專利名稱：一種人用二倍體細胞狂犬滅活疫苗及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物工程領域，具體地是涉及人用狂犬滅活疫苗，特別是在人用二倍
體細胞上接種狂犬病毒毒種得到的狂犬病滅活純化疫苗及其制備方法。
背景技術：
狂犬病是一種由狂犬病毒引起的人獸共患病，該病是以侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)為主的 急性傳染病， 一旦發(fā)病，死亡率高達100% 。盡管這是一個古老的疾病，但人類至今仍然無法 消滅它，在我國曾一度得到有效控制，但近年來狂犬病疫情快速回升，研制并推廣使用安全 高效的人用狂犬病疫苗是控制狂犬病疫情的有效手段。 1885年法國科學家巴斯德首次將狂犬病病毒在兔腦連續(xù)傳代和干燥減毒而制成 的疫苗，奇跡般的救治了一名被瘋狼嚴重咬傷的9歲小孩，開辟了人用狂犬病疫苗的新紀 元。100多年以來，特別是近二三十年現(xiàn)代細胞培養(yǎng)技術和分子生物學的發(fā)展，狂犬病疫苗 取得了重大進展。 目前世界上大量生產(chǎn)的狂犬疫苗有四種第一種以法國為代表的Vero細胞為培 養(yǎng)狂犬病毒，制備凍干滅活疫苗，但不能保證細胞基質(zhì)的致瘤性和細胞的殘余DNA。第二種 和第三種以中國為代表的地鼠腎和日本的雞胚、鴨胚這幾種疫苗細胞來源于普通動物，無 法保證細胞不攜帶外源因子也不能保證細胞基質(zhì)的致瘤性和細胞的殘余DNA。第四種以美 國為代表的二倍體細胞，經(jīng)過濃縮超離制備的狂犬疫苗； 人二倍體細胞疫苗(HDCV)是在人用二倍體細胞上培養(yǎng)狂犬病毒，經(jīng)澄清、加熱和 e-丙內(nèi)酯滅活、凍干制備而成。該疫苗在1974年首次獲準生產(chǎn)，1978年開始商品化。該疫 苗不含任何神經(jīng)毒因子，并不含任何外源動物雜質(zhì)，因而可以解釋它在重復注射后較好的 耐受。采用NIH法檢測疫苗的穩(wěn)定性證實，疫苗在fC和37t:放置1個月后，無明顯差異。 進一步將5批效價4. 3-5. 6的疫苗4t:存放3年半，所有批號效價均大于2. 5IU/劑。
該疫苗已在歐洲、北美以及世界各國應用二十年，證實是安全且高效的。早期調(diào)查 研究發(fā)現(xiàn)，HDCV預防接種后1月或3月達到抗體峰值(10IU左右)，隨后逐漸降低，但1-2 年內(nèi)滴度始終大于0. 5IU。通過1-3年內(nèi)加強免疫后，抗體滴度迅速增加10-15倍，肌肉注 射和皮下注射途徑相近。人二倍體細胞(HDC)為正常核型，無致癌性，具有高免疫原性和良 好的耐受性。在人體試驗中所使用的任何疫苗的免疫原性都無法和HDCV相比。
本發(fā)明經(jīng)過研究，利用細胞工廠和微載體在這些人用二倍體細胞WI-38、 KMB17、 IMR-90、 MRC-5、2BS上培養(yǎng)狂犬病毒，所制備的疫苗價格低廉，安全性高，免疫效果好，使用 方便，純度高，適合大規(guī)?；a(chǎn)和應用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術存在的缺點和不足，而提供一種抗原純度高、 免疫效果好、安全性高的人用二倍體細胞狂犬病毒滅活純化疫苗。 本發(fā)明的另一個目的是提供了一種適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)且可滿足國內(nèi)外市場對狂犬疫苗需求的人用二倍體細胞狂犬疫苗的制備方法。 為實現(xiàn)上述第一個目的，本發(fā)明的技術方案是該疫苗在制備過程中是在人用二倍 體細胞上接種培養(yǎng)PM狂犬病毒株，經(jīng)滅活純化得到的狂犬疫苗，所述的人用二倍體細胞是 WI-38、 KMB17、 IMR-90、 MRC_5、2BS。公知，源于人體組織的人用二倍體細胞來源清楚，包括 捐獻者的年齡、性別、種族、地域、體能及健康狀況、細胞直接來源的組織或器官、細胞世代 數(shù)等。人用二倍體細胞系經(jīng)過數(shù)十年研究，其生長特性、遺傳穩(wěn)定的特性、外源因子(細菌、 真菌、支原體及病毒)污染檢查、致腫瘤陰性等特征被充分驗證。更為重要的是人用二倍體 細胞本身源于人體細胞，當用于疫苗制造時人用二倍體細胞的殘余成分不會成為超敏反應 原，基本不會引起接種者超敏反應。因此，從質(zhì)量控制以及安全性角度看，相較于鼠腦組織、 原代地鼠腎細胞、雞胚細胞和Vero細胞系等外源細胞系，人用二倍體細胞沒有潛在的不安 全隱患，是制備疫苗理想的細胞系。本發(fā)明采用人用二倍體細胞作為疫苗制備的病毒培養(yǎng) 所用的細胞系，顯著的提高現(xiàn)行狂犬病毒疫苗的質(zhì)量和安全性，有利于質(zhì)量控制。
為實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明的技術方案是
(1)人用二倍體細胞的復蘇、培養(yǎng)及擴增；
(2)在人用二倍體細胞上接種PM毒株；
(3)收獲病毒液；
(4)澄清超濾濃縮；
(5)病毒液滅活、純化； (6)稀釋分裝并加入保護劑后凍干制成純化疫苗。 進一步設置是所述的人用二倍體細胞是WI-38、KMB17、 IMR-90、MRC-5、2BS。首先 建立人用二倍體細胞主種子庫和工作庫，并對細胞庫細胞進行系統(tǒng)檢定。在制備疫苗之前， 需先進行細胞的復蘇、培養(yǎng)和擴增，使細胞量達到生產(chǎn)需要。細胞復蘇。本發(fā)明中在生長成 片的人用二倍體細胞上接種狂犬病毒，狂犬病毒在人用二倍體細胞上的生長繁殖可維持較 長時間，因此病毒收獲可采取多次收取方式。 進一步設置是所述的步驟(1)所使用的細胞培養(yǎng)液為199培養(yǎng)液或MEM培養(yǎng)液， 且該細胞培養(yǎng)液中含牛血清的體積分數(shù)比為15% -20%、慶大霉素或卡那霉素24-32U/ml，
并調(diào)ra至8. o-9.2，其培養(yǎng)溫度為39-4rc。本設置，可以使用碳酸氫鈉調(diào)細胞培養(yǎng)液ra
到8. 0 8. 8之間，同時在細胞培養(yǎng)液中加入適量慶大霉素，以防止細菌污染。 進一步設置是所述的步驟(3)要求收獲病毒液的病毒滴度不低于8. 0LgLD5。/ml，
本設置保證疫苗效力。 進一步設置是所述步驟(5)疫苗的純化通過S印harose4FF柱層析法或高速區(qū)帶 離心來實現(xiàn)。 進一步設置是步驟(1)中人二倍體細胞的培養(yǎng)方式為采用細胞工廠培養(yǎng)或微載 體反應器培養(yǎng)。由于本發(fā)明中人用二倍體細胞為附著依賴性細胞，細胞在培養(yǎng)過程需附著 一定載體生長，則本發(fā)明中細胞的培養(yǎng)方式可以采用細胞工廠培養(yǎng)，也可以使用微載體反 應器培養(yǎng)。人用二倍體細胞在微載體反應器中培養(yǎng)時，微載體使用量為22 27g/L，轉(zhuǎn)速為 55-120轉(zhuǎn)/分鐘。 本發(fā)明利用細胞工廠和微載體在這些人用二倍體細胞WI-38、 KMB17、 MR_90、 MRC-5、2BS上培養(yǎng)狂犬病毒，所制備的疫苗價格低廉，安全性高，免疫效果好，使用方便，純度高，適合大規(guī)?；a(chǎn)和應用。 下面結合具體實施方式
對本發(fā)明做進一步介紹。
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發(fā)明進行具體的描述，只用于對本發(fā)明進行進一步說 明，不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限定，該領域的技術工程師可根據(jù)上述發(fā)明的內(nèi)容對 本發(fā)明作出 一些非本質(zhì)的改進和調(diào)整。
實施例1
使用復蘇的人用二倍體細胞WI-38，細胞營養(yǎng)液為MEM培養(yǎng)液，其中含有 15% -20%小牛血清和24-32u/ml的慶大霉素，調(diào)ffl至8. 0_9. 2，經(jīng)過10天后，細胞長成致 密單層，棄去細胞營養(yǎng)液，用0-7. 4的歐式平衡鹽液沖洗細胞面，再用吸附法接種狂犬 病毒PM株。所使用的PM株工作毒種，毒種用少量細胞維持液即含2X (w/w)人白蛋白的 MEM液稀釋，其ra為8.4-8.6。 31°C -35t:下吸附30分鐘后，再補加適量細胞維持液繼續(xù) 在37t: -401:下培養(yǎng)。收獲病毒液取樣進行病毒滴度和無菌試驗，要求收獲病毒液的病毒 滴度達到8. 0LgLD5。/ml以上。收獲的合格病毒液分裝至凍存管，lml/管，液氮保存?zhèn)溆谩?
實施例2
取體重11-13g清潔級昆明種小鼠，按本發(fā)明方法制備的人用二倍體細胞狂犬滅 活疫苗(HDCV)與市售原代地鼠腎細胞疫苗(PHKCV)、純化雞胚細胞疫苗(PCECV)和傳代 Vero細胞狂犬病疫苗進行小鼠腹腔注射免疫2次，每次0. 5ml，間隔7天。首次免疫后14 天分別按5-100LD5。腦內(nèi)攻擊CVS病毒液0. 03ml ;同時以稀釋液腦內(nèi)注射0. 03ml攻擊的病 毒感染量于相同體重健康小鼠腦內(nèi)接種，測定病毒滴度(LDJ，攻擊后小鼠觀察14天，根據(jù) 動物死亡數(shù)計算保護力。 表1不同疫苗免疫小鼠對腹腔攻擊的保護效果
疫苗免疫途徑免疫針次CVS毒株攻擊保護
HDCV腹腔210/10
PHKCV腹腔29/10
PCECV腹腔28/10
Vero細胞滅活疫苗腹腔29/10
未免疫對照--1/10 注存活動物數(shù)/試驗動物數(shù) 從表1可看出，以腹腔途徑免疫后，HDCV能夠使小鼠對CVS株獲得完全保護，而 PHKCV、 PCECV、 Vero細胞滅活疫苗對CVS株的保護率為80% 90% ，經(jīng)統(tǒng)計學處理有顯著 性差異(P < 0. 001)。試驗結果初步表明，按本發(fā)明方法制備的人用二倍體細胞狂犬滅活疫 苗(HDCV)的保護效力等同或略高于其他方法生產(chǎn)的狂犬疫苗。
狂犬疫苗免疫原性及副反應觀察 18-60歲之間，無犬、貓等動物咬傷及抓傷史，無狂犬病疫苗與抗狂犬病血清使用
5史的健康成年人3000例，隨機分為人用純化狂犬病疫苗(HDCV)試驗組和Vero細胞滅活純 化疫苗陽性對照組和陰性對照組。常規(guī)5針法接種，HDCV組的抗體陽性率為100%，陽性對 照組的陽性率為88. 55%，陰性對照組的陽性率為1. 25%。經(jīng)統(tǒng)計學處理有顯著性差異(P < 0.001)。說明我們發(fā)明的人用純化狂犬病疫苗(HDCV)效果優(yōu)于Vero細胞滅活純化疫 苗，抗體陽性率能達到100 % ，對人體有非常充分的保護效力。
權利要求
一種人用二倍體細胞狂犬滅活疫苗，其特征在于該疫苗在制備過程中是在人用二倍體細胞上接種培養(yǎng)PM狂犬病毒株，經(jīng)滅活純化得到的狂犬疫苗。
2. 根據(jù)權利要求1所述的人用二倍體細胞人用狂犬滅活疫苗，其特征在于所述的人用二倍體細胞是WI-38、KMB 17、 IMR-90、MRC-5、2BS。
3. —種人用二倍體細胞人用狂犬滅活疫苗的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1) 人用二倍體細胞的復蘇、培養(yǎng)及擴增；(2) 在人用二倍體細胞上接種PM毒株；(3) 收獲病毒液；(4) 澄清超濾濃縮；(5) 病毒液滅活、純化；(6) 稀釋分裝并加入保護劑后凍干制成純化疫苗。
4. 根據(jù)權利要求3所述的人用二倍體細胞人用狂犬滅活疫苗的制備方法，其特征在 于所述的人用二倍體細胞是WI-38、KMB17、 IMR-90、MRC-5、2BS。
5. 根據(jù)權利要求3或4所述的人用二倍體細胞人用狂犬滅活疫苗的制備方法，其特征 在于步驟(1)中人二倍體細胞的培養(yǎng)方式為采用細胞工廠培養(yǎng)或微載體反應器培養(yǎng)。
6. 根據(jù)權利要求5所述的人用二倍體細胞人用狂犬滅活疫苗的制備法，其特征在于 所述的步驟(1)所使用的細胞培養(yǎng)液為199培養(yǎng)液或MEM培養(yǎng)液，且該細胞培養(yǎng)液中含牛 血清的體積分數(shù)比為15% -20%、慶大霉素或卡那霉素24-32U/ml，并調(diào)ffl至8. 0_9. 2，其 培養(yǎng)溫度為39-41°C。
7. 根據(jù)權利要求3或4或6所述的人用二倍體細胞人用狂犬滅活疫苗的制備方法，其 特征在于所述的步驟(3)要求收獲病毒液的病毒滴度不低于8. 0LgLD5。/ml。
8. 根據(jù)權利要求5所述的人用二倍體細胞人用狂犬滅活疫苗的制備方法，其特征在 于所述的步驟(3)要求收獲病毒液的病毒滴度不低于8. 0LgLD5。/ml。
9. 根據(jù)權利要求7所述的人用二倍體細胞人用狂犬滅活疫苗的制備方法，其特征在 于所述步驟(5)疫苗的純化通過S印harose 4FF柱層析法或高速區(qū)帶離心來實現(xiàn)。
10. 根據(jù)權利要求8所述的人用二倍體細胞人用狂犬滅活疫苗的制備方法，其特征在 于所述步驟(5)疫苗的純化通過S印harose 4FF柱層析法或高速區(qū)帶離心來實現(xiàn)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人用二倍體細胞狂犬疫苗及其制備方法，包括人用二倍體細胞的培養(yǎng)擴增，在人用二倍體細胞上培養(yǎng)狂犬病毒，其中狂犬疫苗還包括收獲病毒，病毒滅活，濃縮和純化等步驟。這種狂犬疫苗由于使用健康的人源二倍體細胞制備，不含任何外源污染因子和致瘤性，經(jīng)純化處理后疫苗純度高，具有免疫效果好、安全性高的優(yōu)點，本發(fā)明所述人用二倍體細胞狂犬疫苗的制備方法是適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)且可滿足國內(nèi)外市場對狂犬疫苗需求的制備方法。
文檔編號A61K39/205GK101716341SQ200910155068
公開日2010年6月2日 申請日期2009年12月14日 優(yōu)先權日2009年12月14日
發(fā)明者楊曉芳, 蔡勇 申請人:成都康華生物制品有限公司