)生抗耐藥金葡菌的增 效作用。
[0007] 于本發(fā)明相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)有：
[0008] [1]Guay, GG, etal. The Tet(K)Gene of plasmid PT181 of Staphylococcus aureus encodes an efflux protein that contains 14 transmenbrane helices. Plasmid. 1993, 30 (2) : 163-166.
[0009] [2]BeardenDT,DanzigerLH.Mechanismofactionofandresistanceto quinolones.Pharmacotherapy2001, 21:40-61.
[0010] [3]Holmes,B,etal.Norfloxacin.Drugs. 1985, 30 (6) :482-513.
[0011] [4]MarkhamPN,NeyfakhAA.Inhibitionofthemultidrugtransporter NorAInStaphylococcusaureuspreventsemergenceofnorfloxacinresistance. AntimicrobialAgentsChemotheropy. 1996,40(11):2673-2674.
[0012] [5]HooperDC.Emergingmechanismsoffluoroquinoloneresistance.Emerging InfectiousDiseases. 2001, 7:337 - 341.。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 本發(fā)明目的是提供苯甲酰多羥基環(huán)己烯在制備藥物組合物中的用途，具體涉及在 制備抗外泵耐藥金葡菌協(xié)同作用的藥物組合物中的用途；尤其是苯甲酰多羥基環(huán)己烯在制 備對(duì)外泵型耐氟喹諾酮類耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA)藥物中的用途。
[0014] 本發(fā)明的組合物中增效成分為具有苯甲酰基多基取代環(huán)己烯類化學(xué)結(jié)構(gòu)，根據(jù)結(jié) 構(gòu)中羥基和苯甲?；鶚?gòu)型取向不同，具有四個(gè)異構(gòu)體；
[0015]
[0017] 本發(fā)明通過下述分離，鑒定方法確認(rèn)化合物
[0018] 胡椒屬植物萎葉（Piperspp.)紫玉盤屬植物（Uvariaspp.)分別用95%乙醇提 取物的氯仿萃取部位進(jìn)行硅膠柱層析分，純化后所得化合物加入氘代氯仿溶解進(jìn)行核磁共 振和質(zhì)譜結(jié)構(gòu)測試。
[0019] 本發(fā)明中代表化合物為EllipeiopsolB和Zeylenol，分子式為C21H2tlO7，分子量為 384。
[0020]
[0021] 本發(fā)明經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明，所述的苯甲酰多羥基環(huán)己烯化合物對(duì)外泵耐藥金葡菌具有協(xié) 同抗菌作用。所述的苯甲酰多羥基環(huán)己烯化合物本身沒有抑制細(xì)菌生長作用，但與抗生素 諾氟沙星配伍時(shí)，其針對(duì)細(xì)菌外排泵（efflux)耐藥機(jī)制，進(jìn)行含有NorA基因的耐氟喹諾酮 類耐甲氧西林金黃色葡萄球菌實(shí)驗(yàn)?zāi)退幘鶶Al199B的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，化合物Zeylenol和 EllipeiopsolB能使諾氟沙星的最低抑菌濃度值分別降低4倍和16倍。
[0022] 本發(fā)明中，采用多氧取代環(huán)己烯類天然化合物Ellipeiopsol B和Zeylenol與抗 生素諾氟沙星不同濃度下進(jìn)行對(duì)耐氟喹諾酮金葡菌SA1199菌株單獨(dú)抑菌實(shí)驗(yàn)，及兩者形 成不同配比的組合物進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，結(jié)果顯示兩個(gè)化合物對(duì)諾氟沙星皆以協(xié)同作用方式產(chǎn) 生抑菌增效作用，Zeylenol效果與陽性藥利血平相同，而Ellipeiopsol B效果更佳，協(xié)同 增效作用是利血平的4倍，協(xié)同增效作用非常明顯；用溴化乙錠為熒光標(biāo)記物進(jìn)行外排泵 抑制試驗(yàn)，結(jié)果顯示化合物Zeylenol抑制外排效果明顯，抑制作用與實(shí)驗(yàn)陽性對(duì)照物氰氯 苯腙水平相當(dāng)。
[0023] 本發(fā)明中，實(shí)驗(yàn)菌SAl199B為對(duì)氟諾喹酮類抗生素耐藥的金黃色葡萄球菌，抗生 素諾氟沙星對(duì)它最低抑制濃度為（MIC)值為64iig/mL;耐藥機(jī)制為細(xì)菌過度表達(dá)NorA多 藥耐藥外泵蛋白形成外排泵（effluxpump)機(jī)制，降低了抗生素在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度； 對(duì)于耐藥菌株SAl199B，諾氟沙星的MIC值為64iig/mL，上述兩個(gè)化合物對(duì)此菌株的MIC均 大于128iig/mL，但化合物EllipeiopsolB和Zeylenol分別與諾氟沙星配伍時(shí)，能使諾氟 沙星對(duì)菌株SAl199B的MIC值分別降至4和16iig/mL，分別降低了 16和4倍；Zeylenol協(xié) 同增效作用與文獻(xiàn)報(bào)道利血平效果相同，EllipeiopsolB效果是文獻(xiàn)報(bào)道利血平的4倍，所 述兩個(gè)化合物均具有明顯的協(xié)同抗菌活性。
[0024] 本發(fā)明實(shí)驗(yàn)包括步驟：
[0025] 1?細(xì)菌培養(yǎng)及檢測
[0026]細(xì)菌培養(yǎng)在細(xì)胞培養(yǎng)室超凈臺(tái)中操作，在96孔板中進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，米勒-亨頓肉 湯（Mueller-HintonBrooth,MHB)為培養(yǎng)基。取化合物樣品及抗生素諾氟沙星各適量，以 DMSO溶解配置成一定濃度的兩種母液，以肉湯稀釋。不加藥物作為陰性對(duì)照。接種細(xì)菌96 孔板于37°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24小時(shí)，加入MTT，觀察結(jié)果，以細(xì)菌完全不生長時(shí)所需藥 物的最低濃度為藥物對(duì)此菌種的MIC值，以MTT溶液3-[4, 5-二甲基噻唑基-2]-2, 5-二苯 基四唑藍(lán)溴化物（Sigma)，用于檢測細(xì)菌的生長，MTT由黃色變成藍(lán)色則指示有細(xì)菌生長；
[0027] 2.協(xié)同作用方法試驗(yàn)化合物對(duì)抗生素的增效作用
[0028] 在96孔板上以二倍稀釋法形成的不同濃度進(jìn)行化合物與抗生素協(xié)同作用抗菌試 驗(yàn)；
[0029] 取適量諾氟沙星溶于DMSO配成抗生素