母液，取適量諾氟沙星母液溶于肉湯中配 成諾氟沙星原液，取化合物樣品適量溶于DMSO配成母液，用肉湯稀釋，化合物和抗生素起 始抑制濃度分別為128和64yg/mL，以此進行正交實驗，記錄每行恰好細菌不生長的微孔 所對應的諾氟沙星的濃度是與化合物樣品聯(lián)用時諾氟沙星的MIC值；
[0030] 研究報道藥物利血平（reserpine)具有抑制外排泵作用，它能夠抑制耐藥細菌 對藥物的外排作用，增加抗生素的抑菌效果，利血平作為在本發(fā)明研究實驗平臺的陽性 對照藥物，用本發(fā)明中協(xié)同作用實驗方法測試利血平與諾氟沙星聯(lián)用對SA1199B的抑制 作用，結果顯示，在利血平濃度為g/mL時可將諾氟沙星對SA1199B的最低抑菌濃度 降低4倍，由64iig/mL降至16iig/mL，利血平藥物購買于阿拉丁化學試劑公司（Aladdin ChemistryCo.Ltd)；
[0031] 3.EtBr外排抑制實驗方法
[0032] 取適量SA1199B菌種以適量MH肉湯培養(yǎng)過夜，配制菌懸液OD62tl為0.8， 加入溴化乙錠（EtBr)，再分別加入陽性對照藥氰氯苯腙（carbonylcyanide m-chlorphenyl-hydrazone,CCCP)和化合物Zeylenol(100uM)，室溫培養(yǎng) 20 分鐘后離心， 再用適量肉湯懸?。蝗缓笸?6孔板各加入200yL混懸液，在激發(fā)波和發(fā)射波波長分別為 530和600nm波長下連續(xù)測定熒光吸收值，每5分鐘測量一次，連續(xù)測試一小時。
[0033] 本發(fā)明中，通過使用天然成分EllipeiopsolB和Zeylenol分別與諾氟沙星配伍成 組合藥物，顯著降低諾氟沙星的最低抑菌濃度，對諾氟沙星產生抗耐藥金葡菌的增效作用。
【附圖說明】
[0034] 圖1是Zeylenol抑制EtBr外排泵作用結果。
【具體實施方式】
[0035] 實施例1?從植物萎葉中分離增效化合物EllipeiopsolB和Zeylenol
[0036] 胡椒屬植物萎葉（Piperbetle)的95%乙醇提取物的氯仿萃取部位3. 5g浸膏， 用200-300目的硅膠拌樣進行柱層析，每20mL為一個流分。以氯仿-丙酮（9:1)洗脫，收 集流分32-36，記為？1'02-32。對？1'02-32進行分離，以氯仿-甲醇（95:5)洗脫，收集流分 4-5,記為Fr02-32-4,減壓蒸干后稱重為430mg。繼續(xù)分離Fr02-32-4,以氯仿-丙酮（9:1) 洗脫，分別收集流分2-5和流分6-10,分別記為Fr02-32-4-2和Fr02-32-4-6,減壓蒸干后 稱重分別為160mg和220mg。分別對Fr02-32-4-2和Fr02-32-4-6純化數(shù)次，終得白色固 體Fr02-32-4-2重20mg，F(xiàn)r02-32-4-6重35mg，經薄層色譜和液相檢測為一純品，分別為 EllipeiopsolB和Zeylenol0
[0037] 實施例2、從植物小花紫玉盤中分離增效化合物EllipeiopsolB和Zeylenol
[0038] 紫玉盤屬植物小花紫玉盤（Uvariarufa)干燥地上部分3. 34Kg經氯仿提取，得綠 色浸膏482g。取部分此浸膏（150g)經50%的石油醚-酒精/水溶液萃取分層，然后將酒精 /水層部分再經氯仿萃取，得氯仿次提物104g。將104g浸膏通過柱色譜分離，經氯仿-丙 酮洗脫，得Fr-I~Fr-5五個組分。對Fr-3 (5g)繼續(xù)硅膠柱色譜分離，經氯仿-甲醇洗 脫得Fr-3-l~Fr-3-9九個組分。對Fr-3-5 (2. 89g)繼續(xù)以硅膠柱色譜分離，以二氯甲 烷-丙酮洗脫，得Fr-3-5-1~Fr-3-5-13十三個組分。對Fr-3-5-7 (I. 22g)進一步經反 相硅膠柱色譜和正相硅膠柱色譜分離純化得EllipeiopsolB和Zeylenol分別67. 5mg和 161. 9mg。質譜實驗顯示兩個化合物的分子量均為384,1H-NMR及13C-NMR數(shù)據(jù)分別如表1所 /Jn〇
[0040] 表1.化合物2和3的NMR數(shù)據(jù)（化學位移ppm，峰形，耦合常數(shù)Hz，溶劑⑶Cl3)
[0041]

O
[0043] 實施例3、以簡單化學原料合成增效化合物Zeylenol
[0044] 合成路線：
[0045]
O
[0046] 實施例4、化合物與諾氟沙星聯(lián)用時的協(xié)同增效作用
[0047] 在96孔板上以二倍稀釋法形成的不同濃度進行化合物與抗生素協(xié)同作用抗菌試 驗；
[0048] 取適量諾氟沙星溶于DMSO配成抗生素母液，取適量諾氟沙星母液溶于肉湯中配 成諾氟沙星原液，取化合物EllipeiopsolB和Zeylenol樣品按計算量溶于DMSO配成母液， 用肉湯稀釋，化合物和抗生素起始抑制濃度分別為128和64yg/mL，以此進行正交實驗，記 錄每行恰好細菌不生長的微孔所對應的諾氟沙星的濃度是與化合物樣品聯(lián)用時諾氟沙星 的MIC值，試驗結果如表2所示。
[0049] 表2.化合物及抗生素諾氟沙星對耐藥菌的最低抑菌濃度（MIC)和部分抑菌濃度 指數(shù)（FICI)
[0050]
[0051] 其中，I.FICI彡0. 5為協(xié)同作用；0. 5〈FICI彡1相加作用；KFICI彡2為無相關 作用；；2〈FICI< 4為拮抗作用；
[0052] 2.兩個化合物對SA1199B菌種皆無直接作用，但與諾氟沙星聯(lián)用時分別能降低抗 生素用量16和4倍，協(xié)同作用明顯。
[0053] 實施例5、確定化合物協(xié)同作用機制--外排泵抑制作用
[0054] 取適量SAl199B菌種以適量MH肉湯培養(yǎng)過夜，配制菌懸液OD62tl為0. 8,加入溴化 乙錠（EtBr)，再分別加入陽性對照藥氰氯苯腙（carbonylcyanidem-chlorphenyl-hydrazo ne，CCCP)和化合物Zeylenol(100iiM)，室溫培養(yǎng)20分鐘后離心，再用適量肉湯懸浮，然后 往96孔板各加入200iiL混懸液，在激發(fā)波和發(fā)射波波長分別為530和600nm波長下連續(xù) 測定熒光吸收值，每5分鐘測量一次，連續(xù)測試一小時，實驗結果顯示，化合物作用效果與 CCCP相當，具有明顯外排抑制作用，說明化合物協(xié)同作用機制可能是通過抑制細菌外排泵 實現(xiàn)的，結果如圖1所示。
【主權項】
1. 苯甲酰多羥基環(huán)己烯化合物在制備抗外泵耐藥金葡菌協(xié)同作用的藥物組合物中的 用途。2. 按權利要求所述的用途，其特征在于，所述的苯甲酰多羥基環(huán)己烯化合物具有苯甲 ?；嗷〈h(huán)己烯類化學結構，根據(jù)結構中羥基和苯甲?；鶚嬓腿∠虿煌?，具有四個異 構體，3. 按權利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述的苯甲酰多羥基環(huán)己烯化合物為 Ellipeiopsol B 和 Zeylenol，分子式為 C21H2tlO7,分子量為 384。4. 按權利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述的藥物組合物中，苯甲酰多羥基環(huán) 己烯化合物逆轉氟喹諾酮耐藥金葡菌的耐藥性，降低諾氟沙星實驗耐藥金葡菌的最低抑菌 濃度（MIC)。5. 按權利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述的耐藥金葡菌為SAl 199B，其對抗 生素諾氟沙星不敏感。6. 按權利要求3所述的用途，其特征在于，所述的化合物EllipeiopsolB和Zeylenol 與諾氟沙星合用能提高抗生素對耐藥金葡菌SA1199B的抑制效果，分別使諾氟沙星對耐藥 金葡菌株SA1199B的MIC降低為抗生素單獨使用時的十六分之一和四分之一；在不改變抑 菌效果時，降低諾氟沙星抗生素的使用劑量。
【專利摘要】本發(fā)明屬藥學領域，涉及苯甲酰多羥基環(huán)己烯化合物及其對外泵耐藥金葡菌的協(xié)同抗菌作用。本發(fā)明的化合物本身沒有抑制細菌生長作用，與抗生素諾氟沙星配伍時，通過針對細菌外排泵(efflux)耐藥機制，采用含有NorA基因的耐氟喹諾酮類耐甲氧西林金黃色葡萄球菌實驗耐藥菌SA1199B進行試驗，結果顯示化合物Zeylenol和Ellipeiopsol B使諾氟沙星的最低抑菌濃度值分別降低4倍和16倍。本發(fā)明所涉及化合物Zeylenol對細菌的外排泵抑制效果與陽性對照藥物相當。本發(fā)明涉及的化合物可用于制備抗生素增效藥物。
【IPC分類】A61K31/235, A61P31/04, A61K31/496
【公開號】CN104887678
【申請?zhí)枴緾N201410078977
【發(fā)明人】孫仲琳, 穆青, 王雙英, 西蒙.吉本斯
【申請人】復旦大學
【公開日】2015年9月9日
【申請日】2014年3月5日