專利名稱：一個(gè)簇毛麥6vs染色體特異的分子標(biāo)記6vs-lem及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和遺傳育種科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ー個(gè)特異追蹤簇毛麥6VS染色體的分子標(biāo)記及其用法。
背景技術(shù)：
小麥?zhǔn)侨蛉蠹Z食作物之一，也是我國(guó)總產(chǎn)第一的糧食作物，是保障我國(guó)糧食安全的重要決定因素之一。小麥在其生育進(jìn)程中常會(huì)受到生物或非生物脅迫的影響。小麥白粉病是ー種世界性小麥病害，近年來隨著我國(guó)農(nóng)田水利設(shè)施改善和水肥條件提高，其危害逐年加重。通過遠(yuǎn)緣雜交和染色體工程技術(shù)手段育成的小麥-簇毛麥T6AL. 6VS易位系對(duì)目前已發(fā)現(xiàn)的白粉病生理小種均表現(xiàn)高抗或免疫，其抗白粉病基因Pm21位于簇毛麥6V染色體短臂上(6VS)，是目前對(duì)小麥白粉病抗譜最廣、抗性最強(qiáng)的基因(見參考文獻(xiàn)ChenPD, Qi LL, Zhou B, Znang Sa, Liu DJ. Development and molecular cytogenetic analysisof wheat-Haynaldia villosa 6VS/6AL translocation lines specifying resistance topowdery mildew. Theor Appl Genet, 1995，91 (6-7) : 1125-1128)。近年來 T6AL. 6VS 易位系在小麥抗白粉病新品種選育中得到廣泛利用，目前已育成20多個(gè)抗白粉病小麥新品種，推廣面積超過5000萬畝。T6AL. 6VS易位系是在普通小麥遺傳背景中由簇毛麥6V染色體短臂(6VS)替換了普通小麥6A染色體的短臂(6AS)，從而形成T6AL. 6VS易位染色體。由于簇毛麥與普通小麥親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，導(dǎo)致二者不發(fā)生染色體重組，T6AL. 6VS易位染色體始終以易位的形式出現(xiàn)在后代中。目前，未發(fā)現(xiàn)利用T6AL. 6VS易位系培育的新品種或新品系中出現(xiàn)染色體易位形式的改變。因此，簇毛麥6VS控制的性狀及其載有的DNA序列均以協(xié)同傳遞的方式出現(xiàn)在后代中。目前，部分研究已公布了部分與6VS上抗白粉病基因Pm21連鎖的相關(guān)分子標(biāo)記OPTni徹、0PT1719QQ、SCAR1400, SCAR1265, NAU/XiBaol5902 和 NAU/XiBaol61586。但是，總體而言，這些標(biāo)記在標(biāo)記輔助選擇育種中都存在不穩(wěn)定的缺點(diǎn)，ー個(gè)原因是由標(biāo)記類型決定的，如RAPD標(biāo)記0PT1714(i(i和0PT1719(i(i ;其次是由于標(biāo)記序列過長(zhǎng)(大多接近或超過1000bp)、PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件要求苛刻，PCR結(jié)果可重復(fù)性差造成的。這些缺點(diǎn)均不利于標(biāo)記輔助選擇技術(shù)在小麥育種實(shí)踐中的應(yīng)用。EST (expressed sequence tag,表達(dá)序列標(biāo)簽)是指從植物不同組織來源的cDNA文庫(kù)中隨機(jī)挑選克隆，對(duì)其5’和3’端進(jìn)行測(cè)序獲得的短cDNA序列。EST-STS(sequence-tagged site, STS)標(biāo)記是直接依據(jù)已經(jīng)定位于基因組物理圖上的EST序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)基因組或者cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，從中尋找與目的基因連鎖或具有染色體特異性的EST標(biāo)記。由于EST-STS標(biāo)記直接來源于表達(dá)基因序列，保守性較高，特別有利于界定物種之間的差異。因此，基于比較基因組學(xué)原理，利用與小麥親緣關(guān)系較近的短柄草的基因組序列信息，可以開發(fā)普通小麥親緣物種簇毛麥特定染色體的特異性EST-STS分子標(biāo)記。本發(fā)明就是基于上述思想指導(dǎo)下，利用比較基因組學(xué)原理，根據(jù)可電子定位于短柄草3號(hào)染色體短臂的小麥族作物EST序列設(shè)計(jì)以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的EST-STS標(biāo)記，篩選簇毛麥6V染色體短臂(6VS)特異性分子標(biāo)記，用于快速檢測(cè)和追蹤普通小麥遺傳背景中T6AL. 6VS易位染色體及其控制的抗白粉病性狀，為小麥抗白粉病分子標(biāo)記輔助選擇育種提供新型、實(shí)用、高效的分子標(biāo)記。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種特異追蹤簇毛麥6VS染色體的分子標(biāo)記及其用法，它利用比較基因組學(xué)原理，根據(jù)可電子定位于短柄草3號(hào)染色體短臂的小麥EST序列，設(shè)計(jì)以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的EST-STS標(biāo)記引物，篩選簇毛麥6VS染色體特異性分子標(biāo)記，為抗白粉病小麥-簇毛麥T6AL. 6VS易位系在小麥抗白粉病新品種培育中的應(yīng)用提供ー種新型、實(shí)用、高效的分子標(biāo)記輔助選擇技木。為了解決背景技術(shù)所存在的問題，本發(fā)明是采用以下技術(shù)方案它是根據(jù)可電子定位于短柄草3號(hào)染色體短臂的小麥EST序列BE404563設(shè)計(jì)得到的，標(biāo)記引物擴(kuò)增出的一段約350bp的DNA條帶位于簇毛麥6VS染色體，可以特異地追蹤6VS染色體及其控制的抗 小麥白粉病性狀，標(biāo)記引物序列為6VS-LEMF :5’ -CCAGGAGGGCCTCCAGGA-3’ (SEQ ID NO. I),6VS-LEMR :5，-CTGGGAGCTCCTGCTGCGT-3，(SEQ ID NO. 2)。本發(fā)明還公開了所述的簇毛麥6VS染色體特異的分子標(biāo)記6VS-LEM在追蹤小麥-簇毛麥T6AL. 6VS易位染色體中的用途。用所述的簇毛麥6VS染色體特異的分子標(biāo)記6VS-LEM追蹤小麥-簇毛麥T6AL. 6VS易位染色的方法，是用該分子標(biāo)記引物對(duì)待測(cè)材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出350bp條帶的材料，為含有小麥-簇毛麥T6AL. 6VS易位染色體的材料。本發(fā)明所述分子標(biāo)記的具體用法為(I) PCR反應(yīng)體系IOii L反應(yīng)體系中含約10 20ng模板DNA，I XPCR buffer,I. 5mmol L-1MgCl2^OOmmol じ1 dNTP，兩條引物終濃度各為 0. 2iimol じ1，0.5UTaq DNA 聚合酶，用無菌蒸懼水補(bǔ)充反應(yīng)體系至10 ii L ;(2) PCR反應(yīng)程序94°C預(yù)變性3分鐘；94°C變性20秒，58°C退火30秒，72°C延伸30秒，32個(gè)循環(huán)；72°C延伸5分鐘；4°C保存；(3)PCR產(chǎn)物檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，用銀染法染色。本發(fā)明在利用T6AL. 6VS易位系為親本進(jìn)行抗白粉病性狀的追蹤時(shí)，凡是擴(kuò)增出350bp條帶的材料，都含有小麥-簇毛麥T6AL. 6VS易位染色體，并對(duì)白粉病表現(xiàn)高抗；凡是不能擴(kuò)增出350bp條帶的材料，都不具有T6AL. 6VS易位染色體，相應(yīng)丟失由6VS染色體控制的白粉病抗性。本發(fā)明具有以下有益效果I、本發(fā)明的分子標(biāo)記6VS-LEM在鑒定簇毛麥6VS染色體時(shí)特異性強(qiáng)已開發(fā)的分子標(biāo)記0PT1714(i(i和0PT1719(KI都非6VS特異性標(biāo)記，只有在親本間存在與6VS的多態(tài)性吋，才可以利用，而使用6VS-LEM吋，無論涉及何種親本，只要出現(xiàn)350bp條帶，就可以確定材料中含有6VS染色體。
2、本發(fā)明的6VS染色體特異性EST-STS標(biāo)記相較SCAR標(biāo)記更易于識(shí)別PCR擴(kuò)增失敗導(dǎo)致的“假陰性”:本發(fā)明的標(biāo)記為共顯性標(biāo)記，在普通小麥遺傳背景中，無論是否具有T6AL. 6VS易位染色體，都可以擴(kuò)增出多個(gè)背景條帶，可用于判斷PCR擴(kuò)增是否成功，排除“假陰性”。3、本發(fā)明的分子標(biāo)記穩(wěn)定性好，容易為育種實(shí)踐利用本發(fā)明的標(biāo)記由于目標(biāo)條帶較短，僅350bp，PCR擴(kuò)增時(shí)對(duì)DNA模板質(zhì)量的要求不高，在部分降解的DNA模板中仍能有效擴(kuò)增出目標(biāo)產(chǎn)物，而且PCR反應(yīng)的延伸時(shí)間僅需30秒，有利于提高標(biāo)記輔助選擇的效率。


圖I :分子標(biāo)記6VS-LEM的PCR擴(kuò)增結(jié)果。M =DNAmarker DL2000 ；1 :簇毛麥；2 :普通小麥；3 :小麥-簇毛麥易位系T6AL. 6VS ；4^12 :寧麥9號(hào)與T6AL. 6VS易位系雜交組合的分離群體。箭頭所示為350bp的特異性條帶。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明具體實(shí)施方式
采用以下技術(shù)方案根據(jù)可電子定位于短柄草3號(hào)染色體短臂的小麥EST序列BE404563設(shè)計(jì)ー對(duì)標(biāo)記引物，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出的一段350bp的DNA條帶，該條帶可位于簇毛麥6VS染色體，能特異地追蹤6VS染色體及其控制的抗小麥白粉病性狀。實(shí)施例I、引物的設(shè)計(jì)與合成選擇短柄草3號(hào)染色體短臂上的保守基因，在NCBI或Graingenes數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST分析,檢索小麥族作物的EST序列,利用Primer Premier 5. 0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，弓丨物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。2、簇毛麥6VS染色體特異性EST-STS標(biāo)記的篩選(I)PCR擴(kuò)增以簇毛麥、普通小麥、小麥-簇毛麥易位系T6AL. 6VS為材料(均為公知公用種質(zhì)材料，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞遺傳研究所提供)，提取基因組DNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，IOu L PCR反應(yīng)體系中含約 10 20ng模板DNA，I XPCRbuffer，I. 5mmol L_lMgC12，200mmolL-ldNTP，兩條引物終濃度各為0. 2iimolL-l，0. 5U Taq DNA聚合酶，用無菌蒸餾水補(bǔ)充反應(yīng)體系至10 ii L ；PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性3分鐘；94°C變性20秒，58°C退火30秒，72°C延伸30秒，32個(gè)循環(huán)；72°C延伸5分鐘；4°C保存。(2) PCR產(chǎn)物的檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠(29:1)上進(jìn)行電泳分離，采用銀染法染色。(3)PCR結(jié)果分析本發(fā)明篩選到ー個(gè)簇毛麥6VS染色體特異的分子標(biāo)記6VS-LEM，標(biāo)記引物是根據(jù)可電子定位于短柄草3號(hào)染色體短臂的小麥EST序列BE404563設(shè)計(jì)，具體序列為6VS-LEMF :5’ -CCAGGAGGGCCTCCAGGA-3’ (SEQ ID NO. I),6VS-LEMR :5，-CTGGGAGCTCCTGCTGCGT-3，(SEQ ID NO. 2)。以該標(biāo)記引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，能在普通小麥中擴(kuò)增到兩條約為500bp的DNA條帶，在簇毛麥中擴(kuò)增到一條約為350bp的DNA條帶，而在小麥-簇毛麥易位系T6AL. 6VS中，既能擴(kuò)增到背景條帶，也能擴(kuò)增到一條約350bp條帶(見圖I中1 3),表明350bp條帶可定位于簇毛麥6VS染色體，因此，分子標(biāo)記6VS-LEM能在小麥背景中特異性追蹤簇毛麥6VS染色體。3、簇毛麥6VS染色體特異性標(biāo)記6VS-LEM在分子標(biāo)記輔助選擇育種中的應(yīng)用利用篩選到的簇毛麥6VS染色體特異性標(biāo)記引物6VS-LEM，對(duì)寧麥9號(hào)(公知公用，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院培育)與抗白粉病T6AL. 6VS易位系(公知公用，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞遺傳研究所創(chuàng)制并提供)雜交組合的分離群體進(jìn)行鑒定，結(jié)合白粉病抗性鑒定，結(jié)果顯示在 所有供試材料中，凡具有350bp條帶的材料,都表現(xiàn)高抗白粉病；凡缺失350bp條帶的材料都表現(xiàn)高感白粉病(見圖I中4 12)。該結(jié)果表明，本發(fā)明開發(fā)的EST-STS標(biāo)記6VS-LEM能有效追蹤小麥背景中的簇毛麥6VS染色體，在分子標(biāo)記輔助選擇育種中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
權(quán)利要求
1.一個(gè)簇毛麥6VS染色體特異的分子標(biāo)記6VS-LEM，其特征在于該分子標(biāo)記引物的序列為6VS-LEMF :5’ -CCAGGAGGGCCTCCAGGA-3，，6VS-LEMR :5’ -CTGGGAGCTCCTGCTGCGT-3’。
2.權(quán)利要求I所述的簇毛麥6VS染色體特異的分子標(biāo)記6VS-LEM在追蹤小麥-簇毛麥T6AL. 6VS易位染色體中的用途。
3.一種用權(quán)利要求I所述的簇毛麥6VS染色體特異的分子標(biāo)記6VS-LEM追蹤小麥-簇毛麥T6AL. 6VS易位染色的方法，是用該分子標(biāo)記引物對(duì)待測(cè)材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出350bp條帶的材料，為含有小麥-簇毛麥T6AL. 6VS易位染色體的材料。
全文摘要
本發(fā)明公開了一個(gè)特異追蹤簇毛麥6VS染色體的分子標(biāo)記6VS-LEM及其用法，它涉及分子生物學(xué)和遺傳育種科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。該標(biāo)記引物是根據(jù)可電子定位于短柄草3號(hào)染色體短臂的小麥EST序列BE404563設(shè)計(jì)，具體序列為6VS-LEMF5’-CCAGGAGGGCCTCCAGGA-3’，6VS-LEMR5’-CTGGGAGCTCCTGCTGCGT-3’，以標(biāo)記引物進(jìn)行PCR時(shí)能擴(kuò)增出一條350bp的特異性DNA條帶，能快速有效地追蹤簇毛麥6VS染色體及其控制的抗小麥白粉病性狀，在小麥抗白粉病分子標(biāo)記輔助選擇育種中具有較強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102864142SQ20121035348
公開日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2012年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月20日
發(fā)明者朱姍穎, 何華綱, 別同德, 蔡陽(yáng)洋, 梁瑩 申請(qǐng)人:江蘇大學(xué)