專(zhuān)利名稱(chēng)：快速檢測(cè)志賀氏菌的lamp試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種快速檢測(cè)志賀氏菌的LAMP試劑盒，屬于食品檢測(cè)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
志賀氏菌屬(ShigellaCastellani and Chalmers)是一類(lèi)革蘭氏陰性桿菌，是人類(lèi)細(xì)菌性痢疾最為常見(jiàn)的病原菌，通稱(chēng)痢疾桿菌。細(xì)菌性痢疾是最常見(jiàn)的腸道傳染病，夏秋兩季患者最多。傳染源主要為病人和帶菌者，通過(guò)污染了痢疾桿菌的食物、飲水等經(jīng)口感染。人類(lèi)對(duì)志賀氏菌易感，10 200個(gè)細(xì)菌可使10 50%志愿者致病。一般說(shuō)來(lái)，志賀氏菌所致菌痢的病情較重。急性細(xì)菌性痢疾多見(jiàn)于小兒，各型痢疾桿菌都可引起。發(fā)病急，常在腹痛、腹瀉未出現(xiàn)，呈現(xiàn)嚴(yán)重的全身中毒癥狀。急性菌痢治療不徹底，或機(jī)體抵抗力低、營(yíng)養(yǎng)不良或伴有其他慢性病時(shí)，易轉(zhuǎn)為慢性。病程多在二個(gè)月以上，遷延不愈或時(shí)愈時(shí)發(fā)。
近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermalamplification, LAMP)技術(shù)以其靈敏度高、速度快、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)在基因定性檢測(cè)方面得到廣泛應(yīng)用，并且已經(jīng)成為當(dāng)前病毒核酸定性檢測(cè)的重要方法之一。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)技術(shù)是一種新型等溫核酸擴(kuò)增方法，該法針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異引物，利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)，在恒溫條件(65°C左右)保溫約60min，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的反應(yīng)副產(chǎn)物-白色焦磷酸鎂沉淀。該技術(shù)具有不需要PCR儀、擴(kuò)增產(chǎn)物不需要開(kāi)蓋，用肉眼即可判斷結(jié)果及反應(yīng)時(shí)間短，特異性強(qiáng)，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。傳統(tǒng)檢測(cè)志賀氏菌的培養(yǎng)方法，需要分離、篩選和生化鑒定，必要時(shí)還需要血清學(xué)鑒定，一般為4 6d，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，具有靈敏度低、特異性差、假陽(yáng)性、耗時(shí)費(fèi)力等缺點(diǎn)。各種常規(guī)PCR方法具有敏感性強(qiáng)、特異性高、簡(jiǎn)便、快速等優(yōu)點(diǎn)，有較多應(yīng)用于志賀氏菌檢測(cè)的報(bào)道，但由于存在PCR后處理產(chǎn)生污染導(dǎo)致的假陽(yáng)性等問(wèn)題以及需要特殊的儀器設(shè)備而限制了其在基層單位的應(yīng)用。因此隳待開(kāi)發(fā)精確、靈敏、快速、無(wú)污染的臨床檢驗(yàn)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種快速檢測(cè)志賀氏菌的LAMP試劑盒及其使用方法。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種快速檢測(cè)志賀氏菌的LAMP試劑盒，該試劑盒包括a) LAMP反應(yīng)液，b)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板，c)陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品；LAMP反應(yīng)液含有引物，引物為以下4組特異性引物中的任意一組(I)上游外引物 F3 :5' -TCTGGAGGACATTGCCCG-3' ; (SEQ ID No. I)下游外引物B3:5' -GCTTCTGACCATGGCTTCG-3' ；(SEQ ID No. 2)上游內(nèi)引物FIP :5'-
GCATGGTCTGGAAGGCCAGGAAGTCAGAACTCTCCATTTTGTGG-3' ；(SEQ ID No. 3)下游內(nèi)引物BIP :5' -TCGCAGAGAAACTTCAGCTCTCCCGGAGGTCATTTGCTGTCAC-3 '；(SEQ ID No. 4)(2)上游外引物 F3 :5' -GGCAGGGAAATGTTCCGC-3' ; (SEQ ID No. 5)下游外引物B3 :5' -GCTTCTGACCATGGCTTCG-3' ; (SEQ ID No. 6 )上游內(nèi)引物FIP : 5 ' -GGTCTGGAAGGCCAGGTAGACTTCTGGAGGACATTGCCCG-3 ' ; (SEQID No. 7)下游內(nèi)引物BIP :5 ' -TGCTCGCAGAGAAACTTCAGCTTGCTGTCACTCCCGACAC-3 ' ; (SEQID No. 8)
(3)上游外引物 F3 :5' -GCAGGGAAATGTTCCGCC-3' ; (SEQ ID No. 9)下游外引物B3 :5' -CTTCTGACCATGGCTTCGG-3' ；(SEQ IDNo. 10)上游內(nèi)引物FIP : 5' -GGTCTGGAAGGCCAGGTAGACTGAGGACATTGCCCGGGATA-3' ; (SEQID No. 11)下游內(nèi)引物BIP 5 ' -TGCTCGCAGAGAAACTTCAGCTAGGTCATTTGCTGTCACTCC-3 '；(SEQ ID No. 12)(4)上游外引物 F3 :5' -CGCCTCGAAATTCTGGAGG-3' ; (SEQ ID No. 13)下游外引物B3 :5' -GCTTCTGACCATGGCTTCG-3' ; (SEQ ID No. 14)上游內(nèi)引物FIP :5 ' -GGTCTGGAAGGCCAGGTAGACTACATTGCCCGGGATAAAGTC-3 '；(SEQ ID No. 15)下游內(nèi)引物BIP :5 ' -TGCTCGCAGAGAAACTTCAGCTTGCTGTCACTCCCGACAC-3 ' ; (SEQID No. 16)具體地說(shuō)，a) LAMP 反應(yīng)液LAMP反應(yīng)液由Bst DNA聚合酶大片段、LAMPlO Xbuffer、10 μ mol/L的外引物、10 μ mol/L 的內(nèi)引物、5mol/L 甜菜喊、50mmol/L MgSO4 和 10mmol /T, dNTPs 組成。在本發(fā)明的一個(gè)具體方案中，LAMP反應(yīng)液由LAMP IOXbuffer 2. 5 μ 1，10 μ mol/L 內(nèi)弓 I 物 FIP、BIP 各 2· O μ 1，10 μ mol/L 夕卜引物 F3、B3 各 I. O μ 1，IOmmoI/LdNTPs3. 0μ I, 50mmol/L MgS043. 0 μ 1，5. Omol/L 甜菜堿 4· 5 μ 1，Bst DNA 聚合酶大片段I. O μ I組成,反應(yīng)液總體積20 μ I。b)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板是含有志賀氏菌高度保守基因ipaH基因351個(gè)堿基對(duì)的核苷酸片段構(gòu)成的pMD18-T_ipaH載體，該載體可在大腸桿菌DH5 α中增殖。ipaH基因的核苷酸序列為5 ' -CTCACATGGAACAATCTCCGGAAAACCCTCCTGGTCCATCAGGCATCTGAAGGCCTTTTCGATAATGATACCGGCGCTCTGCTCTCCCTGGGCAGGGAAATGTTCCGCCTCGAAATTCTGGAGGACATTGCCCGGGATAAAGTCAGAACTCTCCATTTTGTGGATGAGATAGAAGTCTACCTGGCCTTCCAGACCATGCTCGCAGAGAAACTTCAGCTCTCCACTGCCGTGAAGGAAATGCGTTTCTATGGCGTGTCGGGAGTGACAGCAAATGACCTCCGCACTGCCGAAGCCATGGTCAGAAGCCGTGAAGAGAATGAATTTACGGACTGGTTCTCCCTCTGGGGACCA-3' (SEQ ID No. 17)實(shí)驗(yàn)所用的標(biāo)準(zhǔn)品為含有目的擴(kuò)增片段的質(zhì)粒pMD18-T_ipaH，該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α增殖后用堿裂解法提取，經(jīng)DNA純化試劑盒純化，_20°C保存。c)陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品為無(wú)菌雙蒸水。本試劑盒的工作原理使用本發(fā)明提供的快速可視化檢測(cè)志賀氏菌LAMP試劑盒，在恒溫條件下(65°C左右)保溫約60min，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，并伴隨產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的反應(yīng)副產(chǎn)物-白色焦磷酸鎂沉淀。反應(yīng)結(jié)束后，12000r/min離心30s，即可用肉眼觀察管底白色沉淀。在本發(fā)明提供的快速檢測(cè)志賀氏菌LAMP試劑盒中，針對(duì)志賀氏菌檢測(cè)中的特殊性，對(duì)不同的靶片段進(jìn)行反應(yīng)體系，如引物、dNTPs、Mg2+濃度、甜菜堿等的優(yōu)化，通過(guò)優(yōu)化方案，反復(fù)實(shí)驗(yàn)，建立了檢
測(cè)志賀氏菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法，并研制出檢測(cè)志賀氏菌的LAMP試劑盒，該試劑盒的靈敏度可在每個(gè)反應(yīng)體系中檢出10拷貝，可以滿(mǎn)足快速檢測(cè)志賀氏菌的要求。使用本發(fā)明的LAMP試劑盒檢測(cè)志賀氏菌的方法，包括以下步驟a)用緩沖蛋白胨水(BPW)按照國(guó)標(biāo)法培養(yǎng)待檢樣品l_4h ； b)用水煮法從待測(cè)樣品中提取DNA ；c)取b)步中的樣品DNA加入到LAMP試劑盒的反應(yīng)液中，65°C保溫Ih ;同時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板和陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品分別做陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。d)反應(yīng)結(jié)束后，離心，肉眼觀察沉淀，對(duì)樣品進(jìn)行定性分析。在本發(fā)明中提供的快速檢測(cè)志賀氏菌LAMP試劑盒可對(duì)志賀氏菌進(jìn)行定性檢測(cè)，并可替代一直沿用的傳統(tǒng)的培養(yǎng)法和血清法檢測(cè)方法。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果I、與傳統(tǒng)培養(yǎng)法相比，檢測(cè)速度快，僅lh，加上樣品DNA的提取制備，總共不超過(guò)5h。2、特異性好，靈敏度高；3、步驟簡(jiǎn)單，可重復(fù)性高；4、可同時(shí)進(jìn)行多個(gè)樣品檢測(cè)。


圖I為實(shí)施例I中志賀氏菌離心后觀察白色沉淀結(jié)果，圖中I 一標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板， 2—陰性對(duì)照，3—志賀氏菌陽(yáng)性樣本，4一志賀氏菌陽(yáng)性樣本,5—志賀氏菌陽(yáng)性樣本,6—志賀氏菌陰性樣本，7—志賀氏菌陰性樣本，8—志賀氏菌陰性樣本；圖2為實(shí)施例I中志賀氏菌I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果圖，圖中M一DNA Marker,I一標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板， 2—陰性對(duì)照，3—志賀氏菌陽(yáng)性樣本,4一志賀氏菌陽(yáng)性樣本,5—志賀氏菌陽(yáng)性樣本，6—志賀氏菌陰性樣本，7—志賀氏菌陰性樣本，8—志賀氏菌陰性樣本；圖3為實(shí)施例2中志賀氏菌離心后觀察白色沉淀結(jié)果，圖中I-標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板，2-陰性對(duì)照，3-志賀氏菌陽(yáng)性樣本，4一志賀氏菌陽(yáng)性樣本，5—志賀氏菌陽(yáng)性樣本，6—志賀氏菌陰性樣本，7—志賀氏菌陰性樣本，8—志賀氏菌陰性樣本；
圖4為實(shí)施例3中志賀氏菌離心后觀察白色沉淀結(jié)果，圖中I 一標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板， 2—陰性對(duì)照，3—志賀氏菌陽(yáng)性樣本，4一志賀氏菌陽(yáng)性樣本，5—志賀氏菌陽(yáng)性樣本，6—志賀氏菌陰性樣本，7—志賀氏菌陰性樣本，8—志賀氏菌陰性樣本；圖5為實(shí)施例4中志賀氏菌離心后觀察白色沉淀結(jié)果，圖中I 一標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板， 2—陰性對(duì)照，3—志賀氏菌陽(yáng)性樣本，4一志賀氏菌陽(yáng)性樣本,5—志賀氏菌陽(yáng)性樣本,6—志賀氏菌陰性樣本，7—志賀氏菌陰性樣本，8—志賀氏菌陰性樣本；圖6為實(shí)施例5中志賀氏菌LAMP試劑盒特異性實(shí)驗(yàn)觀察白色沉淀結(jié)果，圖中I 一標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板， 2—陰性對(duì)照，3—痢疾志賀氏菌樣本，4一宋內(nèi)志賀氏菌樣本，5—弗式志賀氏菌樣本，6 —甲型副傷寒沙門(mén)氏菌樣本，7—腸炎沙門(mén)氏菌樣本，8—金黃色葡萄球菌樣本；9一單增李斯特菌樣本；圖7為實(shí)施例6中志賀氏菌LAMP試劑盒靈敏度實(shí)驗(yàn)觀察白色沉淀結(jié)果，圖中
I一稀釋10 1倍，2一稀釋10 2倍，3一稀釋10 3倍，4一稀釋10 4倍，5一稀釋10 5倍，6一稀釋10 6倍，7一稀釋10 7倍，8一稀釋10 8倍，9一稀釋10 9倍，10—稀釋 1(T1CI 倍。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施實(shí)例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施實(shí)例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護(hù)的范圍，下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件和方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等主編，科學(xué)出版社，1992，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第二版)；D. L.斯佩克特等，科學(xué)出版社，2001，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南；呂鴻聲，科學(xué)出版社，1982，或接照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例I :I.新型快速可視化檢測(cè)志賀氏菌LAMP試劑盒組成與配制，試劑組成a) LAMP反應(yīng)混合液LAMP 反應(yīng)混合液由 LAMP IOXbuffer 2. 5 μ 1，10 μ mol/L 內(nèi)引物 FIP、BIP各 2.0 μ 1，10 μ mol/L 夕卜弓 I 物 F3、B3 各 I. O μ 1，10mmol/L dNTPs 3· O μ 1，50mmol/LMgS043. 0 μ 1,5. Omol/L甜菜堿4. 5 μ 1，Bst DNA聚合酶大片段I. O μ I組成，反應(yīng)液總體積20 μ I。其中引物序列如下上游外引物F3:5' -TCTGGAGGACATTGCCCG-3'；下游外引物B3:5' -GCTTCTGACCATGGCTTCG-3'；上游內(nèi)引物FIP :5'-GCATGGTCTGGAAGGCCAGGAAGTCAGAACTCTCCATTTTGTGG-3'；下游內(nèi)引物BIP :5' -TCGCAGAGAAACTTCAGCTCTCCCGGAGGTCATTTGCTGTCAC-3'；b)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板pMD18-T_ipaH是含有志賀氏菌高度保守基因ipaH基因351個(gè)堿基對(duì)的核苷酸片段構(gòu)成的pMD18-T-ipaH載體，該載體可在大腸桿菌DH5 α中增殖；實(shí)驗(yàn)所用的標(biāo)準(zhǔn)品為含有目的擴(kuò)增片段的質(zhì)粒pMD18-T_ipaH，該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α增殖后用堿裂解法提取，經(jīng)DNA純化試劑盒純化，-20°C保存。c)陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品為無(wú)菌雙蒸水。2.使用所述基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)工業(yè)食品中志賀氏菌的PCR試劑盒檢測(cè)志賀氏菌的方法，包括以下步驟·a、食物樣品預(yù)處理取3份經(jīng)傳統(tǒng)培養(yǎng)法鑒定的志賀氏菌陽(yáng)性食品，3份志賀氏菌陰性食品，分別稱(chēng)取25g (mL)樣品放入盛有225mL BPff的無(wú)菌均質(zhì)杯中，以8000r/min 10000r/min均質(zhì)Imin 2min,或置于盛有225mL BPff的無(wú)菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打Imin 2min。若樣品為液態(tài),不需要均質(zhì),振蕩混勻即可。無(wú)菌操作將樣品轉(zhuǎn)至500mL錐形瓶中，如使用均質(zhì)袋，可直接進(jìn)行培養(yǎng)，于36°C ±1°C培養(yǎng)l_4h。如為冷凍產(chǎn)品，應(yīng)在450C以下不超過(guò)15min解凍。b、細(xì)菌模板DNA的制備分別取100 μ L細(xì)菌培養(yǎng)物，12000r/min離心2min，去上清，加入50 μ L無(wú)菌水,充分混勻，100°C水浴IOmin, 12000r/min離心2min,上清即為模板DNA。c、LAMP反應(yīng)分別取5 μ I b)步中樣本上清加入到20 μ I LAMP反應(yīng)液中，65°C恒溫?cái)U(kuò)增60min。同時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板和陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品分別做陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。d、結(jié)果判定待反應(yīng)結(jié)束后12000r/min離心30S，觀察有無(wú)沉淀產(chǎn)生(見(jiàn)附圖I)。取5 μ I LAMP產(chǎn)物用I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，陽(yáng)性樣本都有條帶，陰性樣本則無(wú)條帶(見(jiàn)附圖2)。附圖I為離心后觀察白色沉淀結(jié)果，附圖2為I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。e、結(jié)論反復(fù)重復(fù)試驗(yàn)3次，所得檢測(cè)結(jié)果相同，實(shí)驗(yàn)組均有沉淀或電泳條帶，對(duì)照組均無(wú)沉淀或電泳條帶，與預(yù)期結(jié)果一致。說(shuō)明本試劑盒檢測(cè)志賀氏菌效果良好，沉淀觀察法與電泳檢測(cè)法效果一致，并且不同批次之間的檢測(cè)結(jié)果具有可比性，具有良好的重復(fù)性。實(shí)施例2 I.新型快速可視化檢測(cè)志賀氏菌LAMP試劑盒組成與配制，與實(shí)施例I所述試劑盒的不同之處在于特異性引物序列不同，本試劑盒的引物序列如下上游外引物F3:5' -GGCAGGGAAATGTTCCGC-3'；下游外引物B3 :5' -GCTTCTGACCATGGCTTCG-3'；上游內(nèi)引物FIP :5' -GGTCTGGAAGGCCAGGTAGACTTCTGGAGGACATTGCCCG-3'；下游內(nèi)引物BIP :5' -TGCTCGCAGAGAAACTTCAGCTTGCTGTCACTCCCGACAC-3'；2.使用所述基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)工業(yè)食品中志賀氏菌的PCR試劑盒檢測(cè)志賀氏菌的方法與實(shí)施例I所述方法完全相同，反復(fù)重復(fù)試驗(yàn)3次，所得檢測(cè)結(jié)果相同，實(shí)驗(yàn)組均有沉淀，對(duì)照組均無(wú)沉淀(見(jiàn)附圖3)，與預(yù)期結(jié)果一致。說(shuō)明本試劑盒檢測(cè)志賀氏菌效果良好，并且不同批次之間的檢測(cè)結(jié)果具有可比性，具有良好的重復(fù)性。實(shí)施例3 I.新型快速可視化檢測(cè)志賀氏菌LAMP試劑盒組成與配制，與實(shí)施例I所述試劑盒的不同之處在于特異性引物序列不同，本試劑盒的引物序列如下
上游外引物F3 :5' -GCAGGGAAATGTTCCGCC-3'；下游外引物B3 :5' -CTTCTGACCATGGCTTCGG-3'；上游內(nèi)引物FIP : 5' -GGTCTGGAAGGCCAGGTAGACTGAGGACATTGCCCGGGATA-3'；下游內(nèi)引物BIP :5' -TGCTCGCAGAGAAACTTCAGCTAGGTCATTTGCTGTCACTCC-3'；2.使用所述基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)工業(yè)食品中志賀氏菌的PCR試劑盒檢測(cè)志賀氏菌的方法與實(shí)施例I所述方法完全相同，反復(fù)重復(fù)試驗(yàn)3次，所得檢測(cè)結(jié)果相同，實(shí)驗(yàn)組均有沉淀，對(duì)照組均無(wú)沉淀(見(jiàn)附圖4)，與預(yù)期結(jié)果一致。說(shuō)明本試劑盒檢測(cè)志賀氏菌效果良好，并且不同批次之間的檢測(cè)結(jié)果具有可比性，具有良好的重復(fù)性。實(shí)施例4:
I.新型快速可視化檢測(cè)志賀氏菌LAMP試劑盒組成與配制，與實(shí)施例I所述試劑盒的不同之處在于特異性引物序列不同，本試劑盒的引物序列如下上游外引物F3:5' -CGCCTCGAAATTCTGGAGG-3'；下游外引物B3:5' -GCTTCTGACCATGGCTTCG-3'；上游內(nèi)引物FIP : 5' -GGTCTGGAAGGCCAGGTAGACTACATTGCCCGGGATAAAGTC-3'；下游內(nèi)引物BIP :5' -TGCTCGCAGAGAAACTTCAGCTTGCTGTCACTCCCGACAC-3'；2.使用所述基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)工業(yè)食品中志賀氏菌的PCR試劑盒檢測(cè)志賀氏菌的方法與實(shí)施例I所述方法完全相同，反復(fù)重復(fù)試驗(yàn)3次，所得檢測(cè)結(jié)果相同，實(shí)驗(yàn)組均有沉淀，對(duì)照組均無(wú)沉淀(見(jiàn)附圖5)，與預(yù)期結(jié)果一致。說(shuō)明本試劑盒檢測(cè)志賀氏菌效果良好，并且不同批次之間的檢測(cè)結(jié)果具有可比性，具有良好的重復(fù)性。實(shí)施例5 :基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)工業(yè)食品中志賀氏菌的PCR試劑盒的特異性實(shí)驗(yàn)a、DNA模板的制備分別取經(jīng)過(guò)DNA有效性驗(yàn)證的痢疾志賀氏菌、宋內(nèi)志賀氏菌、弗式志賀氏菌、甲型副傷寒沙門(mén)氏菌、腸炎沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌的菌液10 μ I，12000r/min離心2min，去上清，加入50 μ L無(wú)菌水，充分混勻，100°C水浴IOmin, 12000r/min 離心 2min,上清即為模板 DNA。b、LAMP反應(yīng)取51 μ I a)步中樣本上清加入到20 μ I LAMP反應(yīng)液中，65°C恒溫?cái)U(kuò)增60min。同時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板和陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品分別做陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。C、結(jié)果判定待反應(yīng)結(jié)束后12000r/min離心30S，觀察有無(wú)沉淀產(chǎn)生(見(jiàn)附圖6)。附圖6為志賀氏菌LAMP試劑盒特異性實(shí)驗(yàn)觀察白色沉淀結(jié)果。d、結(jié)論結(jié)果顯示只有陽(yáng)性對(duì)照組、痢疾志賀氏菌、宋內(nèi)志賀氏菌、弗式志賀氏菌有白色沉淀，而甲型副傷寒沙門(mén)氏菌、腸炎沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌和陰性對(duì)照沒(méi)有白色沉淀。上述實(shí)驗(yàn)說(shuō)明本試劑盒具有良好的特異性。實(shí)施例6 :快速檢測(cè)志賀氏菌LAMP試劑盒靈敏度實(shí)驗(yàn)a、取Iml過(guò)夜培養(yǎng)的痢疾志賀氏菌培養(yǎng)液做10倍倍比稀釋?zhuān)♂屩?0_1(1。取每個(gè)稀釋度的菌液10 μ 1,120001'/111；[11離心2111；[11,去上清,加入5(^ L無(wú)菌水,充分混勻，100°C水浴IOmin, 12000r/min離心2min,上清即為模板DNA。b、LAMP反應(yīng)取5 μ I a)步中樣本上清加入到20 μ I LAMP反應(yīng)液中，65°C恒溫?cái)U(kuò)增 60min。
C、結(jié)果判定反應(yīng)結(jié)束后，12000r/min離心30s觀察管底是否產(chǎn)生白色沉淀，結(jié)果顯示KT1-KT8樣本管底均有白色沉淀，10_9-10_1(1樣本管底則沒(méi)有白色沉淀(見(jiàn)附圖7)。附圖7為志賀氏菌LAMP試劑盒靈敏度實(shí)驗(yàn)觀察白色沉淀結(jié)果。d、結(jié)論結(jié)果顯示當(dāng)菌液稀釋至10_8時(shí)仍能檢測(cè)出，最低檢測(cè)極限為50CFU/ml。
上述實(shí)驗(yàn)說(shuō)明本試劑盒具有良好的靈敏度。從上述實(shí)例可以說(shuō)明，LAMP檢測(cè)方法特異性好，靈敏度高，重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)便，而且LAMP檢測(cè)試劑盒對(duì)樣品的檢測(cè)僅需不到5個(gè)小時(shí)就能完成，而傳統(tǒng)的培養(yǎng)法約需I周左右才能完成，因此，使用該試劑盒可以大大縮短檢測(cè)時(shí)間。
該試劑盒的操作只需I人即可完成整個(gè)操作過(guò)程，一次可檢測(cè)多個(gè)(由實(shí)際檢測(cè)需要決定)樣品，這樣也減少了人力資源的浪費(fèi)。
權(quán)利要求
1.ー種快速檢測(cè)志賀氏菌的LAMP試劑盒，其特征在于，由LAMP反應(yīng)液、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板、陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品組成；LAMP反應(yīng)液含有引物，引物為以下4組特異性引物中的任意ー組 (I)上游外引物 F3 :5' -TCTGGAGGACATTGCCCG-3'； 下游外引物 B3 :5' -GCTTCTGACCATGGCTTCG-3'； 上游內(nèi)引物FIP :5'-GCATGGTCTGGAAGGCCAGGAAGTCAGAACTCTCCATTTTGTGG-3'； 下游內(nèi)引物 BIP :5' -TCGCAGAGAAACTTCAGCTCTCCCGGAGGTCATTTGCTGTCAC-3'； (2 )上游外引物 F3 :5' -GGCAGGGAAATGTTCCGC-3'；下游外引物 B3 :5' -GCTTCTGACCATGGCTTCG-3'； 上游內(nèi)引物 FIP : 5' -GGTCTGGAAGGCCAGGTAGACTTCTGGAGGACATTGCCCG-3'； 下游內(nèi)引物 BIP :5' -TGCTCGCAGAGAAACTTCAGCTTGCTGTCACTCCCGACAC-3'； (3 )上游外引物 F3 :5' -GCAGGGAAATGTTCCGCC-3'； 下游外引物 B3 :5' -CTTCTGACCATGGCTTCGG-3'； 上游內(nèi)引物 FIP : 5' -GGTCTGGAAGGCCAGGTAGACTGAGGACATTGCCCGGGATA-3'； 下游內(nèi)引物 BIP :5' -TGCTCGCAGAGAAACTTCAGCTAGGTCATTTGCTGTCACTCC-3'； (4 )上游外引物 F3 :5' -CGCCTCGAAATTCTGGAGG-3'； 下游外引物 B3 :5' -GCTTCTGACCATGGCTTCG-3'； 上游內(nèi)引物 FIP : 5' -GGTCTGGAAGGCCAGGTAGACTACATTGCCCGGGATAAAGTC-3'； 下游內(nèi)引物 BIP :5' -TGCTCGCAGAGAAACTTCAGCTTGCTGTCACTCCCGACAC-3'。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的LAMP試劑盒，其特征是，LAMP反應(yīng)液由BstDNA聚合酶大片段、LAMPlO X buffer、10 μ mol/L 的外引物、10 μ mol/L 的內(nèi)引物、5mol/L 舌甘菜喊、50mmol/LMgSO4 和 10mmol/L dNTPs 組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的LAMP試劑盒，其特征是，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板是含有志賀氏菌高度保守基因ipaH基因351個(gè)堿基對(duì)的核苷酸片段構(gòu)成的pMD18-T-ipaH載體， ipaH基因的核苷酸序列為SEQ ID No. 17所示。
4.使用權(quán)利要求I 3所述的LAMP試劑盒檢測(cè)志賀氏菌的方法，其特征在于，包括以下步驟 ①用緩沖蛋白胨水按照國(guó)標(biāo)法培養(yǎng)待檢樣品4h； ②用水煮法從待測(cè)樣品中提取DNA； ③將DNA加入到LAMP試劑盒的反應(yīng)體系中，65°C保溫Ih;同時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板和陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品分別做陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。
④反應(yīng)結(jié)束后，離心，肉眼觀察沉淀，對(duì)樣品進(jìn)行定性分析。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種快速檢測(cè)志賀氏菌的LAMP試劑盒，由LAMP反應(yīng)液、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板、陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品組成；LAMP反應(yīng)液含有Bst DNA聚合酶大片段、引物、LAMP10×buffer、dNTPs溶液、MgSO4溶液和甜菜堿。引物分為正向引物和反向引物。本發(fā)明具有特異性好，靈敏度高，快速簡(jiǎn)便，可重復(fù)性高以及肉眼可判斷結(jié)果等優(yōu)點(diǎn)，可對(duì)工業(yè)食品中志賀氏菌進(jìn)行快速定性檢測(cè)，并可替代一直沿用的傳統(tǒng)的培養(yǎng)法和血清學(xué)診斷方法。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK102851382SQ201210355510
公開(kāi)日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2012年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月21日
發(fā)明者王業(yè)富, 鄭虎, 盧晅 申請(qǐng)人:武漢真福醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司