專利名稱：用于治療動脈粥樣硬化的苯甲酸取代的苯并吡喃的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及通過給服有效治療動脈粥樣硬化量的LTB4拮抗劑，優(yōu)選取代的苯并吡喃或其藥學(xué)上可接受的鹽而治療哺乳動物，包括人類動脈粥樣硬化的方法。按照本發(fā)明制備的取代的苯并吡喃在2001年6月28日提交的名稱為“用于治療動脈粥樣硬化的苯甲酸取代的苯并吡喃”的美國臨時專利申請60/301,712；美國專利5,552,435和6,096,906；以及PCT國際申請公開WO96/11925、WO 96/11920和WO 93/15066中提到過。前述每一美國及PCT國際專利以及專利申請全文作為參考引入本文。
動脈粥樣硬化病變的形成可出現(xiàn)在五個相互重疊的階段中，所述階段如遷移，脂質(zhì)堆積，炎性細(xì)胞的補(bǔ)充，血管平滑肌細(xì)胞的增殖以及細(xì)胞外基質(zhì)沉積。其中每一步驟都可以出現(xiàn)在動脈粥樣硬化的人和動物模型中，但是各步驟對病變相對作用以及病變的臨床意義尚不清楚。
單核細(xì)胞的補(bǔ)充和激活為發(fā)展動脈粥樣硬化病變的一個方面[參見Gerrity，R.G，Cellular Events In Early Atherogenesis In Swine，In Swine InBiomedical Research，M.E.Tumbleson，Editor.1985，Plenum PressNew York.p.1497-1509]。單核細(xì)胞的補(bǔ)充由細(xì)胞-特異性化學(xué)吸引劑控制，包括花生四烯酸代謝產(chǎn)物白細(xì)胞三烯B4(LTB4)。LTB4和B4異白三烯通過與在炎性細(xì)胞如中性白細(xì)胞、嗜酸細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上表達(dá)的高親合力LTB4受體(BLTR)結(jié)合而誘導(dǎo)產(chǎn)生它們的作用[參見Yokomizo T等人，Nature，1997；387620-624]。在臨癥前期疾病模型如試驗性的自身免疫腦心肌炎、膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎和同種移植物，BLTR拮抗劑顯示能抑制中性白細(xì)胞、嗜酸細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的補(bǔ)充[參見Weringer E.J.等人，Transplantation，1999；67(6)808-815；GriffithsR等人，Proc NatlAcad Sci USA，1995；92517-521；以及Showell H.J.等人，Journal of Pharmaology and Experimental Therapeutics，1995273176-184]。因此，LTB4或其他與LTB4受體結(jié)合的配位體可以是前動脈粥樣硬化的表現(xiàn)。
本發(fā)明的發(fā)明人在此說明了在數(shù)個動脈粥樣硬化的鼠模型中，特定的LTB4受體拮抗劑，例如苯甲酸取代的苯并吡喃，可以延緩病變的發(fā)展。
發(fā)明概要本發(fā)明涉及一種治療哺乳動物，優(yōu)選人的動脈粥樣硬化的方法，包括對上述哺乳動物給予治療動脈粥樣硬化有效量的下式化合物、其對映體、消旋物或藥學(xué)上可接受的鹽 其中在上述式I化合物中，R3-取代的苯甲酸部分連接在苯并吡喃環(huán)的6或7碳上；R1為-(CH2)qCHR5R6，其中q為0到4；R2和R3各自獨(dú)立地選自氫、氟、氯、(C1-C6)烷基(如甲基)、(C1-C6)烷氧基(如甲氧基)、苯亞磺?；?phenylsulfinyl)、苯磺?；?phenylsulfonyl)以及(C1-C6)烷基-S(O)n-，其中n為0到2；其中上述的R2和R3烷基部分無論存在于何處都可獨(dú)立地任選由一個到三個氟基取代；并且其中上述的R2和R3苯基部分無論存在于何處都可獨(dú)立地任選由一個到三個氟基取代；R5為氫、(C1-C6)烷基(如甲基)或苯基；其中所述的R5苯基任選地由一個到三個獨(dú)立地選自氟、氯、(C1-C6)烷基(如甲基)、(C1-C6)烷氧基(如甲氧基)、苯亞磺?；⒈交酋；?C1-C6)烷基-S(O)n-(其中所述的n為0到2，如(C1-C6)烷硫基)，(C1-C6)烷基亞磺?；?C1-C6)烷磺?；牟糠秩〈徊⑶移渲兴龅耐榛糠譄o論存在于上述苯基的何處都可獨(dú)立地任選由一個到三個氟基取代；并且其中所述的苯亞磺?；捅交酋；糠譄o論存在于上述苯基取代基的何處都可獨(dú)立地任選由一個到三個氟基取代；R6為氫，(C1-C6)烷基，(C3-C8)環(huán)烷基，苯基或5到10元雜芳基；其中所述R6苯基任選地由一個到三個獨(dú)立地選自氟，氯，(C1-C6)烷基(如甲基)，(C1-C6)烷氧基(如甲氧基)，苯亞磺?；?，苯磺酰基和(C1-C6)烷基-S(O)n-(其中所述n為0到2，如(C1-C6)烷硫基)，(C1-C6)烷基亞磺?；?C1-C6)烷基磺?；牟糠秩〈?；并且其中所述烷基部分無論存在于上述苯基取代基的何處都可獨(dú)立地任選由一個到三個氟基取代；并且其中所述的苯亞磺?；捅交酋；糠譄o論存在于上述苯基取代基的何處都可獨(dú)立地任選由一個到三個氟基取代；以及其中所述的5到10元雜芳基任選地由一個到兩個獨(dú)立地選自氟，氯，(C1-C6)烷基(如甲基)，(C1-C6)烷氧基(如甲氧基)，苯亞磺?；?，苯磺?；?C1-C6)烷基-S(O)n-(其中所述的n為0到2，如(C1-C6)烷硫基)，(C1-C6)烷基亞磺?；?C1-C6)烷基磺酰基的取代基取代；其中所述的烷基部分無論存在于上述5到10元雜芳基取代基的何處都可獨(dú)立地任選由一個到三個氟基取代；并且其中所述的苯亞磺?；约氨交酋；糠譄o論存在于上述5到10元雜芳基取代基的何處都可獨(dú)立地任選由一個到三個氟基取代。
除非另外指出，本文中使用的術(shù)語“鹵素”表示氟，氯，溴或碘。
除非另外指出，本文中使用的術(shù)語“烷基”包括具有直鏈，支鏈或其結(jié)合的飽和一價烴基。
本文使用的術(shù)語“烷氧基(alkyloxy)”包括O-烷基，其中“烷基”定義如上。
除非另外指出，本文中使用的術(shù)語“芳基”包括通過除去一個氫而由芳烴衍生得到的有機(jī)基團(tuán)，如苯基或萘基。
除非另外指出，本文中使用的術(shù)語“環(huán)烷基”指單或二環(huán)的碳環(huán)(例如，環(huán)丙基，環(huán)丁基，環(huán)戊基，環(huán)己基，環(huán)庚基，環(huán)辛基，環(huán)壬基，環(huán)戊烯基，環(huán)己烯基，雙環(huán)[2.2.1]庚基，雙環(huán)[3.2.1]辛基和雙環(huán)[5.2.0]壬基，等)；任選地包含1或2個雙鍵并且任選地由一個到三個定義如下的合適的取代基如氟，氯，三氟甲基，(C1-4)烷氧基，(C6-10)芳氧基，三氟甲氧基，二氟甲氧基或(C1-4)烷基，更優(yōu)選氟，氯，甲基，乙基和甲氧基取代。
除非另外指出，本文中使用的術(shù)語“雜芳基”包括通過除去一個氫而由芳雜環(huán)化合物衍生得到的有機(jī)基團(tuán)，如吡啶基，呋喃基，噻吩基，異喹啉基，嘧啶基以及吡嗪基。
除非另外指出，本文中使用的術(shù)語“對映體”包括下式化合物 除非另外指出，本文中使用的術(shù)語“消旋物(racemate)”包括式I化合物及其對映體的混合物，其中術(shù)語“對映體(enantiomer)”定義如上。
用于在本發(fā)明方法中的式I化合物具有手性中心并因此存在不同的對映體形式。本發(fā)明涉及式I化合物的所有旋光異構(gòu)體和立體異構(gòu)體及其混合物，如它們的消旋物。
術(shù)語“持續(xù)釋放(sustained release)”指一種劑型設(shè)計用來將式I化合物在約3到約21天的時間范圍內(nèi)釋放。在比較長的時間內(nèi)釋放也認(rèn)作為本發(fā)明“持續(xù)釋放”劑型。
術(shù)語“治療(treating)”表示逆轉(zhuǎn)，減輕，抑制這術(shù)語所指向的疾病或狀況發(fā)展或防止該術(shù)語所指向的疾病或狀況，或者是逆轉(zhuǎn)、減輕、抑制或預(yù)防這樣的疾病或狀況的一個或多個癥狀。本文中使用的術(shù)語”治療”指治療的行為，如定義如上的“治療”。
術(shù)語“LTB4受體拮抗劑(receptor antagonist)”指定義如上的式I化合物。
術(shù)語“動脈粥樣硬化(atherosclerosis)”指在五個相互重疊的階段如遷移，脂質(zhì)堆積，炎性細(xì)胞的補(bǔ)充，血管平滑肌細(xì)胞的增殖，以及細(xì)胞外基質(zhì)的沉淀中形成的動脈粥樣硬化病變。
本文中使用的術(shù)語“LTB4拮抗劑(antagonist)”指任何通過標(biāo)準(zhǔn)測定(如趨化性測定或直接結(jié)合測定)得到的具有本發(fā)明要求保護(hù)的抗LTB4活性的化學(xué)或藥學(xué)分子，如DNA，RNA，反義或有義低核苷酸，單克隆抗體或多克隆抗體或小分子。
本文中使用的術(shù)語“小分子(small moleculars)”指分子量低于2000克/摩爾，優(yōu)選低于500克/摩爾的非-DNA，非-RNA，非-多肽和非-單克隆抗體分子。優(yōu)選的小分子包含芳環(huán)(如芳基或雜芳基)。更優(yōu)選的小分子包含苯基或苯并吡喃基。最優(yōu)選的小分子為吩噻嗪-3-酮類化合物包括Merck的L-651，392；脒基化合物類包括Novartis的CGS-25019；苯并惡唑胺類(benzoxaolamines)如ontazolast；benzenecarboximidamides類如Boehringer的BIIL 284/260；2-(取代的)-N-羥基-N-烷基肉桂酰胺如Lilly的LY-233，569；包含ebselen的化合物類；包含linazolast的化合物類；包含Bayer的Bay-x-1005的化合物類；包含Leo Denmark的ETH-615的化合物類；包含Merck的MAFP的化合物類；包含類Terumo的TMK-688的化合物類；包含Tanabe的T-0757的化合物類；包含Lilly的LY-213024，LY-210073，LY-223982，LY-233469，LY-255283，LY-293111，LY-264086和LY292728的化合物類；包含ONO的ONO-LB457，ONO-4057和ONO-LB448的化合物類；包含hionogi的S-2474的化合物類；包含骨化三醇的化合物類；包含Searle的SC-53228，SC-41930，SC-50605和SC-51146的化合物類；包含Warner Lambert的BPC-15的化合物類；包含SmithKline Beecham的SB-209247的化合物類；或者包含SK&F的SKF-104493的化合物類。
本文中使用的術(shù)語“病變(lesion)”在Ross，R.The Pathogenesis ofAtherosclerosis in Heart Disease 1106-1124(E.Braunwald ed.，W.B.SaundersCompany 1992)中所述，該文獻(xiàn)作為參考引入。
本文中使用的術(shù)語“斑(plague)”或“斑穩(wěn)定性”如Ross，R.ThePathogenesis ofAtherosclerosis in Heart Disease 1106-1124(E.Braunwald ed.，W.B.Saunders Company 1992)所述，該文獻(xiàn)作為參考引入。
本文中使用的術(shù)語“LTB4的IC50小于約20nM，優(yōu)選小于約10nM，通過趨化性測定得到的”如Doherty等在The In Vitro and In Vivo PharmacologicActivity of the Potent and Selective Leukotriene B4 receptor AntagonistCP-105，696，J.Pharm.andExp.Ther，273176-184(1995)；以及Showell等在Characterization of The Pharmacological Profile of The Potent LTB4AntagonistCP-105，696 on Murine LTB4Receptors In Vitro，Br.J.Pharmacol.，1171127-1132(1996)所述，上述文獻(xiàn)作為參考引入。
本文中使用的術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”指載體，稀釋劑，賦形劑和/或鹽，它們必須與組合物的其他成分兼容，并且不對它們的接受者有害。
在發(fā)明的優(yōu)選方案中，式I化合物抑制脂質(zhì)病變(lipid lesion)的發(fā)展。如在下文中所例舉說明的，苯甲酸取代的苯并吡喃抑制哺乳動物中脂質(zhì)病變的發(fā)展。
本發(fā)明的優(yōu)選方案中，所述式I化合物中的R1為芐基，4-氟芐基，4-苯基芐基，4-(4-氟苯基)芐基或苯乙基。
在本發(fā)明優(yōu)選方案中，所述式I化合物中的R2為氫或氟。
在本發(fā)明優(yōu)選方案中，所述的式I化合物中的R3-取代的苯甲酸部分連接在苯并吡喃環(huán)的碳7位；并且其中所述的R3-取代的苯甲酸部分為2-羧基苯基，2-羧基-5-氯苯基，2-羧基-4-氯苯基，2-羧基-3-氟苯基，2-羧基-5-氟苯基，2-羧基-5-三氟甲基苯基，2-羧基-4-氟苯基，2-羧基-6-氟苯基或3-羧基苯基。
在本發(fā)明優(yōu)選方案中，式I化合物中的R1為芐基，R2為氫，并且R3-取代的苯甲酸部分為2-羧基-5-氟苯基。
在本發(fā)明優(yōu)選方案中，式I化合物中的R1為4-苯基芐基，R2為氫，并且R3-取代的苯甲酸部分為2-羧基-5-氟苯基或2-羧基-4-氯苯基。
在本發(fā)明特別優(yōu)選的方案中，所述式I化合物選自(3S，4R)-7-(2-羧基苯基)-4-羥基-3-芐基-2H-1-苯并吡喃；(3S，4R)-7-(2-羧基-5-氯苯基)-4-羥基-3-芐基-2H-1-苯并吡喃；(3S，4R)-7-(2-羧基-4-氯苯基)-4-羥基-3-芐基-2H-1-苯并吡喃；(3S，4R)-7-(2-羧基-3-氟苯基)-4-羥基-3-芐基-2H-1-苯并吡喃；(3S，4R)-7-(2-羧基-4-氟苯基)-4-羥基-3-芐基-2H-1-苯并吡喃；(3S，4R)-7-(2-羧基-5-氟苯基)-4-羥基-3-芐基-2H-1-苯并吡喃；(3S，4R)-7-(2-羧基-5-三氟甲基苯基)-4-羥基-3-芐基-2H-1-苯并吡喃；和(3S，4R)-7-(3-羧基苯基)-4-羥基-3-芐基-2H-1-苯并吡喃。
在本發(fā)明最優(yōu)選的方案中，式I化合物為(3S，4R)-7-(2-羧基-5-三氟甲基苯基)-4-羥基-3-芐基-2H-1-苯并吡喃。
在上述的一個具體方案中，式I化合物的量為0.5到1000毫克/天。
在上述的一個具體方案中，式I化合物口服給藥。
在上述的另外的具體方案中，式I化合物浸滲(impregnated)在斯坦特印模(stent)，如血管內(nèi)的斯坦特印模，它可以是金屬，塑料或可生物降解的聚合物。對于可用于形成它們的植入裝置和生物材料的一般討論，參見H.Kambic等人的，“Biomaterials in Artificial Organs”，Chem.Eng.News，30(1986)，該文獻(xiàn)作為參考引入。
在上述的另外的具體方案中，式I化合物浸滲在斯坦特印模如血管內(nèi)斯坦特印模中的為(3S，4R)-7-(2-羧基-5-三氟甲基苯基)-4-羥基-3-芐基-2H-1-苯并吡喃。
用于本發(fā)明的斯坦特印模可以包括生物可降解的涂層或多孔的不能生物降解的涂層，其中分散有持續(xù)釋放的劑型。在一個選擇性的具體方案中，生物可降解的斯坦特印模也可具有浸滲在其中(即斯坦特印模基質(zhì))的式I化合物。應(yīng)用其中滲浸有式I化合物的生物可降解斯坦特印模后還可以再涂覆可生物降解涂層或者多孔的非生物可降解的涂層，其中也可以分散有持續(xù)釋放的劑型。本發(fā)明的這個具體方案將提供不同的式I化合物的釋放速率，即從該涂層較快地釋放式I化合物，接著通過斯坦特印?；|(zhì)的降解而延遲釋放浸滲在斯坦特印模基質(zhì)中的式I化合物。
在上述的另外的具體方案中，式I化合物浸滲在所述的斯坦特印模如血管內(nèi)斯坦特印模中，其中所述斯坦特印模進(jìn)一步涂有生物可降解的涂層或涂有多孔的不能生物降解的涂層，該涂層具有分散于其中的為持續(xù)釋放劑型的式I化合物。
本發(fā)明也涉及治療具有動脈粥樣硬化病變的哺乳動物主體(mammaliansubject)的動脈粥樣硬化的方法，其中包括給予所述主體治療有效量的LTB4拮抗劑，優(yōu)選小分子，更優(yōu)選含有苯基或苯并吡喃基的小分子，它們可有效減緩上述病變的發(fā)展。
在一個具體方案中，本發(fā)明涉及治療哺乳動物主體，優(yōu)選人主體中動脈粥樣硬化的方法，其中包括給予所述具有動脈粥樣硬化病變的主體治療有效量的LTB4拮抗劑，優(yōu)選小分子，更優(yōu)選包含苯基或苯并吡喃基的小分子，它們可通過提高斑穩(wěn)定性而有效地提高斑的穩(wěn)定性。
在另一個具體方案中，本發(fā)明涉及一種治療哺乳動物主體，優(yōu)選人主體動脈粥樣硬化的方法，其中包括給予所述具有動脈粥樣硬化病變的主體治療有效量的LTB4拮抗劑，其中所述的拮抗劑選自LTB4受體的抗體和LTB4基因的反義核酸(antisense)。
在另一個具體方案中，本發(fā)明涉及一種治療哺乳動物主體，優(yōu)選人主體動脈粥樣硬化的方法，其中包括給予所述具有動脈粥樣硬化病變的主體治療有效量的LTB4拮抗劑，其中按照趨化性測定，所述的拮抗劑LTB4的IC50值小于約20nM，優(yōu)選小于約10nM。
在又一個具體方案中，本發(fā)明涉及一種治療哺乳動物主體，優(yōu)選人主體動脈粥樣硬化的方法，其中包括給予所述具有動脈粥樣硬化病變的主體治療有效量的小分子，其中按照趨化性測定，所述小分子的LTB4的IC50值小于約20nM，優(yōu)選小于約10nM。
在又一個具體方案中，本發(fā)明涉及用于治療具有動脈粥樣硬化病變的哺乳動物主體，優(yōu)選人的動脈粥樣硬化的藥物組合物，其中包括有效降低所述病變發(fā)展形成的一定量的LTB4拮抗劑和藥學(xué)上可接受的載體。
在上述的另外的具體方案中，式I化合物，優(yōu)選(3S，4R)-7-(2-羧基-5-三氟甲基苯基)-4-羥基-3-芐基-2H-1-苯并吡喃)，與選自下列的一種或多種成分結(jié)合給藥(a)白細(xì)胞三烯生物合成抑制劑5-脂氧合酶(5-LO)抑制劑和5-脂氧合酶活化蛋白(FLAP)拮抗劑，選自棄白通(zileuton)；ABT-761；fenleuton；替波沙林(tepoxalin)；Abbott-79 175；Abbott-85761；N-(5-取代的)噻吩-2-烷基磺酰基胺；2，6-二-叔丁基苯酚腙；甲氧基四氫吡喃類，包括Zeneca ZD-2138；化合物SB-210661和該類化合物；包括L-739，010的吡啶基取代的2-氰基萘化合物類；包括L-746，530的2-氰基喹啉化合物類；包括MK-591，MK-886，和BAY×1005的吲哚和喹啉化合物類；(b)白細(xì)胞三烯LTB4，LTC4，LTD4和LTE4的受體拮抗劑，選自包括L-651，392的吩噻嗪-3-酮類化合物；包括CGS-25019的脒基化合物類；包括ontazolast的苯并惡唑胺類；包括BIIL 284/260的苯甲酰亞胺酰胺類；以及包括zafirlukast，ablukast，montelukast，pranlukast，verlukast(MK-679)，RG-12525，Ro-245913，iralukast(CGP 45715A)和BAY×7195的化合物類；(c)PDE4抑制劑，包括異構(gòu)體PDE4D的抑制劑；(d)5-脂氧合酶(5-LO)抑制劑或5-脂氧合酶活化蛋白(FLAP)拮抗劑；(e)5-脂氧合酶(5-LO)的二重抑制劑和血小板活化因子(PAF)的拮抗劑；(f)白細(xì)胞三烯拮抗劑(LTRAs)，包括LTB4，LTC4，LTD4和LTE4的拮抗劑；(g)抗組胺H1受體拮抗劑，包括西替立嗪(cetirizine)，氟雷他定(loratadine)，desloratadine，fexofenadine，阿司咪唑(astemizole)，氮卓斯丁(azelastine)和撲爾敏(chlorpheniramine)；(h)胃保護(hù)性H2受體拮抗劑；(i)用于減輕充血用的口服或局部給藥的α1-和α2-腎上腺素能受體激動劑血管收縮擬交感神經(jīng)劑，包括環(huán)己丙甲胺(propylhexedrine)，去氧腎上腺素(phenylephrine)，苯丙醇胺，假麻黃堿，鹽酸萘甲唑啉，鹽酸氧甲唑林(oxymetazoline hydrochloride)，酸鹽四氫唑啉，鹽酸丁芐唑啉和鹽酸乙基去甲腎上腺素；(j)與5-脂氧合酶(5-LO)抑制劑結(jié)合的α1-和α2-腎上腺素能受體興奮劑；(k)抗膽堿能藥劑，包括異丙托溴銨；tiotropium bromide；溴乙東莨菪堿(oxitropium bromide)；哌侖西平(pirenzepine)和替?zhèn)愓燮?telenzepine)；(1)β1-到β4-腎上腺素能受體興奮劑，包括異丙喘寧(metaproterenol)，異丙腎上腺素(lisoproterend)，舒喘寧(albuterol)，沙丁胺醇，福莫特羅(formoterol)，殺美特羅(salmeterol)，叔丁喘寧(terbutaline)，間羥異丙腎上腺素(orciprenaline)，比托特羅甲磺酸鹽(bitolterol mesylate)和吡布特羅(pirbuterol)；(m)methylxanthanines，包括茶堿和氨茶堿；(n)色甘酸鈉；(o)毒蕈堿受體(M1，M2和M3)拮抗劑；(p)COX-1抑制劑(NSAIDs)；COX-2選擇性的抑制劑，包括rofecoxib和氧化氮NSAIDs；(q)胰島素樣生長因子I型(IGF-1)模擬物；(r)ciclesonide；(s)具有降低全身性副作用的吸入糖皮質(zhì)激素，包括強(qiáng)的松，氫化潑尼松，氟尼縮松，丙酮縮去炎松，二丙酸倍氯米松，布地縮松(budesonide)，丙酸氟地松(fluticasone propionate)和糠酸毛他松(mometasone furoate)；(t)類胰蛋白酶抑制劑；(u)血小板活化因子(PAF)拮抗劑；(v)抗內(nèi)源炎癥性實體的單克隆抗體；(w)IPL 576；(x)抗癌壞疽因子(TNFα)，包括Etanercept，Infliximab和D2E7；(y)DMARDs，包括Leflunomide；(z)TCR肽；(aa)白細(xì)胞介素轉(zhuǎn)換酶(ICE)抑制劑；(bb)IMPDH抑制劑；(cc)粘著分子抑制劑，包括VLA-4拮抗劑；(dd)組織蛋白酶；(ee)MAP激酶抑制劑；(ff)葡萄糖-6磷酸脫氫酶抑制劑；(gg)激肽-B1-和B2-受體拮抗劑；(hh)具有各種親水基團(tuán)的金硫形式的金；(ii)免疫抑制劑，例如環(huán)孢菌素，硫唑嘌呤和甲氨蝶呤；(jj)抗痛風(fēng)劑，例如秋水仙素；(kk)黃嘌呤氧化酶抑制劑，例如別嘌醇；(ll)促尿酸尿藥，例如丙磺舒，磺吡酮和苯溴馬隆；(mm)抗腫瘤劑，特別是抗有絲分裂藥，包括長春花生物堿(Vinca alkaloids)如長春花堿(vinblastine)和長春新堿(vincristine)；(nn)生長激素促泌劑；(oo)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)抑制劑，即溶基質(zhì)素(stromelysin)，膠原酶和明膠酶，以及aggrecanase；特別是膠原酶-1(MMP-1)，膠原酶-2(MMP-8)，膠原酶-3(MMP-13)，溶基質(zhì)素-1(MMP-3)，溶基質(zhì)素-2(MMP-10)和溶基質(zhì)素-3(MMP-11)；(pp)轉(zhuǎn)化生長因子(TGFβ)；(qq)血小板衍生的生長因子(PDGF)；(rr)成纖維細(xì)胞生長因子，例如堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)；(ss)粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)；(tt)辣椒素乳劑；(uu)選自NKP-608C；SB-233412(talnetant)和D-4418的速激肽NK1和NK3受體拮抗劑；(vv)選自UT-77和ZD-0892的彈性蛋白酶抑制劑；(ww)HMG CoA還原酶抑制劑如洛弗斯特丁(Lovastatin)；(xx)Lipitor；(yy)Fibric酸如環(huán)丙貝特(ciprofibrate)和氯苯丁酯(clofibrate)；(zz)膽汁酸結(jié)合劑，如消膽胺和降脂樹脂II號；(aaa)煙酸；以及(bbb)親脂性的抗氧化劑如丙丁酚(Probucol)。
在上述中的又一具體方案中，式I化合物以式I化合物的形式給藥前體藥物。具有游離的氨基，酰胺基，羥基或羧基的式I化合物可以轉(zhuǎn)變?yōu)榍绑w藥物。前體藥物包括其中氨基酸殘基或兩個或更多(例如二、三或四個)氨基酸殘基的多肽鏈通過肽鍵的化合物，其中氨基酸殘基通過肽鍵與式I化合物的游離氨基，羥基或羧基共價連接。氨基酸殘基包括通常通過三個字母符號表示的20種天然存在的氨基酸，并且還包括4-羥脯氨酸，羥基賴氨酸，鎖鏈素(demosine)，異鎖鏈素，3-甲基組氨酸，正纈氨酸，β-丙氨酸，γ-氨基丁酸，瓜氨酸，高半胱氨酸，高絲氨酸，鳥氨酸以及甲硫氨酸砜。前體藥物也包括通過前體藥物側(cè)鏈羰基碳以共價鍵連接到上述式I化合物取代基的化合物，包括碳酸鹽，氨基甲酸酯，酰胺以及烷基酯。
發(fā)明詳述對于按照本發(fā)明的治療動脈粥樣硬化的方法而給予哺乳動物，包括人LTB4受體拮抗劑，特別是苯甲酸取代的苯并吡喃而言，可以使用各種常規(guī)途徑給藥。合適的途徑包括口服，腸胃外(例如，靜脈內(nèi)，肌內(nèi)，腹膜內(nèi)或皮下注射)，頰，直腸，鼻腔內(nèi)以及透皮給藥。一般說來，本發(fā)明化合物(下文亦稱活性物質(zhì))的給藥劑量可以在約0.5到1000毫克/天之間。
活性物質(zhì)優(yōu)選口服給藥。可是，劑量取決于被治療的主體的癥狀而需要改變。無論如何，負(fù)責(zé)給藥的人必須確定用于個體主體的合適的劑量。
活性物質(zhì)可以多種不同的劑型給藥，一般說來，在這樣的劑型中的本發(fā)明化合物的有效量為約5.0％到約70％重量比的濃度范圍。
本發(fā)明的化合物，異構(gòu)體，前體藥物以及藥學(xué)上可接受的鹽可以與藥學(xué)上可接受的載體(carrier)，賦形劑(vehicle)或稀釋劑結(jié)合，提供可用于治療哺乳動物，更優(yōu)選人類，患者動脈粥樣硬化的藥物組合物。用于這些藥物組合物的具體的載體，賦形劑或稀釋劑可以為各式各樣的形式，取決于所需的給藥類型，例如靜脈內(nèi)，口服，局部，栓劑或腸胃外，優(yōu)選口服給藥。同樣，本發(fā)明的化合物，異構(gòu)體，前體藥物及其鹽可以在任何常規(guī)劑型，如口服，腸胃外，直腸或透皮劑型中分別地或共同地給藥。
對于口服給藥，包含各種賦形劑如微晶纖維素，檸檬酸鈉，碳酸鈣，磷酸二鈣和甘氨酸的片劑可以與各種崩解劑如淀粉(優(yōu)選玉米，馬鈴薯或木薯淀粉)，藻酸和某些硅酸鹽配合物，以及粒化粘合劑(granulation binders)如聚乙烯吡咯烷酮，蔗糖，凝膠和阿拉伯膠一起使用。另外，脫模劑(lubricaring agent)如硬脂酸鎂，十二烷基硫酸鈉和滑石常常用于壓片目的。相似類型的固體組分也可作為填料在明膠膠囊中使用；在這方面優(yōu)選的原料也包括乳糖(lactose)或奶糖(milk sugar)以及高分子量聚乙二醇。當(dāng)口服給藥希望使用水懸劑和/或酏劑時，活性成分也可以結(jié)合有各種甜味劑或矯味劑，著色物質(zhì)或染料，以及根據(jù)需要加入的乳化劑和/或懸浮劑，與稀釋劑如水，乙醇，丙二醇，甘油和它們的各種相似組合一起使用。對于動物，它們可方便地包含于動物飼料或飲用水中，濃度為5-5000ppm，優(yōu)選25到500ppm。
對于腸胃外給藥(靜脈內(nèi)，肌內(nèi)，腹膜內(nèi)或皮下使用)而言，通常制備出活性成分的無菌的可注射溶液?？梢允褂帽景l(fā)明化合物在芝麻油或花生油或在含水聚乙二醇中的溶液。根據(jù)需要，該水溶液應(yīng)該適當(dāng)?shù)卣{(diào)整并且緩沖，優(yōu)選到pH大于8，并且液體稀釋劑首先應(yīng)當(dāng)是等滲的。這些含水溶液適于靜脈注射目的。含油的溶液適于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)以及皮下注射。所有這些在無菌條件下的溶液可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)的藥物技術(shù)，易于制備。對于動物，化合物可肌內(nèi)或皮下給藥，劑量水平為約0.1到50mg/kg/天，優(yōu)選0.2到10mg/kg/天，可單劑量給藥，也可以至多3次的分劑量給藥。
對于頰給藥(buccal administration)，組合物可為以常規(guī)方式配制的片劑或錠劑。
對于直腸給藥，本發(fā)明的活性物質(zhì)也可配制為直腸組合物如栓劑或停留灌腸劑，例如包含常規(guī)的栓劑基質(zhì)如可可脂或其他甘油酯的形式。
對于鼻腔內(nèi)給藥或吸入給藥，本發(fā)明的活性物質(zhì)以溶液或懸浮液形式從泵噴霧容器方便地釋放，該容器通過患者擠壓或抽吸，或者將活性物質(zhì)作為氣霧劑的形式，通過使用合適的推進(jìn)劑，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合適的氣體，從加壓容器或噴霧器中釋放。對于加壓氣霧劑，劑量單位可以通過提供閥以釋放計量量而確定。加壓容器或噴霧器可以包含活性化合物的溶液或懸浮液。用于吸入器或吹入器中的膠囊和藥筒(例如由凝膠制造)可以配制為包含本發(fā)明的化合物和合適的粉末基質(zhì)如乳糖或淀粉的粉末混合物。
對于透皮給藥，可以按照眾所周知的給藥技術(shù)制備透皮貼片，并且將其用于被治療的哺乳動物，優(yōu)選人類或狗的皮膚上，隨后活性劑憑著它的配制溶解性特征，穿過表皮，遷移進(jìn)入皮膚層(dennal layer)，在此進(jìn)入總循環(huán)，最終在所需的持續(xù)時間內(nèi)提供全身分布的活性成分。同時也包括植入物，其放置在皮膚的表皮層之下，即在被治療的患者皮膚的表皮和真皮之間。這樣一個植入物可按照眾所周知的用于這種給藥技術(shù)的原理和材料配制，并且可以制備成控制、持續(xù)和/或延遲釋放活性成分到患者的系統(tǒng)循環(huán)中的形式。這樣的表皮下(角質(zhì)層下)植入物提供了與透皮貼片相同的安裝和輸送功效，但是沒有由于暴露于患者皮膚頂層而產(chǎn)生的降解，損傷或意外移動的限制。
以下實施例部分將詳細(xì)地陳述旨在確定式I化合物，優(yōu)選(3S，4R)-7-(2-羧基-5-三氟甲基苯基)-4-羥基-3-芐基-2H-1-苯并吡喃對哺乳動物動脈粥樣硬化，特別是鼠上的效果的試驗。
本發(fā)明也將涉及將LTB4受體拮抗劑持續(xù)釋放到靶細(xì)胞的方法和劑型。適當(dāng)?shù)?，靶?xì)胞為血管平滑肌細(xì)胞，癌細(xì)胞，需要調(diào)節(jié)改善疾病狀態(tài)的體細(xì)胞以及可易受該劑型局部給藥影響的免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的疾病中的細(xì)胞。因此，本發(fā)明這方面的方法和劑型可用于抑制哺乳動物宿主中的血管平滑肌細(xì)胞，使用抑制該細(xì)胞活性(例如遷移，增殖，脂質(zhì)增殖性病變的形成，收縮，等等)但是不殺死該細(xì)胞并且任選的血管平滑肌細(xì)胞結(jié)合蛋白的LTB4受體拮抗劑。持續(xù)釋放劑型也可用于該方法的實施。
為藥學(xué)活性物質(zhì)體內(nèi)控制釋放而使用的制劑包括用成膜聚合物，蠟，脂肪，硅膠(silica)等等涂層或壓片的活性成分的固體顆粒。這些物質(zhì)用來抑制體內(nèi)活性成分的溶解，分散或吸收。羥丙基甲基纖維素為可以提供活性成分緩慢或控制釋放的成分的一個實施例。該化合物還可以經(jīng)用于透皮釋放的貼片，皮下植入物，灌流泵釋放或經(jīng)植入的持續(xù)釋放劑型釋放。
本發(fā)明方法的另一個具體方案涉及由血管內(nèi)裝置，如斯坦特印模，的表面持續(xù)釋放的方法，該裝置使用可以在一周到兩年或更長周期內(nèi)釋放本發(fā)明LTB4受體拮抗劑的賦形劑基質(zhì)。產(chǎn)品的表面涂層和注入形式可以為生物可降解的或非生物降解的聚合物或陶瓷材料，它們可以抑制纖維肌細(xì)胞的增殖和/或抑制可損害該裝置功能的脂質(zhì)堆積的劑量速率慢慢地釋放本發(fā)明LTB4受體拮抗劑。纖維肌性細(xì)胞以及它們的相關(guān)基質(zhì)，與包含泡沫細(xì)胞的脂質(zhì)一起的堆積，可以減小斯坦特印模的(內(nèi))腔區(qū)域從而顯著影響了血流以及該裝置功能衰退的程度。抑制這些增殖可以延長斯坦特印模臨床功能的壽命，有利于病人。
本發(fā)明這個具體方案的持續(xù)釋放劑型需要對該裝置表面靠近的暴露的細(xì)胞釋放足夠的抗增殖的適當(dāng)抑制細(xì)胞生長的劑量，以治療動脈粥樣硬化。它必須抑制纖維肌細(xì)胞和泡沫細(xì)胞的細(xì)胞附著、遷移和增殖。通過血管內(nèi)植入具有可變量的本發(fā)明LTB4受體拮抗劑的具體裝置和聚合物賦形劑的調(diào)節(jié)物，兩者都影響要求達(dá)到抑制細(xì)胞生長劑量的藥物釋放的速率和持續(xù)時間。斯坦特印模被認(rèn)為是永久植入裝置；可是，它可能不一定具有連續(xù)地從該裝置釋放的活性劑。最初的觀察可以發(fā)現(xiàn)，如果過度的增殖被防止直到斯坦特印模由靜止組織圍繞并且由完整的內(nèi)皮覆蓋，則LTB4受體拮抗劑的繼續(xù)釋放可以是不必要的。
本發(fā)明持續(xù)釋放劑型適當(dāng)?shù)鼗蛘邽椴豢山到獾奈㈩w粒(microparticulates)或納米顆粒(nanoparticulates)，或者為生物可降解的微顆?；蚣{米顆粒。更適當(dāng)?shù)兀撐㈩w?；蚣{米顆粒由包含通過隨機(jī)的、無酶催化的、水解分裂的生物降解的基質(zhì)的聚合物形成。合適的結(jié)構(gòu)由熱塑性聚酯(例如聚乳酸酯(lactide)或聚羥基乙酸酯(polyglycolide))或乳酸酯和羥基乙酸酯組分的共聚物的混合形成。乳酸酯/羥基乙酸酯結(jié)構(gòu)具有生物降解后形成兩個哺乳動物正常的代謝產(chǎn)物乳酸和羥基乙酸的額外的優(yōu)點。
本發(fā)明持續(xù)釋放劑型顯示在持續(xù)時段內(nèi)向靶細(xì)胞釋放LTB4受體拮抗劑的性能。本發(fā)明這樣的劑型可以是任何一種適于該目的的構(gòu)型。合適的持續(xù)釋放劑型顯示下列特征中的一個或多個1.微顆粒(例如，直徑為約0.5微米到約100微米，適宜地為約0.5到約2微米)或納米顆粒(例如，直徑為約1.0納米到約1000納米，適宜地為約50到約250納米)，自由流動的粉末結(jié)構(gòu)；2.設(shè)計能在從約3到約180天，適宜地為約10到約21天的時期內(nèi)的生物降解的生物可降解的結(jié)構(gòu)，或者在從約3到約180天，優(yōu)選從約10到約21天之間的時期允許LTB4受體拮抗劑擴(kuò)散而出現(xiàn)的非生物降解的結(jié)構(gòu)；3.正在給藥的劑型的局部生理環(huán)境與靶組織之間的生物相容性，包括生物相容的生物降解產(chǎn)物；4.促進(jìn)穩(wěn)定和可再現(xiàn)的分散其中的LTB4受體拮抗劑以適當(dāng)?shù)匦纬蒐TB4受體拮抗劑-聚合物基質(zhì)，而LTB4受體拮抗劑通過一個或兩個下列途徑釋放(1)通過劑型而擴(kuò)散LTB4受體拮抗劑(當(dāng)LTB4受體拮抗劑溶于聚合物或聚合物混合物形成劑型時)；或(2)因劑型生物降解而釋放LTB4受體拮抗劑；以及能與一種或多種細(xì)胞和/或間隙基質(zhì)表位結(jié)合的能力，適當(dāng)?shù)貫榧s1到約10,000結(jié)合蛋白/肽-劑型結(jié)合，更適當(dāng)?shù)貫槊?50平方埃的顆粒表面積最多為約1個結(jié)合肽-劑型的結(jié)合。結(jié)合的總數(shù)取決于使用的粒子大小。如本文所述，結(jié)合蛋白或肽能夠與微粒劑型通過共價配位體夾入兩層中間或非共價的形式聯(lián)系在一起。
例如，使用1)n-溶劑乳化-蒸發(fā)技術(shù)或者2)乳化-沉淀技術(shù)，可由可生物降解的聚合物包括聚(D，L-乳酸)PLA，聚(D，L-乳酸-共-乙醇酸)PLGA，甲基丙烯酸共聚物，聚(ε-己內(nèi)酯)制備包含式I化合物的納米顆粒。這些步驟涉及聚合物在有或者沒有共溶劑，典型地為二氯甲烷，的存在下在有機(jī)溶劑(例如，丙酮或苯甲醇)中的分散。式I化合物包含在有機(jī)溶劑中。在某些情況下，將溶劑混合，然后在機(jī)械攪拌或超聲處理下，滴入含穩(wěn)定的水狀膠質(zhì)[例如，聚(乙烯醇)或凝膠](即，水包油型)的水溶液中。形成穩(wěn)定的乳液后，通過蒸發(fā)攪拌的乳劑除去氯化溶劑，得到納米顆粒，然后通過切向過濾或通過離心作用/再懸浮重復(fù)洗滌物可以除去有機(jī)溶劑。所得含水懸浮劑在有或沒有糖類或其他防凍劑的情況下冷凍以及冷凍干燥，得到能夠隨簡單的攪動或超聲處理重懸浮在生理食鹽溶液中的納米顆粒。
或者，可在攪動或超聲處理下將水溶液加入沒有氯化溶劑的有機(jī)相(即，油包水乳劑)中，接著進(jìn)一步加入含水溶液到達(dá)到相轉(zhuǎn)化，沉淀出納米顆粒?；蛘?，可以通過在水溶劑中加入鹽析劑而增加沉淀。典型地，對于乳化-蒸發(fā)技術(shù)，750mg PLGA可以溶于30ml二氯甲烷中。適當(dāng)?shù)?，加入?5mg式I化合物的5ml二氯甲烷。使用15-55瓦輸出的超聲波儀超聲處理，將該有機(jī)相滴加入180ml 2.5％聚(乙烯醇，PVP)(20-70 kD mol Wt.)含水溶液中，持續(xù)大約10分鐘后，得到溶解的乳劑。在不超過15℃的溫度下在冰浴中進(jìn)行超聲處理。然后，將該乳劑在室溫下進(jìn)一步攪拌24小時，蒸發(fā)氯化溶劑。使用具有100mm孔隙的聚烯烴筒式過濾器的過濾裝置進(jìn)一步純化所得納米顆粒。對于乳化-沉淀技術(shù)，在1200-5000rpm的機(jī)械攪拌下，將10μl含水PMP(10-30％w/w)加入5mL含10-15％w/w聚合物PLA或PLGA以及10-15w/w式I化合物的苯甲醇中，在5分鐘內(nèi)形成水包油型乳狀液。然后加入水(160mL)引起相轉(zhuǎn)化，在隨后的10分鐘內(nèi)，導(dǎo)致有機(jī)溶劑擴(kuò)散進(jìn)入水中，伴隨沉淀出為固體納米顆粒的聚合物。
動脈粥樣硬化病變的形成可以出現(xiàn)在五個階段中
1.遷移(migration)。在一個健康的血管(vessel)中，大部分或全部平滑肌細(xì)胞(SMC)都含于血管中層中。在病變形成期間，膨大的內(nèi)膜(enlarged intima)中出現(xiàn)SMC，因此需要SMC從該中層遷移到血管的內(nèi)膜。抑制該SMC遷移將顯著地改變病變的性質(zhì)，并且可以改善與病變形成有關(guān)的病理。
2.脂質(zhì)堆積(lipid accumulation)。在健康的血管壁中內(nèi)側(cè)的SMC不顯著地堆積脂質(zhì)。可是，內(nèi)膜SMC具有增加脂質(zhì)攝取以及存儲的能力。當(dāng)處于循環(huán)脂質(zhì)(特別是低密度脂蛋白；LDL)量增加的條件下時，SMC可以被含脂肪脂質(zhì)飽和并且死亡。脂質(zhì)的堆積是病變發(fā)展到臨床意義所必需的，因為它形成病變的血栓壞死核心。抑制SMC中的脂質(zhì)堆積可降低或防止病變發(fā)展，從而降低或防止動脈粥樣硬化以及由此產(chǎn)生的心肌梗死。
3.炎性細(xì)胞的補(bǔ)充(recruitment of inflammatory cells)。人類病變包含許多巨噬細(xì)胞-衍生的細(xì)胞。該補(bǔ)充步驟、這些細(xì)胞的功能以及它們對病理的影響尚不清楚。一個過于簡化的機(jī)制顯示巨噬細(xì)胞被吸引到在病變中堆積的脂質(zhì)上，以從血管壁除去脂質(zhì)。雖然對巨噬細(xì)胞衍生的細(xì)胞補(bǔ)充進(jìn)行抑制，可能降低病變病理，但是同時它也可以加速發(fā)展至脂質(zhì)填充的易于破裂的狀態(tài)。
4.增殖(proliferation)。在很多情況下，內(nèi)膜SMC堆積伴隨有內(nèi)側(cè)薄化。因此，在該病變位點SMC總數(shù)不會顯著地增加。此外，動脈粥樣硬化的慢性性質(zhì)使得難以檢測出這些病變中的增殖的刺激作用。
5.細(xì)胞外基質(zhì)沉積(extracellular matrix deposition)。動脈粥樣硬化病變也富含有細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，特別是膠原纖維。ECM合成增加可以增加斑穩(wěn)定性。早期的斑破裂，可導(dǎo)致心肌梗死，與低ECM沉積和所得的覆蓋病變的壞死的富含脂質(zhì)核心的纖維帽(fibrous cap)的削弱有關(guān)。
因此，動脈粥樣硬化涉及各過程的復(fù)雜的相互作用，然而其中有一些可以是未經(jīng)確認(rèn)的。目標(biāo)為一個單一過程的努力治療動脈粥樣硬化取決于對各過程對已證明病理學(xué)的相對貢獻(xiàn)的認(rèn)識。為此，適宜采取協(xié)作的策略。一個典型的策略涉及抑制SMC遷移、脂質(zhì)堆積以及增殖，可能的有益效果是增加ECM沉積。
用于治療動脈粥樣硬化本發(fā)明方法中的式I化合物可以按照下文流程中說明的方法制備。除非另外指出，下面的流程以及隨后的論述中的R1，R2，R3，R5和R6定義如上。下列流程以及隨后的描述了式I-XIX化合物的制備。下列流程以及隨后的描述也適用于式I-XIX化合物的對映體。流程1 流程1(續(xù)) 流程2 流程3 流程4
總的說來，流程1中的合成過程涉及將手性輔助基團(tuán)Xc與包含R1的化合物I的連接(步驟1)，與醛III的不對稱羥醛縮合(步驟2或2′)，從羥醛IV還原除去手性輔助基團(tuán)(步驟3)，堿介導(dǎo)環(huán)化二醇V(步驟4)，鋰化和硼化鹵代苯并吡喃醇VI(步驟5)，將硼酸VII與芳鹵烴或磺酸酯VIII偶聯(lián)(步驟6)，以及水解酯IX(步驟7)。
流程1的步驟1演示了在大約-80到0℃，優(yōu)選-78到-55℃的溫度下，在約20分鐘到一小時的時間內(nèi)，在非質(zhì)子溶劑如醚溶劑，優(yōu)選四氫呋喃(THF)中，通過用適當(dāng)?shù)膹?qiáng)堿，如烷基鋰堿，優(yōu)選丁基鋰處理，將手性輔助基團(tuán)HXc轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的陰離子。取代基Xc為在不對稱羥醛縮合反應(yīng)中適合于控制相對和絕對立體化學(xué)的手性輔助基團(tuán)。HXc的例子包括(R)-4-芐基-2-惡唑烷酮，(S)-4-芐基-2-惡唑烷酮，(4R，5S)-4-甲基-5-苯基-惡唑烷-2-酮和(4S，5R)-4-甲基-5-苯基-惡唑烷-2-酮。在相同的溶劑中，在大約-80到0℃，優(yōu)選約-75℃的溫度下，在約一小時內(nèi)，將所得的陰離子用?；瘎㊣處理，其中基團(tuán)W為鹵素，優(yōu)選氯，而R1定義如上，然后溫?zé)嶂链蠹s-20到20℃，優(yōu)選約0℃，之后用水溶液、優(yōu)選用碳酸氫鈉水溶液處理，得到?；说氖中暂o助試劑II。
流程1的步驟2演示了“Evans羥醛”反應(yīng)，其條件類似于Evans，D.A.；Bartroli，J.；Shih，T.L，J.Am.Chem.Soc.1981，103，2127以及Gage，J.R.；Evans，D.A.，Org.Syn.1989，68，83所述，其中兩者都作為參考文獻(xiàn)引入本申請。特別是，在流程1的步驟2中，用路易斯酸、堿以及取代的苯甲醛III處理酰化的手性輔助試劑II，得到具有高度立體選擇性的醇IV。苯甲醛III上取代有鄰位取代基Y，該取代基在環(huán)化步驟4中用作離去基團(tuán)，基團(tuán)X(對于流程2而言為X′，特別是在流程2的偶合步驟4中)在偶聯(lián)步驟6中被芳基側(cè)鏈取代，取代基R2定義如上。取代基X(對于流程2而言為X′)連接在苯甲醛III的苯基部分的4或5位上。離去基團(tuán)Y典型地為鹵素或硝基，X是鹵素(并且對于流程2而言，X′為鹵素或C1-C4全氟烷基磺酸根)。為了制備羥醛產(chǎn)物IV，在約-78至約40℃、優(yōu)選-5℃的溫度下，在約20分鐘的時間內(nèi)，在非質(zhì)子溶劑如二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、甲苯或二乙醚中，將?；氖中暂o助劑II用硼鹵化物或磺酸化物如二烷基硼磺酸鹽、優(yōu)選三氟甲磺酸二丁基硼處理，接下來再在約-78至約40℃、優(yōu)選-5至5℃的溫度下，在約1小時的時間內(nèi)，用叔胺堿如三乙胺或二異丙基胺，優(yōu)選三乙胺處理。在約-100到0℃，優(yōu)選約70℃的溫度下，在約30分鐘內(nèi)，將該混合物用取代的苯甲醛III處理。在約1小時的時間內(nèi)，將該混合物溫?zé)嶂良s-20到25℃，優(yōu)選約-10℃，然后在低于約15℃的溫度下，用質(zhì)子氧化猝滅，優(yōu)選通過連續(xù)加入pH7緩沖溶液、甲醇以及過氧化氫水溶液而進(jìn)行，最后得到醇IV。
流程1的步驟2’演示了選擇性的并且是優(yōu)選的使用含鈦路易斯酸提供醇IV的方法。在流程1的步驟2′中，在約-80至0℃，優(yōu)選-80至-70℃的溫度下，在約30分鐘內(nèi)，在非質(zhì)子溶劑如二氯甲烷、1，2-二氯乙烷或甲苯，優(yōu)選二氯甲烷中，用鹵化鈦(IV)、優(yōu)選四氯化鈦處理酰化的手性輔助試劑II，然后再攪拌約30分鐘，接著在約-80至0℃，優(yōu)選-80至-65℃的溫度下，在約30分鐘內(nèi)，用叔胺或叔二胺堿、如三乙胺或N，N，N′，N′-四甲基乙二胺、優(yōu)選N，N，N′，N′-四甲基乙二胺處理。接下來，任選地并優(yōu)選地，在約-80至0℃，優(yōu)選-80至-65℃的溫度下，用供電子配位體如1-甲基-2-吡咯烷酮、二甲基甲酰胺、1，3-二甲基-3，4，5，6-四氫-2(1H)-嘧啶酮、磷酸三乙酯或2，2′-聯(lián)吡啶，優(yōu)選1-甲基-2-吡咯烷酮處理，接著攪拌約30分鐘。將該混合物在約-100至0℃，優(yōu)選-80至-65℃的溫度下，在約30分鐘內(nèi)，用取代的苯甲醛III處理，并且在約1至24小時，優(yōu)選約4小時內(nèi)，使其溫?zé)嶂?30至30℃，優(yōu)選0至25℃。在-30至30℃，優(yōu)選0至25℃的溫度下，用質(zhì)子溶劑猝滅處理，優(yōu)選含水氯化銨猝滅該混合物，得到醇IV。在用供電子配位體處理時，在某些情況下，提供的醇IV為與給體配位體的結(jié)晶溶劑化物。在約20℃的溫度下，攪拌具有固體載體如硅藻土(Celite)的猝滅反應(yīng)混合物約12小時，改進(jìn)反應(yīng)混合物的過濾，除去鈦副產(chǎn)物。
流程1的步驟2′的鈦羥醛條件是優(yōu)選的，并且比流程1的步驟2的硼羥醛條件操作上更簡單，因為它們避免了在制備路易斯酸二丁基硼三氟磺酸鹽時使用自燃的試劑三丁基硼、腐蝕性試劑三氟磺酸以及它們的放熱組合。
此外，與文獻(xiàn)如Evans，D.A.；Rieger，D.L；Bilodeau，M.T.；Urpi，F(xiàn).的J.Am.Chem.Soc.(1991，113，1047)，流程1步驟2′的鈦羥醛條件提供小于兩當(dāng)量醛III的高選擇性。優(yōu)選地，該步驟中使用約一當(dāng)量的醛III。本申請用于醛III或式R11C(O)H(權(quán)利要求中所述)時使用的短語“約一當(dāng)量”表示該化合物小于1.5當(dāng)量。在上述Evans等人的文章中，據(jù)報道在類似于流程1步驟2′的鈦羥醛反應(yīng)中需要使用兩當(dāng)量的醛。
除在制備式X化合物中具有實用性之外，流程1的步驟2′的鈦羥醛條件也可用于制備英國專利申請2,270,914(公開于1994年3月30日)以及B.D.Dorsey等在Tetrahedron Letters(1993，34(12)，1851)中描述的HIV蛋白酶抑制劑化合物。流程4的反應(yīng)可用于制備上述英國專利申請描述的HIV蛋白酶抑制劑化合物，其中R11是C1-C9烷基或C2-C9烯基，優(yōu)選3-環(huán)己基丙烯基。特別地，流程4說明了其中R11為C1-C9烷基、C2-C9烯基或在2位由Y取代的苯基，在4或5位的X，以及苯基其余位置的R2(其中Y，X和R2定義如上)的醛XVIII的鈦羥醛反應(yīng)的應(yīng)用。流程4的反應(yīng)條件與對上面流程1步驟2′描述的相同。醛XVIII包含流程1的醛III，而醇XIX包含流程1的醇IV。
以下表1說明流程1步驟2′的產(chǎn)物(或流程4的產(chǎn)物)如何取決于所使用的反應(yīng)條件而變化，特別是怎樣通過將TMEDA的量從1.2增加到3當(dāng)量以及通過加入2當(dāng)量NMP而增加非對映異構(gòu)選擇性。參見表1，1.0當(dāng)量的醛RCHO用于各反應(yīng)中，x和y分別表示堿和NMP的當(dāng)量，NMP表示1-甲基-2-吡咯烷酮，TMEDA表示N，N，N′，N′-四甲基乙二胺，NEtiPr2表示二異丙基乙胺，非對映體的比率由HPLC測定。羥醛異構(gòu)體按照類似于Van Draanen，N.A.；Arseniyadis，S.；Crimmins，M.T.；Heathcock，C.H.等在J.Org.Chem.(1991，56，2499)和Gage，J.R.；Evans，D.A.等在Org.Syn.(1989，68，83)中描述的方法，用LiOH/H2O2水解而分離和轉(zhuǎn)化為羧酸異構(gòu)體來鑒別。所需的異構(gòu)體以黑體指示。 表1
流程1的步驟3演示了按照類似于Penning，T.D.；Djuric，S.W.；Haack，R.A.；Kalish，V.J.；Miyashiro，J.M.；Rowell，B.W.；Yu，S.S.在Syn.Commun.(1990，20，307)(該文獻(xiàn)作為參考引入本文)中描述的方法除去手性輔助基團(tuán)Xc(其可任選地再次用于步驟1中)，以及將式IV化合物(酸量)還原至所需的醇V的過程。在該過程中，在醚溶劑如THF、二異丙基醚或四基叔丁基醚，優(yōu)選THF中，其中通常包含質(zhì)子溶劑如水、乙醇或異丙醇，在約-78℃至回流溫度，優(yōu)選0℃至室溫(20-25℃)的溫度下，用氫化物還原劑如硼氫化鋰、氫化鋰鋁、氫化硼鈉、氫硼化鈣，優(yōu)選硼氫化鋰處理醇IV。在1至24小時，通常為12小時后，用水以及任選加入的過氧化氫猝滅反應(yīng)。通過在有機(jī)溶劑如二異丙基醚或乙酸乙酯和己烷的混合物中將二醇V的溶液選擇性沉淀或萃取HXc進(jìn)入酸、優(yōu)選鹽酸的水溶液中而恢復(fù)使用手性輔助劑HXc，接下來用堿中和酸性提取物水溶液，并將HXc萃取進(jìn)入有機(jī)溶劑中。
流程1的步驟4演示了分子內(nèi)的芳族取代，其中二醇V中的伯羥基置換鄰位的離去基團(tuán)Y產(chǎn)生式VI的苯并吡喃環(huán)狀系。特別地，在非質(zhì)子溶劑如THF、二甲亞砜或1-甲基-2-吡咯烷酮，優(yōu)選THF中，任選地在外加銅鹽的存在下，在室溫到130℃，優(yōu)選約70℃的溫度下，在1至24小時，通常為約4小時內(nèi)，將其中離去基團(tuán)Y為鹵素或硝基，優(yōu)選為氟基的二醇V用堿如叔丁醇鉀、雙(三甲基甲硅烷基)酰胺鈉、雙(三甲基甲硅烷基)酰胺鉀、碳酸銫或氫化鈉，優(yōu)選叔丁醇鉀處理，得到苯并吡喃醇VI。在苯并吡喃醇VI中，取代基X(或者對于流程2為X′)連接在苯并吡喃環(huán)的6或7位。
流程1的步驟5演示了苯并吡喃醇VI中的取代基X轉(zhuǎn)化為鋰，然后轉(zhuǎn)化為硼酸根的過程。對于鋰化，優(yōu)選首先用甲基鋰處理苯并吡喃醇VI，形成烴氧基鋰，接著用丁基鋰處理，形成芳基鋰。在該過程中，在醚溶劑，優(yōu)選四氫呋喃中，在-78至0℃，優(yōu)選-70至-65℃的溫度下，在約1小時內(nèi)，將其中X是鹵素優(yōu)選溴或碘的苯并吡喃醇VI用兩當(dāng)量烷基鋰，優(yōu)選首先用一當(dāng)量甲基鋰，接著用一當(dāng)量丁基鋰處理，接著在-78至0℃，優(yōu)選-70至-65℃的溫度下，在約30分鐘內(nèi)，用硼化試劑如甲硼烷-四氫呋喃復(fù)合體、三異丙基硼酸酯或硼酸三甲酯，優(yōu)選甲硼烷-THF復(fù)合體，處理所得產(chǎn)物，然后在約-65℃至室溫，優(yōu)選在大約0℃的溫度下，用水或者任選的酸水溶液猝滅，得到硼酸VII，其中硼酸部分連接在苯并吡喃環(huán)的6或7位。
流程1的步驟6演示了硼酸VII和化合物VIII之間的Suzuki偶聯(lián)以形成化合物IX的聯(lián)芳基鍵的過程。在化合物VIII中，Z為鹵化物或磺酸根，優(yōu)選為溴化物、碘化物或三氟甲烷磺酸根，R4為C1-C6烷基，R3定義如上。該過程類似于Miyaura，N.；Suzuki，A.在Chem.Rev.(1995，95，2457)描述的方法，該文獻(xiàn)作為參考引入本文。由于難于大規(guī)模地制備有機(jī)鋅以及有機(jī)錫化合物的毒性，該過程優(yōu)選用于鋅或錫的偶合。在該過程中，將硼酸VII、芳烴VIII、鈀催化劑如四(三苯基膦)鈀(O)、二氯二(三苯基膦)鈀(II)、醋酸鈀(II)、烯丙基鈀氯化物二聚物、三(二亞芐基丙酮)二鈀(O)或10％鈀-碳，優(yōu)選10％鈀-碳，以及堿或氟化物鹽類如碳酸鈉、三乙胺、碳酸氫鈉、碳酸銫、磷酸三鉀、氟化鉀、氟化銫或四丁基氟化銨，優(yōu)選氟化鉀，在任選含水的溶劑如乙醇、二甲氧基乙烷或甲苯，優(yōu)選乙醇中的混合物，在室溫到130℃，優(yōu)選回流溫度的溫度下攪拌約1至約24小時，優(yōu)選約三個小時，得到聯(lián)芳基IX，其中芐基酯部分連接在苯并吡喃環(huán)的6或7位。
流程1的步驟7演示了在醇溶劑如異丙醇中，在40℃到回流溫度，優(yōu)選回流溫度的溫度下，在約1至約24小時，優(yōu)選約6小時內(nèi)，用含水氫氧化物堿如含水氫氧化鈉處理酯IX的過程。將該反應(yīng)混合物冷卻至室溫，在含水堿和有機(jī)溶劑如己烷和異丙基醚的混合物之間進(jìn)行分配。將該水溶液酸化，將最終化合物X萃取進(jìn)入有機(jī)溶劑如乙酸乙酯中。用有機(jī)溶劑萃取化合物X的方法除去了中性雜質(zhì)，它對該合成的最后步驟特別有利。
為了便于處理羧酸X，可以在溶劑如甲苯中，使用式NHR5R6的仲胺(其中R5和R6定義如上)處理該化合物，形成下式的甲酸銨 其中R1、R2、R3、R5和R6定義如上。在溶劑如乙酸乙酯、甲苯或二氯甲烷，優(yōu)選乙酸乙酯中，在0℃至室溫的溫度下，用酸的水溶液如鹽酸或硫酸，優(yōu)選鹽酸的水溶液處理甲酸銨XVII30分鐘至3小時，優(yōu)選1小時，提供羧酸X。
流程2演示了可代替流程1步驟5和6的偶合過程。流程2的過程為優(yōu)選的。流程2的步驟1中是用醇R4OH(其中R3和R4定義如上)酯化羧酸XI，生成酯XII。在該步驟中，在溶劑如甲苯、二氯甲烷或二氯乙烷，優(yōu)選甲苯中，在0℃至回流溫度，優(yōu)選回流溫度的溫度下，在1至24小時，通常為4小時內(nèi)，用醇R4OH，優(yōu)選伯醇或仲醇如2，2-二甲基丙醇和酸如硫酸、鹽酸、甲磺酸、甲苯磺酸或樟腦磺酸，優(yōu)選硫酸，處理羧酸XI，得到酯XII。
流程2的步驟2演示了用堿處理酯XII，用三烷基硼酸酯截留所得鄰位金屬化物，得到硼酸酯XIII的過程。在流程2的步驟3中，按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法水解硼酸酯XIII，得到相應(yīng)的硼酸XIV。在流程2的步驟2和3中，在三(C1-C4烷基)硼酸酯如三異丙基硼酸酯、三乙基硼酸酯或硼酸三甲酯，優(yōu)選三異丙基硼酸酯的存在下，在醚溶劑如THF、二異丙醚、二惡烷或甲基叔丁基醚，優(yōu)選THF中，在約78℃至室溫(20-25℃)，優(yōu)選0℃的溫度下，用金屬酰氨化物(amide)堿如二異丙基酰氨化鋰、二乙基氨化鋰、2，2，6，6-哌啶鋰或(2，2，6，6-四甲基哌啶基)鎂，優(yōu)選二異丙基酰氨化鋰處理酯XII。10分鐘至5小時，通常為1小時之后，用酸的水溶液猝滅反應(yīng)，得到硼酸XIV。
為了便于在流程2的步驟4之前處理硼酸XIV，可將硼酸XIV與流程3中說明的氨基二醇起反應(yīng)。在流程3中，在0℃至回流溫度，優(yōu)選室溫的溫度下，在溶劑如異丙醇、乙醇、甲醇、己烷、甲苯或上述溶劑的結(jié)合，優(yōu)選異丙醇中，將硼酸XIV與氨基二醇XV(其中R8、m和n定義如上)反應(yīng)15分鐘至10小時，優(yōu)選10小時，得到胺配合物XVI。為了進(jìn)行流程2的步驟4，按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法將胺配合物XV水解為硼酸XIV。這樣的方法包括使用酸的水溶液，如鹽酸。
流程2的步驟4演示了在硼酸XIV和苯并吡喃醇VI之間進(jìn)行Suzuki偶聯(lián)以形成IX的聯(lián)芳基鍵的過程。在該過程中，制備包含下列的混合物硼酸XIV，苯并吡喃醇VI，鈀催化劑如四(三苯基膦)鈀(O)、二氯二(三苯基膦)鈀(II)、醋酸鈀(II)、烯丙基鈀氯化物二聚物、三(二亞芐基丙酮)二鈀(O)或10％鈀-碳，優(yōu)選四(三苯基膦)鈀(O)，堿或氟化物鹽類如碳酸鈉、三乙胺、碳酸氫鈉、碳酸銫、磷酸三鉀、氟化鉀、氟化銫、氫氧化鈉、氫氧化鋇或四丁銨氟化物，優(yōu)選碳酸鈉，以及溶劑如任選含水的甲苯、乙醇、乙二醇二甲醚，優(yōu)選含水甲苯。在按照流程1制備的苯并吡喃醇VI中，連接在苯并吡喃環(huán)6或7位的X′表示鹵素或C1-C4全氟烷基磺酸根，優(yōu)選溴化物、碘化物、三氟甲烷磺酸根。將該混合物在室溫到回流溫度，優(yōu)選回流溫度的溫度下攪拌約10分鐘至約6小時，優(yōu)選1小時，得到聯(lián)芳基IX。
流程2的步驟5說明了酯IX水解得到如流程1的步驟7所述的羧酸X的過程。
式I化合物的鹽可以常規(guī)方式，通過與堿如堿金屬氫氧化物，例如氫氧化鈉，或堿土金屬氫氧化物，例如氫氧化鎂反應(yīng)而制備。
實施例通過參考下列具體實施例將更好地理解本發(fā)明。
小鼠細(xì)胞系衍生。用于本發(fā)明研究的遺傳修飾的載脂蛋白E-缺陷型(ApoE-/-)、低密度脂蛋白(LDL)受體-缺陷型(LDLr-/-)以及單核細(xì)胞化學(xué)引誘物蛋白-1-缺陷型(MCP-1-/-)的小鼠先前已經(jīng)描述并且鑒定[參見Rutledge，B.J.等人，J.Immunol.，1995；1554838-4843；以及Nakashima Y.等人，Arterioscler.Thromb.，1994；14(1)133-140]。為了得到apoE和MCP-1(ScyA2)無效等位基因純合小鼠，使雄性C57B/6背景(C57E-/-)的ApoE-/-小鼠與雜合的雌性C57B/6背景的MCP-1-/-小鼠交配。通過Southern印跡分析鑒定所得ApoE-/-x MCP-1-/+子代，并將其近親交配產(chǎn)生ApoE-/-x MCP-1-/-(C57E-/-xMCP-1-/-)和對照的ApoE-/-x MCP-1+/+(C57E-/-)小鼠。混合遺傳背景12901a xC57B/6(129E-/-)的ApoE-/-小鼠內(nèi)部繁殖，來源于兄弟姐妹交配。所有的小鼠在21天斷奶，保持12小時光照/避光周期，喂服食物或西方型飲食[參見，Bourassa，P.K.等人，Proc Nail Acad.Sci.USA，1996；9310022-10027]。
化合物給藥。使用35天治療流程評價式I化合物，優(yōu)選(3S，4R)-7-(2-羧基-5-三氟甲基苯基)-4-羥基-3-芐基-2H-1-苯并吡喃)對年齡配比組小鼠(15至30周齡時處死)病變發(fā)展的影響。在較短時間7-14天內(nèi)用(3S，4R)-7-(2-羧基-5-三氟甲基苯基)-4-羥基-3-芐基-2H-1-苯并吡喃)處理小鼠亞群，評價如表和圖例指出的組織基因表達(dá)方面的急劇變化。在所有研究組中，化合物通過每日一次的強(qiáng)飼法口服給藥，化合物處于由PBS中的0.6％Tween 80+0.25％甲基纖維素組成的賦形劑中。小鼠或者單獨(dú)接受30mg/kg/天的賦形劑，或者接受100mg/kg/天的式I化合物。
CD11b FACs 分析。處理期后，將小鼠用酮胺(ketamine)xylazinePBS(1∶1∶2)麻醉，使用含7.5％EDTA的真空容器從腹主動脈收集全血樣品。按照先前的描述進(jìn)行血液單核細(xì)胞CD11b表達(dá)測定[參見Showell H. J.等人，Journal of Pharmacoloty and Experimental Therapeutics，1995；273176-184]。將細(xì)胞通過溫和的離心作用(1200rpm，2分鐘)沉淀，在室溫下用50μg/ml結(jié)合熒光素的大鼠抗小鼠CD11b IgG(Pharmingen)培養(yǎng)30分鐘。對于非特異性結(jié)合的對照組，用50μg/ml熒光素共軛的大鼠IgG培養(yǎng)副份樣品。培養(yǎng)30分鐘后，用一毫升HiFAZ緩沖液洗滌細(xì)胞，并沉淀，并且在室溫下用裂解緩沖液(Becton Dickinson，Mountain View，CA)裂解紅血細(xì)胞10分鐘。然后沖洗細(xì)胞兩次，再懸浮于HiFAZ緩沖液中，使用FACs流動血細(xì)胞計數(shù)器測定熒光度。以列表方式收集數(shù)據(jù)，通過比較前向散射與側(cè)向散射斑點印跡定義巨噬細(xì)胞柵(macrophage gates)。
血漿脂蛋白和脂質(zhì)。按照以前的描述[參見Bourassa，P K.等人，Proc Natl.Acad.Sci.USA，1996；9310022-10027]，使用快速蛋白質(zhì)液相層析(FPLC，Pharmacia LKB Biotechnology，Inc.，Piscatawy，NJ)分離血漿脂蛋白。用市場上可買到的膽固醇/HP(Boehringer-Mannheim)和甘油三酯G(Wako Chemical)試劑盒，使用比色法測量總的血漿膽固醇和甘油三酯。
主動脈樹分析。在某些實驗中，用4％多聚甲醛灌注-固定小鼠，除去全部主動脈樹，包括頭臂區(qū)域和頸動脈，鎖骨和股骨分枝。去除組織外膜，展鋪在一塊聚苯乙烯上，使用安裝在拷貝臺上的CCD攝像機(jī)得到數(shù)字圖象。除去頸動脈和鎖骨分枝，分離頭臂區(qū)域用于另外的步驟。按照先前描述[參見Bourassa，P K.等人，Proc Natl Acad.Sci.USA，1996；9310022-10027]使用En face制劑測定主動脈樹其余部分中的病變覆蓋的主動脈的表面百分率。通過單槍三束彩色顯象管監(jiān)視器上的直射影像俘獲和顯示評價病變區(qū)域的各主動脈。使用ImagePro 3.1圖像分析(Image Processing Solutions，Wobum，MA)測定未染色組織中的病變區(qū)域。比較半透明的非病變區(qū)域，清除掉外膜的主動脈中的動脈粥樣硬化斑點區(qū)域出現(xiàn)淺黃色-白色不透明區(qū)。根據(jù)黑色(背景)，灰色(正常的組織)和白色(病變區(qū)域)的漸變，通過人工置位閾定量該區(qū)域。
病變分析。為了測定截面的病變區(qū)域，按照先前描述[參見Borgeat P.等人，J.Biol.Chem.，19792542643-2646]將心臟在4％多聚甲醛中灌注固定，在4℃用30％樹膠蔗糖滲透24小時，在-18℃，包埋在OCT化合物中并且切片10μm，切片用油紅O染色(Polyscientific，Bay Shore NY)，用GillIII蘇木精(Sigma，St.Louis MO)復(fù)染色。通過將安裝Leitz Laborlux(Leica)光學(xué)顯微鏡的RGB照相機(jī)直接俘獲影像并顯示在單槍三束彩色顯象管RGB監(jiān)視器上評價主動脈瓣各個切片。按照先前描述[參見Bourassa，P.K.等人，Proc Natl.Acad.Sci.USA，19969310022-10027]使用ImagePro 3.1′軟件進(jìn)行圖像分析。結(jié)果用每個切片病變大小平均數(shù)或用油紅O染色的血管壁截面總數(shù)的百分率來表示。對于各個動物測定12-16切片的病變面積平均數(shù)，數(shù)據(jù)用病變大小或病變面積平均百分比±S.D來表示。
巨噬細(xì)胞免疫組織化學(xué)的染色。對于使用針對MOMA-2(BioSource)和CD11b(Pharmingen)的大鼠單克隆抗體(1gG2b)的巨噬細(xì)胞，連續(xù)的多聚甲醛固定的，OCT包埋的主動脈瓣切片被免疫染色。通過用抗生物素蛋白/生物素溶液(Vector Laboratories)，1％牛血清中的0.3％H2O2分別培養(yǎng)各個切片，阻斷內(nèi)源的生物素和過氧化物酶的活性。所使用的大鼠-抗小鼠MOMA-2的濃度為25/ml，而大鼠-抗小鼠CD11b的濃度為(5μg/ml)。用初級抗體培養(yǎng)，接著生物素化的輔助抗大鼠次級抗體IgG(1.4μg/ml，Jackson ImmunoResearch)，并且用辣根過氧化酶共軛的抗生蛋白鏈菌素(1∶500)培養(yǎng)。非特異性的大鼠1gG2b抗體(Pharmingen)用作陰性對照。用DAB(Vector Laboratories)檢驗抗體結(jié)合，所有切片Gill III蘇木精復(fù)染色。結(jié)果用DAB染色的血管壁總截面積(正常的+患病的區(qū)域/切片，排除空腔)的百分率來表示。
腹膜巨噬細(xì)胞趨化性測定。在研究終點，用一毫升無菌的6％酪蛋白腹膜下注射來自各組的小鼠亞群，四天后通過用Hanks Balanced Salt SolutionsHBSS(Life Technologies)洗滌腹膜腔收獲腹腔滲出細(xì)胞，補(bǔ)充1％胎牛血清(FBS)。然后用添加0.1％牛血清清蛋白BSA的RPMI-1640將腹壁細(xì)胞洗滌三次。對于趨化性，將細(xì)胞懸浮在濃度為2×106細(xì)胞/ml的趨化性緩沖液(補(bǔ)充0.1％BSA的RPMI-1640和20mM HEPES(pH 7.4))。細(xì)胞懸液裝入48孔微趨向室的上室。將鼠科動物MCP-1(10nM或LTB4(10nM)加入下室，下室通過5-μm聚碳酸酯膜與上室分離。將附著于膜的下面的腹膜巨噬細(xì)胞固定并使用Diff-Quick染色試劑盒(stain set)(Dade Behring Inc，Switzerland)并且染色。結(jié)果用在三份重復(fù)樣品中的四高功率場遷移的平均細(xì)胞數(shù)表示。
統(tǒng)計學(xué)。通過不成對的斯氏t檢驗法使用StatView統(tǒng)計程序(AbacusConcepts，Inc.，Berkeley，CA)測定統(tǒng)計顯著性。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。
式I化合物，特別是(3S，4R)-7-(2-羧基-5-三氟甲基苯基)-4-羥基-3-芐基-2H-1-苯并吡喃)的抗動脈粥樣硬化活性如下面表2-4所示表2.動脈粥樣硬化小鼠中對病變的LTB4拮抗作用的效果。
株 N 性別 年齡 體重 劑量TPC TG 竇瓣膜(wks) wt(gm) (mg/kg)(mg/dl) (mg/dl) (％病變) (％病變)129E-/-10F 15 25±1 0 739±5972±1322.5±424.9±31026±2 30 584±5883±4019.6±221.6±25 25±2 50 675±181 59±1714.7±2*16.3±2*1025±1 100 858±166 36±137.9±1**8.0±2**10F 20 27±1 0 795±57120±15 34.6±2. 41.0±31029±1 30 780±51138±21 24.4±325.9±3*5 F 24 30±1 0 513±4259±1243.5±349.5±35 31±1 100 579±37102±930.0±134.0±1C57E-/-8 M 16 29±1 0 807±83189±73 22.9±424.7±48 29±1 100 801±71169±57 10.4±3*7.8±2*12F 22 30± 0 494±5166±5 50.3±356.9±29 30± 100 640±41116±638.8±339±2LDLr-/-10M 18 34±2 0 1342±315 778±210 14.8±215.9±39 31±2 30 798±300 532±205 5.6±2*6.5±3**p＜.05顯著性差異來自賦形劑處理組。
關(guān)于表2，在35天內(nèi)，以指示劑量用(3S，4R)-7-(2-羧基-5-三氟甲基苯基)-4-羥基-3-芐基-2H-1-苯并吡喃)處理(口服給藥)載脂蛋白E缺陷型的1291o/B6(129E-/-)或C57BI/6背景(C57E-/-)混合的小鼠，低密度脂蛋白受體缺陷型小鼠LDLR-/-小鼠純合的小鼠。LDLR-/-喂服Western飲食；所有其他品系喂服飲食(chow)。計算主動脈竇和瓣膜區(qū)域10μ切片中的病變面積平均百分比，接著油紅O染色，以平均值±SD表示。術(shù)語“ND”定義為未測定。術(shù)語“TPC”定義為總的血漿膽固醇。術(shù)語“TG”定義為甘油三酯。術(shù)語“竇”定義為主動脈瓣區(qū)域；從心臟底部向上移；從主動脈瓣尖端的第一個開始，分裂內(nèi)腔成為三個明顯的區(qū)域。在竇中，主動脈壁為膨脹的和不規(guī)則的。術(shù)語“瓣膜”定義為從竇區(qū)域末端開始的主動脈瓣區(qū)域；瓣膜區(qū)域從瓣膜尖端不再分裂內(nèi)腔和主動脈壁顯得更圓，更明顯為起點。瓣膜尖端不再明顯和壁非常圓為瓣膜區(qū)域末端。
表3.動脈粥樣硬化病變中對CD11b的LTB4拮抗作用的效果。
株 病變大小μM ％CD11b129E-/-188175±19110 12.6±1.1經(jīng)處理后 10650±121333.5±1.0*LDLr-/-59009±1273425.1±2.0經(jīng)處理后 19955±7278 3.5±2.5**與對照組明顯不同(P＜01)。
關(guān)于表3，雌性載脂蛋白-E-缺陷型小鼠(129-/-)保持飲食，雄性的LDL受體(LDLr-/-)缺陷型小鼠保持Western型飲食，將它們用(3S，4R)-7-(2-羧基-5-三氟甲基苯基-4-羥基-3-芐基-2H-1-苯并吡喃)(30mg/kg/天)口服給藥處理35天。數(shù)據(jù)按照CD11b陽性染色確定的病變面積和病變平均百分率以平均值±SD的形式表示(N＝8/組)。術(shù)語“CD11b”定義為當(dāng)與另一個細(xì)胞蛋白質(zhì)，CD-18聯(lián)合時形成MAC的細(xì)胞內(nèi)部發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)；MAC-1為涉及粘合的單核細(xì)胞表面上的受體。
表4.MCP-1缺陷型小鼠中對動脈粥樣硬化病變的LTB4拮抗作用的效果。
N 性別 年齡 體重 劑量 TPC TG 竇 瓣膜(wks) wt(gm)(mg/kg) (mg/dl) (mg/dl) (％病變)(％病變)8 M15 29±10 390±2085±117.6±2 5.8±1729±130 345±1582±1213.3±2 12.8±2729±1100354±2079±159.8±1 9.7±114 M30 32±10 505±2045±1 44.1±4 49.6±5831±130 565±22ND41.4±5 54.2±7726±1100576±2147±2 43.1±5 50.0±4賦形劑和處理組之間沒有顯著性差異(P＜.05)。
關(guān)于表4，在35天內(nèi)，以0，30或100mg/kg的指示劑量，用(3S，4R)-7-(2-羧基-5-三氟甲基苯基)-4-羥基-3-芐基-2H-1-苯并吡喃)處理(口服給藥)C57bl/6背景(C57E-/-)單核細(xì)胞化學(xué)引誘物蛋白-1(MCP-1-/-)和載脂蛋白E(ApoE-/-)的無效等位基因純合的小鼠。計算主動脈竇和瓣膜區(qū)域10μ切片中的病變面積平均百分比，接著油紅O染色，以平均值±SD表示。術(shù)語“ND”定義為未測定。術(shù)語“TPC”定義為總的血漿膽固醇。術(shù)語“TG”定義為甘油三酯。術(shù)語“竇”定義為主動脈瓣區(qū)域；從心臟底部向上移；從主動脈瓣尖端的第一個開始，分裂內(nèi)腔成為三個明顯的區(qū)域。在竇中，主動脈壁為膨脹的和不規(guī)則的。術(shù)語“瓣膜”定義為從竇區(qū)域末端開始的主動脈瓣區(qū)域；瓣膜區(qū)域從當(dāng)瓣膜尖端不再分裂內(nèi)腔和主動脈壁顯得更圓，更明顯時為起點。瓣膜尖端不再明顯和壁非常圓為瓣膜區(qū)域末端。
用于本發(fā)明方法的式I化合物可以按照下列制備例的說明合成，但是本發(fā)明并不局限于它們的細(xì)節(jié)。在下列制備例中，術(shù)語“室溫”表示約20℃至約25℃范圍內(nèi)的溫度。
制備例1(3S，4R)-2-(3-芐基-4-羥基-苯并吡喃-7-基)-4-三氟甲基-苯甲酸將(3S，4R)-2-(3-芐基-4-羥基-苯并吡喃-7-基)-4-三氟甲基苯甲酸乙酯(897g，1.93mol)和10％氫氧化鈉水溶液(980mL，2.72mol)在異丙醇(9L)中的混合物加熱回流6小時，冷卻至室溫，并且攪拌12小時。將反應(yīng)混合物用水(13.5L)、己烷(9L)以及異丙基醚(4.5L)稀釋。將水層分離并且用己烷(9L)和異丙基醚(4.5L)萃取，用2N鹽酸水溶液調(diào)節(jié)pH至2，并且用乙酸乙酯(8L和4L)萃取。將合并的乙酸乙酯萃取液用水(6L)洗滌，用硫酸鎂干燥，真空濃縮，將得到的深琥珀色油用甲苯(2L)稀釋，再濃縮成油狀物。將該油狀物在60℃溶于甲苯(4.2L)，以保持溫度大于50℃的速度加入己烷(8.8L)。用數(shù)個小時慢慢地冷卻至室溫，沉淀出黃褐色固體，將其過濾，并且用2∶1己烷/甲苯(2L)洗滌。將這些固體在60℃溶于甲苯(5L)中，用DarcoG-60處理，過濾，用甲苯洗滌，真空濃縮至大約4.0L。將該混合物加熱至50-60℃，滴入己烷(8.6L)，冷卻，并且在5℃?；?至2小時。將所得固體過濾，用2∶1己烷/甲苯(2L)洗滌，并且將濕濾餅用己烷(4L)攪拌回流30分鐘。將該混合物冷卻至室溫，?；?小時，過濾，并且將所得固體真空干燥過夜，得到450g(55％)米白色固體狀(3S，4R)-2-(3-芐基-4-羥基-苯并吡喃-7-基)-4-三氟甲基苯甲酸1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.99(d，J＝8.1Hz，1H)，7.66(dd，J＝1.1，8.1Hz，1H)，7.63(s，1H)，7.15-7.32(m，6H)，6.89(dd，J＝1.7，7.9Hz，1H)，6.85(d，J＝1.7Hz，1H)，6.1(bs，2H)，4.50(d，J＝4.3Hz，1H)，4.18(dd，J＝2.7，11.2Hz，1H)，3.94(dd，J＝4.6，11.0Hz，1H)，2.74(dd，J＝6.1，13.8Hz，1H)，2.51(dd，J＝9.4，13.9Hz，1H)，2.22(m，1H)；IR3454，3218(br)，1699，1431，1337，1299，1275，1258，1191，1178，1135，1123，700cm-1；mp142℃。
用于制備例1的原料(3S，4R)-2-(3-芐基-4-羥基苯并吡喃-7-基)-4-三氟甲基-苯甲酸乙酯制備如下
A.(R)-4-芐基-3-(3-苯基-丙?；?-惡唑烷-2-酮在-78℃下，在30分鐘內(nèi)，將2.5 M BuLi在己烷中的溶液(2.03L，5.14mol)加入(R)-(+)-4-芐基-2-惡唑烷酮(910g，5.14mol)和作為指示劑的500mg 2，2′-聯(lián)吡啶的四氫呋喃(9L)的溶液中。加入期間反應(yīng)混合物溫度維持在低于-55℃的水準(zhǔn)上。將反應(yīng)混合物冷卻至-75℃，5分鐘內(nèi)加入氫化肉掛?；?950g，5.63mol)。使反應(yīng)混合物溫?zé)嶂?℃，通過薄層色譜法(己烷/乙酸乙酯，2∶1)判斷反應(yīng)混合物反應(yīng)完成。加入10％碳酸氫鈉水溶液(3.6L)和水(3.6L)猝滅反應(yīng)。分離水相并且用乙酸乙酯(3L)萃取。將合并的有機(jī)層用5％碳酸鈉水溶液(3.6L)和氯化鈉飽和水溶液(2L)洗滌，用硫酸鎂干燥，真空濃縮得到大約2L粘稠的黃色懸浮液。將該淤漿溶于乙酸乙酯(3L)中，濃縮至固體，在50℃溶于乙酸乙酯中。加入己烷(10.7L)，將該混合物慢慢地冷卻至10℃，得到固體沉淀，將其在10℃攪拌30分鐘。將該固體過濾收集，用己烷洗滌，在室溫下空氣干燥，得到1.4kg(88％)淺黃色針狀(R)-4-芐基-3-(3-苯基丙酰基)-惡唑烷-2-酮1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.14-7.33(m，10H)，4.66(m，1H)，4.17(t，J＝3.4Hz，2H)，3.26(m，3H)，3.03(t，J＝7Hz，2H)，2.75(dd，J＝9.5，13.4Hz，1H)；IR1787，1761，1699，1390，1375，1308，1208，1203，746，699cm-1；mp102-104℃。
B.[4R-[3(2R，3R)]]-4-芐基-3-[2-芐基-3-(4-溴-2-氟-苯基)-3-羥基丙?；鵠-惡唑烷-2-酮在-5℃，在20分鐘內(nèi)，將二丁基硼三氟磺酸鹽(1133g，4.13mol)加入(R)-4-芐基-3-(3-苯基丙?；?-惡唑烷-2-酮(1064g，3.44mol)的二氯甲烷(5.6L)溶液中，接著在保持反應(yīng)溫度低于5℃的情況下加入三乙胺(719mL，5.16mol)。將該混合物冷卻至-70℃，在30分鐘內(nèi)，加入4-溴-2-氟-苯甲醛(699g，3.44mol)在二氯甲烷(2L)中的溶液。在1小時內(nèi)使該混合物溫?zé)嶂?1 0℃，通過薄層色譜法(己烷/乙酸乙酯，2∶1)判斷反應(yīng)完成。在保持反應(yīng)溫度小于15℃的情況下，通過在30分鐘內(nèi)加入磷酸二氫鉀-氫氧化鈉pH7緩沖液(3.5L)，接著在1.5小時內(nèi)加入甲醇(1.8L)和35％過氧化氫水溶液(1.8L)猝滅反應(yīng)。將有機(jī)層分離，用飽和碳酸氫鈉水溶液(6.7L)洗滌，用無水乙醇(4L)和25％亞硫酸氫鈉水溶液稀釋。將有機(jī)層分離，用水(4L)洗滌，用硫酸鎂干燥，真空濃縮，得到1818g(103％-粗品重量)非常粘稠的琥珀色油狀[4R-[3(2R，3R)]]-4-芐基-3-[2-芐基-3-(4-溴-2-氟苯基)-3-羥基丙?；鵠-惡唑烷-2-酮1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.46(t，J＝8.0Hz，1H)，7.16-7.32(m，10H)，6.94-6.96(m，2H)，5.35(d，J＝4.7Hz，1H)，4.92-5.29(m，1H)，4.45-4.51(m，1H)，3.92(m，2H)，3.01-3.14(m，3H)，2.83(dd，J＝3.1，13.6Hz，1H)，2.05(dd，J＝10.0，13.5Hz，1H)；IR3460(br)，1780，1696，1483，1388，1350，1209，1106，1068，877，760，747，701，583，512，486cm-1。
C[4R-[3(2R，3R)]]-4-芐基-3-[2-芐基-3-(4-溴-2-氟-苯基)-3-羥基丙?；鵠-惡唑烷-2-酮，1-甲基-2-吡咯烷酮溶劑化物在-70℃至-80℃下，在30分鐘內(nèi)，將四氯化鈦(8.8kg，46.6mol)加入(R)-4-芐基-3-(3-苯基丙?；?-惡唑烷-2-酮(12.0kg，38.8mol)在二氯甲烷(180L)中的溶液中，得到濃的懸浮液，將其在-70℃至80℃再攪拌30分鐘。在30分鐘內(nèi)，加入N，N，N′，N′-四甲基乙二胺(17.6L，116.4mol)得到更多液體反應(yīng)混合物。在保持低于-65℃的反應(yīng)溫度的情況下，加入1-甲基-2-吡咯烷酮(7.6kg，77.6mol)，并將反應(yīng)混合物攪拌30分鐘。在保持反應(yīng)溫度小于或等于-68℃的情況下，在30分鐘內(nèi)，加入4-溴-2-氟苯甲醛(7.9kg，38.8mol)在二氯甲烷(38L)中的溶液。在8小時內(nèi)，使反應(yīng)混合物溫?zé)嶂?0℃，然后將其冷卻至10℃，用5.0kg氯化銨在11L水中的溶液猝滅，得到白色沉淀，溫度升高至28℃。加入Celite(12kg)，將該反應(yīng)混合物在20℃攪拌12小時。將反應(yīng)混合物過濾，常壓濃縮至油狀物，用己烷(120L)處理，濃縮至大約50L，慢慢地冷卻至0℃，?；?4小時。將24.3kg粗產(chǎn)品通過過濾分離，合并從110L二氯甲烷中的兩個相似的反應(yīng)得到的粗產(chǎn)品，用320L己烷處理，常壓濃縮至最終容積大約250L(蒸餾物溫度65℃)，加入可信產(chǎn)物作為種子，慢慢地冷卻，在20℃粒化18小時。過濾得到67.4kg(94％)淡黃褐色粒狀[4R-[3(2R，3R)]]-4-芐基-3-[2-芐基-3-(4-溴-2-氟苯基)-3-羥基丙?；鵠-惡唑烷-2-酮，1-甲基-2-吡咯烷酮溶劑化物1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.46(t，J＝8.0Hz，1H)，7.15-7.29(m，10H)，6.94(dd，J＝1.9，7.2Hz，2H)，5.34(d，J＝4.8Hz，1H)，4.91-4.96(m，1H)，4.44-4.49(m，1H)，3.90-3.95(m，2H)，3.55(bs，1H)，3.37(dd，J＝7.2，7.2Hz，2H)，3.00-3.13(m，2H)，2.83(s，3H)，2.82(dd，J＝3.3，13.3Hz，1H)，2.36(dd，J＝8.2，8.2Hz，2H)，1.97-2.06(m，3H)；IR3150(br)，1776，1695，1652，1600，1221，1050，996，953，875cm-1；mp80-83℃。
D.(1R，2S)-2-芐基-1-(4-溴-2-氟苯基)-丙烷-1，3-二醇將2M硼氫化鋰在四氫呋喃(1.7L，3.4mol)中的溶液用四氫呋喃(1.7L)稀釋，在15分鐘內(nèi)慎重地用水(61mL，3.4mol)處理。在室溫下攪拌該混合物直到氫氣停止放出(0.5至1小時)，然后在0℃下，在30分鐘內(nèi)，將其加入[4R-[3(2R，3R)]]-4-芐基-3-[2-芐基-3-(4-溴-2-氟苯基)-3-羥基丙?；鵠-惡唑烷-2-酮(1.75kg，3.4mol)在四氫呋喃(8.75L)中的溶液中。在12小時內(nèi)使所得乳白色懸浮液溫?zé)嶂潦覝?，此時通過薄層色譜法(己烷/乙酸乙酯，2∶1)判斷反應(yīng)完成。在15分鐘內(nèi)，將反應(yīng)混合物冷卻至15℃，用水(5.25L)猝滅，再攪拌10分鐘，然后在20分鐘內(nèi)，加入35％過氧化氫水溶液(2.6L)。將反應(yīng)混合物攪拌15分鐘，然后用乙酸乙酯(5.3L)和水(4L)稀釋。將有機(jī)層分離，用水(5.3L)、5％亞硫酸氫鈉水溶液(5.25L)和50％氯化鈉飽和水溶液(7.5L)洗滌。檢測有機(jī)層中的過氧化物，如果有再用5％亞硫酸氫鈉水溶液(5L)和50％氯化鈉飽和水溶液(6L)洗滌。將有機(jī)層真空濃縮得到油狀物，用乙酸乙酯(4L)和己烷(13L)稀釋，用1N鹽酸水溶液(6次17L)洗滌以除去(R)-(+)-4-芐基-2-惡唑烷酮。將有機(jī)層用碳酸氫鈉飽和水溶液(5.3L)洗滌，用甲苯(2L)稀釋，真空濃縮，得到1138g(98％)油狀(1R，2S)-2-芐基-1-(4-溴-2-氟苯基)-丙烷-1，3-二醇1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.47-7.51(m，1H)，7.33(dd，J＝1.9，8.3Hz，1H)，7.15-7.25(m，4H)，7.04-7.06(m，2H)，5.39(d，J＝2.6Hz，1H)，3.77(dd，J＝3.0，10.7Hz，1H)，3.64(dd，J＝5.0，10.8Hz，1H)，3.44(bs，1H)，2.68(dd，J＝11.0，13.8Hz，1H)，2.59(dd，J＝4.1，13.9Hz，1H)，2.15-2.20(m，1H)，2.01(bs，1H)；IR3370(br)，3269(br)，1485，1406，1213，1033，1021，870，700cm-1。
E1.(3 S，4R)-3-芐基-7-溴-苯并吡喃-4-醇在室溫下，在20分鐘內(nèi)，將1M二(三甲基甲硅烷基)酰氨化鈉在四氫呋喃(6.55L，6.55mol)中的溶液加入(1R，2S)-2-芐基-1-(4-溴-2-氟-苯基)-丙烷-1，3二醇(1975g，5.82mol)在二甲亞砜(9.88L)中的溶液中。將該混合物在抽真空下慢慢地加熱到60℃以從反應(yīng)混合物中置換出四氫呋喃，然后在抽真空下在60℃至65℃加熱5小時，此時按照薄層色譜法(己烷/乙酸乙酯，2∶1)判斷反應(yīng)的完成。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，通過加入水(10L)接著加入1N鹽酸水溶液(10L)猝滅。將所得黃褐色懸浮液過濾，用水(2L)洗滌，溶于乙酸乙酯(12L)中。將該溶液用水洗滌(兩次12L)，濃縮至小體積，溶于異丙醚(4L)中，在常壓下在50至60℃濃縮至1.0L，這時固體開始沉淀。將所得懸浮液冷卻至室溫，攪拌12小時，濃縮至一半體積，冷卻至0至5℃，過濾得到916g(49％)白色固體狀(3S，4R)-3-芐基-7-溴苯并吡喃-4-醇。將該濾液濃縮至深色油狀物(906g)，回流溶于異丙醚(1.5L)中，冷卻至室溫，攪拌，過濾得到另外的82g固體。將濾液濃縮，通過硅膠層析(60-230目)，用3∶1己烷/乙酸乙酯洗脫。將富含產(chǎn)物的餾分濃縮，用異丙基醚重結(jié)晶，得到另外的82g固體。(3S，4R)-3-芐基-7-溴苯并吡喃-4-醇的總產(chǎn)量為1080g(58％)1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.29-7.33(m，2H)，7.21-7.25(m，1H)，7.15-7.19(m，3H)，7.06-7.09(m，2H)，4.44(bs，1H)，4.21(dd，J＝2.6，11.3Hz，1H)，3.97(dd，J＝4.5，11.3Hz，1H)，2.68(dd，J＝6.5，13.8Hz，1H)，2.51(dd，J＝9.1，13.8Hz，1H)，2.18-2.23(m，1H)，1.85(d，J＝4.3Hz，1H)；IR3274(br)，3181(br)，1598，1573，1493，1480，1410，1219，1070，1052，1023，859，700cm-1；mp 143.5-144.0℃。
E2.(3S，4R)-3-芐基-7-溴-苯并吡喃-4-醇或者，上述化合物可以如下制備將12.9kg(115mol)叔丁醇鉀加入(由33.5kg(54.8mol)[4R-[3(2R，3R)]]-4-芐基-3-[2-芐基-3-(4-溴-2-氟苯基)-3-羥基丙?；鵠-惡唑烷-2-酮，1-甲基-2-吡咯烷酮溶劑化物不經(jīng)分離制備的)(1R，2S)-2-芐基-1-(4-溴-2-氟苯基)-丙烷-1，3-二醇在185L四氫呋喃中的溶液中。使將反應(yīng)混合物加熱回流4小時，此時通過薄層色譜法(己烷/乙酸乙酯，3∶1)判斷反應(yīng)完成。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，用170L水猝滅，用83L乙酸乙酯稀釋，用7.5L濃鹽酸酸化至pH5.3(水層)。將有機(jī)層真空濃縮為大約38L的淤漿，用76L異丙基醚稀釋，溫?zé)嶂凉腆w溶解，慢慢地冷卻至0℃，在0℃?；?2小時。通過過濾分離5.1kg白色固體狀(3S，4R)-3-芐基-7-溴苯并吡喃-4-醇。將母液用4L氯化鈉飽和水溶液洗滌，濃縮至57L的最終體積，在0℃粒化12小時，得到4.3kg第二批(3S，4R)-3-芐基-7-溴苯并吡喃-4-醇。
如上所述，將第二批相同的反應(yīng)混合物猝滅，用乙酸乙酯稀釋，酸化。將有機(jī)層用10kg硫酸鎂干燥，大氣壓下濃縮成大約30L淤漿，用38L異丙基醚稀釋，濃縮至大約57L，慢慢地冷卻，在0至10℃?；?2小時。過濾分離(3S，4R)-3-芐基-7-溴苯并吡喃-4-醇，8.7kg。將該母液與來自第一個反應(yīng)的第二批母液合并，濃縮為油狀物，冷卻固化，在6L異丙基醚中在20℃?；?2小時，在0℃粒化2小時，過濾，用冷異丙醚洗滌后得到6.3kg(3S，4R)-3-芐基-7-溴苯并吡喃-4-醇。合并兩個反應(yīng)的產(chǎn)物，干燥，得到20.8kg(59％)(3S，4R)-3-芐基-7-溴苯并吡喃-4-醇。
F.(3S，4R)-(3-芐基-4-羥基苯并吡喃-7-基)-硼酸在保持溫度低于-65℃的情況下，在45分鐘內(nèi)，將1.48M甲基鋰在乙醚(1.6L，2.37mol)中的溶液加入-75℃的(3S，4R)-3-芐基-7-溴苯并吡喃-4-醇(377g，1.18mol)在四氫呋喃(5.6L)中的溶液中。在低于-65℃的溫度下，將反應(yīng)混合物攪拌1小時，接著在15分鐘內(nèi)加入2.5M丁基鋰在己烷(440mL，1.3mol)中的溶液。在低于-65℃的溫度下，將反應(yīng)混合物攪拌1小時，接著在30分鐘內(nèi)加入1.0M硼-四氫呋喃配合物在四氫呋喃(5.9L，5.9mol)中的溶液。將反應(yīng)混合物溫?zé)嶂?℃，通過加入水(4.4L)猝滅，用1N鹽酸水溶液(4L)調(diào)節(jié)pH至2，用異丙基醚(4L)萃取。將水層用異丙醚(4L)萃取，將合并的有機(jī)層用0.5N氫氧化鈉水溶液(7.2L)洗滌。用1N鹽酸水溶液(5.5L)將水層pH調(diào)節(jié)為3，用乙酸乙酯(5.4L和2.7L)萃取。將合并的乙酸乙酯層用硫酸鎂干燥，真空濃縮，得到304.5g(91％)黃色泡沫狀(3S，4R)-(3-芐基-4-羥基苯并吡喃-7-基)-硼酸1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.35-7.00(m，8H)，4.42(d，J＝4.1Hz，1H)，4.19(d，J＝11Hz，1H)，3.90(m，1H)，2.68(dd，J＝6.2，13.8Hz，1H)，2.47(m，1H)，2.15(m，1H)；IR3330(br)，1413，1348，1320，1211，1025，749，730，700cm-1。
G.(3S，4R)-2-(3-芐基-4-羥基-苯并吡喃-7-基)-4-三氟甲基-苯甲酸乙酯將2-碘-4-三氟甲基-苯甲酸乙酯(723g，mol)，(3S，4R)-(3-芐基-4-羥基-苯并吡喃-7-基)-硼酸(627g，2.2mol)、氟化鉀(366g，6.3mol)、10％鈀-碳(157g，50％水潤濕的)和無水乙醇(6.27L)的混合物加熱回流3小時，此時通過薄層色譜法(甲苯/乙酸，5∶1)指示反應(yīng)完成。將反應(yīng)混合物用異丙醚(8L)稀釋，用硅藻土過濾，用10％碳酸氫鈉水溶液(1.5L)洗滌。分離水層并且用異丙基醚(3L)萃取。將合并的有機(jī)層用水(6L)洗滌，用硫酸鎂干燥，在室溫下用DarcoG-60(1.0kg)和硅膠(1kg，70-230目)處理。將該混合物通過硅膠墊(70-230目)過濾，真空濃縮至922g深色油狀物。將該油狀物用乙酸乙酯(1L)稀釋，通過硅膠柱(2kg)過濾，用乙酸乙酯洗脫，得到淡琥珀色溶液，將其濃縮，得到897g(92％)淡琥珀色油狀(3S，4R)-2-(3-芐基-4-羥基苯并吡喃-7-基)-4-三氟甲基-苯甲酸乙酯，1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.89(d，J＝8.1Hz，1H)，7.63-7.67(m，2H)，7.18-7.38(m，6H)，6.91(dd，J＝1.8，7.8Hz，1H)，6.86(d，J＝1.7Hz，1H)，4.55(bs，1H)，4.25(dd，J＝2.7，11.2Hz，1H)，4.17(q，J＝7.1Hz，2H)，4.00(ddd，J＝1.0，4.5，11.2Hz，1H)，2.75(dd，J＝6.4，13.9Hz，1H)，2.56(dd，J＝9.3，13.8Hz，1H)，2.26(m，1H)，1.93(d，J＝4.3Hz，1H)，1.09(t，J＝7.2Hz，3H)；IR3307(br)，3216(br)，1734，1339，1298，1247，1191，1175，1118，1097，1050cm-1。
制備例2(3S，4R)-2-(3-芐基-4-羥基-苯并吡喃-7-基)-4-三氟甲基-苯甲酸將(3S，4R)-2-(3-芐基-4-羥基-苯并吡喃-7-基)-4-三氟甲基苯甲酸2，2-二甲基丙酯(2.34g，4.69mmol)在異丙醇(23mL)中的溶液用10％氫氧化鈉水溶液(2.3mL，6.4mmol)處理，加熱回流3小時。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，倒入水(34mL)中，用己烷(23mL)和異丙基醚(13mL)萃取。將水層分離并且用己烷(23毫升)和異丙醚(13毫升)萃取，用6N鹽酸水溶液調(diào)節(jié)pH至2，并且用乙酸乙酯(兩次40毫升)萃取。將合并的乙酸乙酯萃取液用鹽水(40mL)洗滌，用硫酸鎂干燥，過濾，濃縮，用甲苯/己烷重結(jié)晶，得到白色泡沫狀物。將所得固體過濾，用己烷洗滌，將濕濾餅與己烷(20mL)攪拌1小時。將該混合物過濾，并且將所得固體真空干燥，得到1.01g(50％產(chǎn)率)白色固體狀(3S，4R)-2-(3-芐基-4-羥基-苯并吡喃-7-基)4-三氟甲基-苯甲酸1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.00(d，J＝8.1Hz，1H)，7.67(d，J＝8.1Hz，1H)，7.64(s，1H)，7.18-7.36(m，6H)，6.91(dd，J＝7.9，1.7Hz，1H)，6.86(d，J＝1.7Hz，1H)，4.53(d，J＝4.2Hz，1H)，4.24(dd，J＝11.2，2.7Hz，1H)，3.97(dd，J＝11.0，4.0HZ，1H)，2.76(dd，J＝13.9，6.4Hz，1H)，2.53(dd，J＝13.7，9.3Hz，1H)，2.24-2.26(m，1H)。
用于制備例2的原料(3S，4R)-2-(3-芐基-4-羥基苯并吡喃-7-基)-4-三氟甲基-苯甲酸2，2-二甲基丙酯制備如下A.4-三氟甲基-苯甲酸2，2-二甲基丙酯將濃硫酸(3.0mL)加入4-三氟甲基苯甲酸(75.0g，394mmol)和2，2-二甲基-丙醇(70.5g，800mmol)在甲苯(500mL)中的懸浮液中。將該混合物攪拌回流4小時，冷卻至室溫，倒入碳酸鈉飽和水溶液(250mL)，分層。將有機(jī)層用碳酸鈉飽和水溶液(250mL)和鹽水(100mL)洗滌，濃縮，得到黃色液體狀4-三氟甲基-苯甲酸，2，2-二甲基-丙酯(102g，99％產(chǎn)率)Rf0.66(乙酸乙酯/己烷25/75)；IR 2932，1727，1327，1280，1133，1066，862，775，704cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.16(d，J＝7.9Hz，2H)，7.70(d，J＝8.1Hz，2H)，4.04(s，2H)，1.04(s，9)；13CNMR(100MHz，CDCl3)δ26.51，31.61，74.72，123，63(q，J＝272.7HZ)，125.4，129.9，133，7，134.35(q，J＝31.7Hz)，165.35。
B.2-(2，2-二甲基-丙氧羰基)-5-三氟甲基-苯甲酸將三異丙基硼酸酯(9.00mL，39.0mmol)加入4-三氟甲基-苯甲酸2，2-二甲基-丙酯(4.225g，16.23mmol)在四氫呋喃(40mL)中的溶液中。將該溶液冷卻至-78℃，在5分鐘內(nèi)滴入二異丙基酰氨化鋰(12.0mL，2.0M在四氫呋喃/庚烷中的溶液，24.0mmol)。將該紅色溶液攪拌30分鐘，溫?zé)嶂?℃，通過緩慢的加入1N鹽酸(50mL)猝滅。將該混合物溫?zé)嶂潦覝?，攪?0分鐘，加入己烷(200mL)中。分層，將有機(jī)層依次用2N鹽酸(兩次，100mL)、水(100mL)和鹽水(50mL)洗滌。將有機(jī)萃取液用硫酸鎂干燥，過濾，濃縮，得到油狀物。將粗產(chǎn)品用庚烷(40mL)結(jié)晶，得到白色固體狀2-(2，2-二甲基-丙氧羰基)-5-三氟甲基-苯硼酸(3.037g，62％產(chǎn)率)mp＝159-160℃；IR 3377(br)，2963，1703，1371，1308，1171，1131，794，709cm-1；1H NMR(400MHz，DMSO D2O)δ8.05(d，J＝8.1Hz，1H)，7.78(d，J＝8.3Hz，1H)，7.66(s，1H)，3.94(s，2H)，0.95(s，9H)；13C NMR(100MHz，DMSO/D2O)δ26.69，31.69，74.91，125.29，125.75，128.30，129.62，131.98(q，J＝31.8Hz)，136.28，142.68，166.90。
C.(3S，4R)-2-(3-芐基-4-羥基-苯并吡喃-7-基)-4-三氟甲基-苯甲酸2，2-二甲基丙酯將2-(2，2-二甲基丙氧羰基)-5-三氟甲基苯硼酸(1.72g，5.66mmol)、(3S，4R)-3-芐基-7-溴苯并吡喃-4-醇(1.80g，5.63mmol)、碳酸鈉(1.82g，17.2mmol)和四(三苯基膦)鈀(0)(12mg，0.19mol％)在甲苯(15mL)和水(9mL)中的兩相溶液攪拌回流100分鐘。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，倒入水(40mL)中，用二異丙基醚(75mL)萃取。將有機(jī)萃取液用鹽水(50mL)洗滌，用DarcoG-60處理，用硫酸鎂干燥，用硅藻土過濾并且濃縮。通過硅膠層析法(乙酸乙酯/己烷20/80)純化粗產(chǎn)品，得到白色泡沫狀(3S，4R)-2-(3-芐基-4-羥基苯并吡喃-7-基)-4-三氟甲基-苯甲酸2，2-二甲基丙基酯(2.35g，84％產(chǎn)率)Rf0.32(乙酸乙酯/己烷25/75)；IR 3407(br)，2961，1721，1336，1292，1252，1172，1134，1110，1022，848，749cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.90(d，J＝8.1Hz，1H)，7.66(d，J＝8.1Hz，1H)，7.63(s，1H)，7.19-7.37(m，6H)，6.88-6.93(m，2H)，4.53(t，J＝4.4Hz，1H)，4.22(dd，J＝11.2，2.5Hz，1H)，3.99(dd，J＝11.2，3.3Hz，1H)，3.78(s，2H)，2.73(dd，J＝13.8，6.3Hz，1H)，2.54(dd，J＝13.6，9.4Hz，1H)，2.20-2.80(m，1H)，1.81(d，J＝5.2Hz，1H)，0.74(s，9H)；13CNMR(100MHz，CDCl3)δ26.64，30.96，34.62，41.53，64.76，67.42，75.33，116.77，121.07，122.97，124.13，126.44，127.50，127.54，128.45，128.60，128.92，129.11，130.25，130.31，139.08，141.69，142.03，154.44，168.14。
制備例3(3S，4R)-2-(3-芐基-4-羥基-苯并吡喃-7-基)-4-三氟甲基-苯甲酸將(3S，4R)-二環(huán)己基銨-2-(3-芐基-4-羥基苯并吡喃-7-基)-4-三氟甲基-苯甲酸鹽(2.37g，3.89mmol)的乙酸乙酯(25mL)溶液和1N鹽酸(25mL)的混合物在室溫下攪拌1小時。將該混合物倒入乙酸乙酯(20mL)中，除去水層。將有機(jī)層用水(六次，50mL)洗滌，用硫酸鎂干燥，過濾，濃縮得到(3S，4R)-2-(3-芐基-4-羥基苯并吡喃-7-基)-4-三氟甲基苯甲酸(1.66g，100％產(chǎn)率)1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.00(d，J＝8.1Hz，1H)，7.67(d，J＝8.1Hz，1H)，7.64(s，1H)，7.18-7.36(m，6H)，6.91(dd，J＝7.9，1.7Hz，1H)，6.86(d，J＝1.7Hz，1H)，4.53(d，J＝4.2Hz，1H)，4.24(dd，J＝11.2，2.7Hz，1H)，3.97(dd，J＝11.0，4.0Hz，1H)，2.76(dd，J＝13.9，6.4Hz，1H)，2.53(dd，J＝13.7，9.3Hz，1H)，2.24-2.26(m，1H)。
制備例3的原料(3S，4R)-二環(huán)己基銨-2-(3-芐基-4-羥基苯并吡喃-7-基)-4-三氟甲基-苯甲酸鹽制備如下A.2-[1，3，6，2]Dioxazaborocan-2-基-4-三氟甲基-苯甲酸2，2-二甲丙基酯將三異丙基硼酸酯(73.0mL，316mmol)加入4-三氟甲基-苯甲酸2，2-二甲基-丙酯(35.8g，138mmol)在四氫呋喃(250mL)中的溶液中。將該溶液冷卻至0℃，在20分鐘內(nèi)滴入二異丙基酰氨化鋰(73.0mL，2.0M四氫呋喃/庚烷中的溶液，146.0mmol)，將所得紅色溶液攪拌另外的30分鐘。加入己烷(200mL)，接著加入1N鹽酸(200mL)。將該混合物攪拌10分鐘，倒入己烷(200mL)中。將有機(jī)層用1N鹽酸(兩次，150mL)和鹽水(100mL)洗滌。將有機(jī)萃取液用硫酸鎂干燥，過濾，濃縮至約200毫升。加入異丙醇(100mL)和二乙醇胺(15.95g，151.7mmol)，將該混合物在室溫下攪拌10小時。將所得固體過濾，用異丙醇(15mL)和己烷(30mL)的混合物洗滌，得到白色固體狀2-[1，3，6，2]dioxazaborocan-2-基-4-三氟甲基-苯甲酸2，2-二甲基丙基酯(37.83g，74％產(chǎn)率)，mp＝233-234℃；IR 3077，2963，2862，1722，1480，1467，1371，1331，1298，1290，1279，1254，1161，1117，1108，1087，1074，995，952，862，cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.23(s，1H)，7.72(d，J＝7.9Hz，1H)，7.52(dd，J＝7.9，1.3Hz，1H)，6.33(brs，1H)，4.08-4.14(m，2H)，3.98(s，2H)，3.93-3.98(m，2H)，3.42-3.50(m，2H)，2.88-2.94(m，2H)，1.02(s，9H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)26.51，31.69，50.92，63.33，74.72，123.94，128.59，132.06，139.61，171.56。
B.(3S，4R)-二環(huán)己基銨-2-(3-芐基-4-羥基苯并吡喃-7-基)-4-三氟甲基-苯甲酸鹽將2-[1，3，6，2]dioxazaborocan-2-基-4-三氟甲基-苯甲酸2，2-二甲基丙酯(7.04g，18.9mmol)在甲苯(45mL)和1.5N鹽酸(45mL)中的混合物在室溫下攪拌45分鐘。除去水層，加入碳酸鈉(2.73g，25.8mmol)、(3S，4R)-3-芐基-7-溴苯并吡喃-4-醇(5.47g，17.1mmol)、四(三苯基膦)鈀(O)(24.0mg，20.8mmol)和水(20mL)。將所得兩相溶液攪拌回流100分鐘，冷卻至室溫，倒入水(50mL)中。分層，將有機(jī)層用DarcoG-60處理，過濾，濃縮。將所得粗品酯溶于異丙醇(80mL)中，加入10％氫氧化鈉水溶液(8.0mL)。將該溶液加熱在回流3小時，冷卻至室溫，倒入水(120mL)中，用己烷(80mL)和異丙基醚(40mL)萃取。將水層用己烷(80毫升)和異丙醚(40毫升)洗滌，用6N鹽酸調(diào)節(jié)pH至2，并且用甲基叔丁基醚(兩次75毫升)萃取。將有機(jī)萃取液用硫酸鎂干燥，過濾，濃縮。將所得粗產(chǎn)品溶于甲基叔丁基醚(40mL)，加入二環(huán)己基胺(4.10mL，20.6mmol)。將該混合物攪拌過夜，并且將所得固體過濾，用甲基叔丁基醚(20mL)洗滌，得到(3S，4R)-二環(huán)己基銨-2-(3-芐基-4-羥基-苯并吡喃-7-基)-4-三氟甲基-苯甲酸鹽(7.32g，70％產(chǎn)率)；mp＝209-210℃；IR 3307，3025，2939，2858，1626，1564，1429，1398，1388，1333，1168，1119，903，875，846，838cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.62(d，J＝7.7Hz，1H)，7.55(s，1H)，7.52(d，J＝7.9Hz，1H)，7.17-7.31(m，6H)，7.08(dd，J＝7.9，1.7Hz，1H)，7.00(d，J＝1.7Hz，1H)，4.48(d，J-4.4Hz，1H)，4.17(dd，J＝11.0，2.6Hz，1H)，3.90(dd，J＝11.0，5.0HzlH)，2.742.79(m，3H)，2.50(dd，J＝13.8，9.4Hz，1H)，1.80-1.82(m，4H)，2.20(brslH)，1.68-1.70(m，4H)，1.56(d，J＝12.2Hz，2H)，1.00-1.26(m，10H)。13C NMR(100MHz，CDCl3)δ24.70，24.73，25.03，28.94，29.09，34.75，41.75，52.64，65.00，67.57，116.50，121.42，122.59，123.77，126.38，126.73，128.03，128.55，129.06，129.45，138.95，139.16，142.51，144.20，154.04，173.85。
制備例43S，4R-7-(3-羧基苯基)-4-羥基-3-苯基甲基-2H-1-苯并吡喃皂化將10mL 2M NaOH溶液加入攪拌著的極性較小的4R，3S N-α-叔丁氧羰基-L-色氨酸-7-[(3-羰基(carbo)甲氧基苯基)-3-苯基甲基]-苯并吡喃-4-基]-酯(840mg，1.08mmol)在10mL甲醇中的溶液中。將該混合物回流8小時，冷卻并用1M HCl酸化至pH為4。將渾濁的乳液用20mL乙酸乙酯萃取3次，將合并的有機(jī)層用鹽水洗滌，用硫酸鎂干燥。過濾，真空除去溶劑，得到黃色泡沫狀物。層析純化(硅膠-乙酸乙酯∶己烷∶乙酸-35∶75∶1)，得到210mg產(chǎn)物。1H NMR(300MHz，CD3CN)8.22(1H，t，1.7Hz)，7，97(1H，dt，J＝7.8，1.7Hz)，7.87(1H，dt，J＝7.8，1.7Hz)，7.55(1H，t，J＝7.8Hz)，7.42(1H，d，J＝7.9Hz)，7.157.36(6H，m)，7.10(1H，d，J＝1.8Hz)，4.44(1H，d，J＝4.9Hz)，4.19(1H，dd，J＝9.1，2.5Hz)，3.97(1H，dd，J＝9.1，5.4Hz)，2.72(1H，dd，J＝13.7，6.2Hz)，2.51(1H，dd，J＝13.7，9.1Hz)，2.04-2.20(3H，m)。[α]D25＝+11.1在C＝1.00，甲醇中。M.P.＝210-212℃。極性較高的3R，4S色氨酸-酯(700mg)如上述皂化，得到3R，4S對映體，1H NMR(300MHz，CD3CN)8.22(1H，t，1.7Hz)，7.97(1H，dt，J＝7.8，1.7Hz)，7.87(1H，dt，J＝7.8，1.7Hz)，7.55(1H，t，J＝7.8Hz)，7.42(1H，d，J＝7.9Hz)，7.157.36(6H，m)，7.10(1H，d，J＝1.8Hz)，4.44(1H，d，J＝4.9Hz)，4.19(1H，dd，J＝9.1，2.5Hz)，3.97(1H，dd，J＝9.1，5.4Hz)，2.72(1H，dd，J＝13.7，6.2Hz)，2.51(1H，dd，J＝13.7，9.1Hz)，2.04-2.20(3H，m)。[α]D25＝-11.0，在C＝1.01，甲醇中。M.P＝209-211℃。
反式-3-芐基-4-羥基-7-(3-羧基苯基)2H-1-苯并吡喃反式環(huán)異構(gòu)體如上所述皂化，得到相應(yīng)的酸。1H NMR(300MHz，CD3CN)8.22(1H，t，1.7Hz)，7.97(1H，dt，J＝7.8，1.7Hz)，7.87(1H，dt，J＝7.8，1.7Hz)，7.55(1H，t，J＝7.8Hz)，7.42(1H，d，J＝7.9Hz)，7.15-7.36(6H，m)，7.10(1H，d，J＝1.8Hz)，4.44(1H，d，J＝4.9Hz)，4.19(1H，dd，J＝9.1，2.5Hz)，3.97(1H，dd，J＝9.1，5.4Hz)，2.72(1H，dd，J＝13.7，6.2Hz)，2.51(1H，dd，J＝13.7，9.1Hz)，2.04-2.20(3H，m)。M.P＝210-212℃。
用于制備例4的原料N-α-叔丁氧羰基-L-色氨酸-7-[(3-羰基甲氧基苯基)-3-芐基]苯并吡喃-4-基]-酯制備如下A.2，4-二羥基-3-氯苯基·乙基酮將三氟甲磺酸(1kg)一次加入攪拌的間苯二酚(200g，1.82mol)和3-氯丙酸(200g，1.84mol)的混合物中。45分鐘內(nèi)將該溶液慢慢地加熱至80℃，然后在15分鐘內(nèi)冷卻至室溫并倒入氯仿(4.0L)中。將有機(jī)部分慢慢地倒入水(4.0L)中，分層。水層用氯仿(2次，2.0L)萃取。將合并的有機(jī)層用鹽水洗滌，用硫酸鈉干燥，并且過濾。真空濃縮，得到橙色半固體(244.1g)，該粗品用于下一步驟。1H NMR(300MHz，CDCl3)12.56(1H，s)，7.63(1H，d，J＝7.6Hz)，6.37-6.46(2H，m)，3.92(2H，t，J＝6.3Hz)，3.41(2H，t，J＝6.3Hz)。
B.7-羥基苯并吡喃-4-酮將步驟A的化合物(244.1g)一次加入冷卻的(5℃)2N氫氧化鈉溶液(10.0L)中。在2小時內(nèi)使用溫水浴將該溶液溫?zé)嶂潦覝兀缓笤倮鋮s至50℃，用6M硫酸(1.2L)調(diào)節(jié)pH至2。將該混合物用3.0L的乙酸乙酯萃取3次，用鹽水(2.0L，1次)洗滌，用硫酸鈉干燥，然后過濾。真空濃縮，得到黃褐色固體。用己烷研制，過濾，得到173.7g(58％產(chǎn)率)標(biāo)題化合物。M.P136℃-137℃。
C.7-[(三氟甲基磺酰基)氧基]-苯并吡喃-4-酮在-78℃下，將三乙胺(320g，3.16摩爾)和二甲基氨基吡啶(2.5g)加入攪拌著的7-羥基苯并吡喃-4-酮(173.7g，1.05摩爾)在二氯甲烷(3.0L)中的溶液中。全部溶解后，在20分鐘內(nèi)，滴加三氟甲烷磺酸酐(327g，1.16摩爾)，將該物質(zhì)在-78℃攪拌30分鐘，然后在2小時內(nèi)溫?zé)嶂潦覝?。將反?yīng)混合物倒入飽和氯化銨溶液(2.5L)中，分層。將水層用二氯甲烷(2次，2.0L)萃取。將合并的有機(jī)部份用水(1次，1.0L)洗滌，用硫酸鎂干燥，并且過濾。真空濃縮，得到紅色油。通過硅膠(1kg)層析，用(8∶1)己烷∶乙酸乙酯洗脫，除去溶劑后得到211.1g(69％產(chǎn)率)標(biāo)題產(chǎn)物。mp.43-44℃。
D.7-[(三氟甲基磺?；?氧基]-3-苯基甲基苯并吡喃-4-酮在攪拌著的7-[(三氟甲基磺?；?氧基]-苯并吡喃-4-酮(27g，91.2毫摩爾)在183mL甲醇中的溶液中加入苯甲醛(11.1mL，109mmol)，接著加入四氫化吡咯(9.1mL，109毫摩爾)。將該混合物在室溫下攪拌過夜，冷卻至0℃，并且過濾。將該固體用50mL冰冷的甲醇洗滌一次，然后真空干燥；得到35.2g(75％產(chǎn)率)標(biāo)題產(chǎn)物，mp.133-135℃。1H NMR(300MHz，CDCl3)8.11(1H，d，J＝8.7Hz)，7.91(1H，bs)，7.40-7.51(2H，m)，7.24-7.38(3H，m)，6.97(1H，dd，J＝8.7Hz，2.4Hz)，6.91(1H，d，J＝2.4Hz)，5.40(1H，bs)。
E.7-[(三氟甲基磺酰基)氧基]-3-苯基甲基-苯并吡喃-4-酮在500mL Parr搖動器燒瓶中，將10％鈀-碳催化劑(1.3g)加入7-[(三氟甲基磺酰基)氧基]-3-苯基甲基-苯并吡喃-4-酮(26.6g，69.2毫摩爾)在250mL乙酸乙酯中的溶液中。將該混合物在40psi的壓力下氫化，直到氫氣吸收停止(約3小時以后)。將混合物用Celite過濾，除去鈀催化劑，通過硅膠層析純化(己烷-醚)，得到25.1g(94％產(chǎn)率)標(biāo)題產(chǎn)物，mp.56-58℃。1H NMR(300MHz，CDCl3)8.01(1H，d，J＝8.5Hz)，7.20-7.35(5H.sub.，m)，6.981-6.96(2H，m)，4.42(1H，dd，J＝11.6，4.4Hz)，4.22(1H，dd，J＝11.6Hz，8.7Hz)，3.26(1H，dd，J＝14.0，4.4Hz)，2.90-3.05(1H，m)，2.70(1H，dd，J＝14.0，8.7Hz)。
F.7-(三甲基甲錫烷基)-3-苯基甲基苯并吡喃-4-酮將氯化鋰(3.20，75.0毫摩爾)、Pd(PPh3)、(1.15g，1.0毫摩爾)、丁基化羥基甲苯的3晶體(3 crystals)和六甲基二錫烷(hexamethyltin)(9.0g，27.5毫摩爾)加入攪拌著的74(三氟甲基磺?；?氧基]-3-苯基甲基苯并吡喃-4-酮(9.20g，25.0毫摩爾)在200mL二氧六環(huán)中的溶液中。將該混合物加熱回流1.5小時，冷卻至室溫，倒入150mL氯化銨飽和水溶液。將混合物用150mL乙醚萃取3次，將合并的有機(jī)層用鹽水洗滌，用硫酸鈉干燥，然后過濾。真空蒸發(fā)，得到黃色半固體，通過硅膠層析(5∶1己烷∶醚)，得到8.90g(89％產(chǎn)率)標(biāo)題產(chǎn)物，mp.84℃-86℃。1H NMR(300MHz，CDCl3)7.85(1H，d，J＝8.7Hz)，7.18-7.37(5H，m)，7.14(1H，d，J＝8.7Hz)，7.11(1H.s)，4.38(1H，dd，J＝11.6，4.5Hz)，4.17(1H，dd，J＝11.6Hz，8.4Hz)，3.28(1H.dd，J＝14.0，4.4Hz)，2.84-2.95(1H.m)，2.71(1H.dd，J＝I14Hz，J＝11.0Hz)，0.31(9H，s)。
G.7-(3-羰基甲氧基苯基)-3-)苯基甲基苯并吡喃-4-酮將Pd(PPh3)2Cl2(490mg，0.7毫摩爾)，BHT的3晶體和甲基-3-碘苯甲酸酯(5.0g，19.1mmole)加入攪拌著的7-(三甲基甲錫烷基)-3-苯基甲基苯并吡喃-4-酮(7.0g，17.5mmole)在二甲基甲酰胺(DMF)(35mL)中的溶液中。將該混合物攪拌回流1.5小時，冷卻至室溫，倒入150mL氯化銨飽和水溶液中。將該混合物用150mL乙醚萃取3次，將合并的萃取液用100mL水洗滌2次，然后用鹽水洗滌。將該溶液用硫酸鈉干燥，過濾，真空蒸發(fā)，得到黃色油。經(jīng)硅膠層析(4∶1己烷∶乙醚洗脫液)，得到6.51g粘性油狀標(biāo)題化合物。1H NMR(300MHz，CDCl3)8.29(1H，t，J＝1.6Hz)，8.06(1H，dd，J＝7.6，1.6Hz)，8.00(1H，d，J＝8.2Hz)，7.79(1H，dd，J＝7.6Hz，1.6Hz)，7.53(1H，t，J＝7.6Hz)，7.22-7.36(7H，m)，4.41(1H，dd，J＝11.6，4.5Hz)，4，21(1H，dd，J＝11.6，8.5Hz)，3.94(3H，s)，3.31(1H，dd，J＝14.0，4.4Hz)，2.91-2.99(1H，m)，2.73(1H，dd，J＝14.0，11.1Hz)H.7-(3-羰基甲氫基苯基)-4-羥基-3-苯基甲基苯并吡喃在室溫下，將硼氫化鈉(940mg，26.0mmol)一次加入攪拌著的7-(3-羰基甲氧基苯基)-3-)苯基甲基苯并吡喃-4-酮(6.50g，17.5mmol)在35mL甲醇中的溶液中。將深色混合物在室溫下攪拌2小時，然后倒入氯化銨飽和水溶液(75mL)中，用75mL乙醚萃取3次。將合并的萃取液用鹽水洗滌，用硫酸鈉干燥，過濾，真空濃縮，得到淡黃色油。通過硅膠層析，用4∶1己烷∶乙醚洗脫，首先得到3.26g標(biāo)題化合物的順式環(huán)異構(gòu)體，然后得到1.98g標(biāo)題化合物的反式異構(gòu)體，為粘稠的油，總收率81％。順式環(huán)異構(gòu)體1H NMR(300MHz，CDCl3)8.26(1H，t，J＝1.7Hz)，8.02(1H，dt，J＝7.8，1.7Hz)，7.76(1H，dt，J＝7.8，1.7Hz)，7.50(H，t，J＝7.8Hz)，7.41(1H，d，J＝7.9Hz)，7.31(1H，d，7.3Hz)，7.14-7.25(6H，m)，4.58(1H，t，J＝7.2Hz)，4.28(1H，dd，J＝9.1，2.5Hz)，4.03(1H，dd，J＝9.1，5.4Hz)，3.93(3H，s)，2.78(IH)，2.77(1H，dd，J＝13.7，6.2Hz)，2.58(1H，dd，J＝13.7，9.1Hz)，2.20-2.29(1H，m)，1.83(1H，d，J＝7.2Hz)。
反式環(huán)異構(gòu)體1H NMR(300MHz，CDCl3)8.23(1H，t，J＝1.7Hz)，7.98(1H，dt，J＝7.8Hz)，7.74(1H，dt，J＝7.8，1.7Hz)，7.48(H，t，J＝7.8Hz)，7.20-7.36(6H，m)，7.15(1H，dd，J＝8.0，1.8Hz)，7.09(1H，d，J＝1.8Hz)，4.56(1H，dt，J＝4.7，3.8Hz)，4.12-4.19(2H，m)，3.92(3H，s)，2.90(1H，dd，J＝13.6，8.4.Hz)，2.70(1H，dd，J＝13.6，7.2Hz)，2.36-2.39(1H，m)，1.75(1H，d，J＝4.7Hz)。
I.N-α-叔丁氧羰基-L-色氨酸-7-[(3-羰基甲氧基苯基)-3-苯基甲基]-苯并吡喃-4-基]-酯將DMAP(897mg，7.34mmol，1.1當(dāng)量)、DCC(1.51g，7.34mmol，1.1當(dāng)量)和N-t-Boc-L-色氨酸(2.4g，8.01mmol，1.2當(dāng)量)加入攪拌著的7-(3-羰基甲氧基苯基)-4-羥基-3-芐基苯并吡喃(2.5g，6.7mmol)在70ml的二氯甲烷中的溶液中。將該混合物在室溫下攪拌12小時，過濾，并用1M HCl和鹽水洗滌。有機(jī)層用MgSO4干燥，過濾，真空濃縮。層析純化(硅膠-3∶1-環(huán)己烷∶乙醚)，得到860mg極性較小的非對映體(Rf＝0.3)和極性較大的移動(moving)非對映體(Rf＝0.2)。極性較小的產(chǎn)物(3S，4R)1H NMR(300MHz，CDCl3)；8.29(1H，s)，8.03(2H，d，J＝7.8Hz)，7.77-7.83(2H，m)，7.52(2H，t，J＝7.6Hz)，7.02-7.33(5H，m)，6.64(1H，s)，5.65(1H，s)，5.06(1H，d，J＝8.4Hz)，4.58-4.62(1H，m)，3.95(3H.s)，3.73-3.85(2H，m)，3.18-3.28(2H，m)，2.45-2.61(2H，m)，2.09-2.15(1H，brds)，1.39(9H，s)。極性較大的產(chǎn)物(3R，4S)；1H-NMR(300MHz，CDCl3)8.25(1H，s)，8.01(1H.d，J＝7.8Hz)，7.94(1H，brds)，7.74(1H，d，J＝8.2Hz)，7.54(1H，d，J＝11.9Hz)，7.48(1H，t，J＝7.8Hz)，7.09-7.38(H，m)，6.95(1H，s)，5.61(1H，s)，5.08(1H，d，J＝8.2Hz)，4.55-4.60(1H，m)，3.94(3H，s)，3.73-3.76(2H，m)，3.22-3.35(2H，m)，2.42-2.60(2H，m)，1.90-1.96(1H，m)，1.39(9H，s)。
制備例5按照上面制備例4描述的方法，通過皂化制備下列表5中的化合物。
表5
制備例6按照制備例4，通過皂化相應(yīng)的酯，得到7-(4-羥基-3-羧基苯基)-4-羥基-3-苯基甲基-2H-1-苯并吡喃，熔點158-160℃(順式)和173-175℃(反式)。
盡管已經(jīng)參考某些具體的實施方案對本發(fā)明進(jìn)行了描述和演示，但是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)該理解，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的條件下，可以對本發(fā)明的過程和方案進(jìn)行各種調(diào)整、改變、改動、替代、刪除或添加。因此，本發(fā)明所限定的定義范圍為權(quán)利要求書的范圍，該權(quán)利要求應(yīng)該被合理地寬地進(jìn)行解釋。
權(quán)利要求
1.治療哺乳動物動脈粥樣硬化的方法，包括給予所述哺乳動物有效治療動脈粥樣硬化的量的下式化合物、其對映體或藥學(xué)上可接受的鹽 在上述式I化合物中，R3-取代的苯甲酸部分連接在苯并吡喃環(huán)的6或7碳上；R1為-(CH2)qCHR5R6，其中q為0到4；R2和R3各自獨(dú)立地選自氫，氟，氯，(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基，苯基亞磺酰基，苯基磺酰基以及(C1-C6)烷基-S(O)n-，其中n為0到2；其中上述的R2和R3烷基部分無論存在于何處都獨(dú)立地任選由一個到三個氟基取代；并且上述的R2和R3苯基部分無論存在于何處都獨(dú)立地任選由一個到三個氟基取代；R5為氫，(C1-C6)烷基或苯基；其中所述R5苯基任選地被氟，氯，(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基，苯基亞磺?；?，苯基磺?；?C1-C6)烷基-S(O)n-取代，其中n為0到2；并且其中所述的烷基部分無論存在于上述苯基取代基的何處都獨(dú)立地任選由一個到三個氟基取代；并且其中所述苯基部分無論存在于上述苯基的何處都獨(dú)立地任選由一個到三個氟基取代；R6為氫，(C1-C6)烷基，(C3-C8)環(huán)烷基，苯基或5到10元雜芳基；其中所述R6苯基任選地由氟，氯，(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基，苯基亞磺?；?，苯基磺?；?C1-C6)烷基-S(O)n-取代，其中所述n為0到2；并且其中所述烷基部分無論存在于上述苯基的何處都獨(dú)立地任選由一個到三個氟基取代；并且其中所述的苯基部分無論存在于上述苯基的何處都獨(dú)立地任選由一個到三個氟基取代；以及其中所述的5至10元雜芳基任選地由1或2個獨(dú)立地選自氟，氯，(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基，苯基亞磺酰基，苯基磺?；?C1-C6)烷基-S(O)n-的取代基取代，其中n為0到2；并且其中所述的烷基部分無論存在于上述5到10元雜芳基的何處都獨(dú)立地任選由一個到三個氟基取代；并且其中所述的苯基部分無論存在于上述5到10元雜芳基的何處都獨(dú)立地任選由一個到三個氟任選取代。
2.治療哺乳動物動脈粥樣硬化的方法，包括給予所述哺乳動物有效治療動脈粥樣硬化的量的權(quán)利要求1化合物，其中R1為芐基、4-氟芐基、4-苯基芐基、4-(4-氟苯基)芐基或苯乙基。
3.治療哺乳動物動脈粥樣硬化的方法，包括給予所述哺乳動物有效治療動脈粥樣硬化的量的權(quán)利要求1化合物，其中R2為氫或氟。
4.治療哺乳動物動脈粥樣硬化的方法，包括給予所述哺乳動物有效治療動脈粥樣硬化的量的權(quán)利要求1化合物，其中所述的R3-取代的苯甲酸部分連接在苯并吡喃環(huán)的碳7位并且其中所述的R3-取代的苯甲酸部分為2-羧基苯基、2-羧基-5-氯苯基、2-羧基-4-氯苯基、2-羧基-3-氟苯基、2-羧基-5-氟苯基、2-羧基-5-三氟甲基苯基、2-羧基-4-氟苯基、2-羧基-6-氟苯基或3-羧基苯基。
5.治療哺乳動物動脈粥樣硬化的方法，包括給予所述哺乳動物有效治療動脈粥樣硬化的量的權(quán)利要求1化合物，其中R1為芐基，R2為氫，并且所述的R3-取代的苯甲酸部分為2-羧基-5-氟苯基。
6.治療哺乳動物動脈粥樣硬化的方法，包括給予所述哺乳動物有效治療動脈粥樣硬化的量的權(quán)利要求1化合物，其中R1為4-苯基芐基，R2為氫，并且所述的R3-取代的苯甲酸部分為2-羧基-5-氟苯基或2-羧基-4-氯苯基。
7.治療哺乳動物動脈粥樣硬化的方法，包括給予所述哺乳動物有效治療動脈粥樣硬化的量的權(quán)利要求1化合物，其中所述的化合物為(3S，4R)-7-(2-羧基-5-三氟甲基苯基)-4-羥基-3-芐基-2H-1-苯并吡喃。
8.治療哺乳動物動脈粥樣硬化的方法，包括給予所述哺乳動物有效治療動脈粥樣硬化的量的權(quán)利要求1化合物，其中所述的式I化合物被浸滲在斯坦特印模中。
9.按照權(quán)利要求8的治療動脈粥樣硬化的方法，其中所述的化合物為(3S，4R)-7-(2-羧基-5-三氟甲基苯基)-4-羥基-3-芐基-2H-1-苯并吡喃。
10.治療哺乳動物主體中動脈粥樣硬化的方法，包括給予所述主體治療有效量的LTB4拮抗劑。
11.按照權(quán)利要求10的方法，其中所述的LTB4拮抗劑選自LTB4受體的抗體和LTB4基因的反義核酸。
12.按照權(quán)利要求10的方法，其中所述LTB4拮抗劑按照趨化性測定得到的LTB4的IC50小于約20nM。
13.治療具有動脈粥樣硬化病變的哺乳動物主體中動脈粥樣硬化的方法，包括給予所述主體有效降低上述病變形成的發(fā)展的有效量的小分子。
14.按照權(quán)利要求13的方法，其中所述LTB4拮抗劑按照趨化性測定得到的LTB4的IC50小于約20nM。
15.用于治療具有動脈粥樣硬化病變的哺乳動物主體中動脈粥樣硬化的藥物組合物，其中包括有效降低所述病變形成的發(fā)展的量的LTB4拮抗劑和藥學(xué)上可接受的載體。
全文摘要
一種治療哺乳動物，包括人類，動脈粥樣硬化的方法，包括給予上述哺乳動物有效治療動脈粥樣硬化的一定量的下式化合物、對映體或其藥用鹽，其中R
文檔編號A61K48/00GK1394602SQ0212512
公開日2003年2月5日 申請日期2002年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月28日
發(fā)明者羅伯特·J·艾洛, 帕特里夏－安·布拉薩, 薩拉林·林賽 申請人:輝瑞產(chǎn)品公司