專利名稱：用于表達腫瘤相關抗原的癌癥的肽疫苗的制作方法
技術領域：
本專利申請要求獲得2007年2月21日提交的美國臨時專利申請60/902，949的權利，本文以提述方式并入其全部內(nèi)容用于所有目的。本發(fā)明涉及生物科學領域，更具體地，涉及癌癥治療領域。特別地，本發(fā)明涉及新型免疫原性肽，其可極其有效地用作癌癥疫苗，本發(fā)明還涉及包含這些肽的用于治療和預防腫瘤的藥物。
背景技術：
已經(jīng)證明，⑶8+細胞毒T淋巴細胞(CTL)可以識別來源于呈遞在MHC-I類分子上的腫瘤相關抗原(tumor-associated antigens, TAA)的表位肽,并隨后裂解腫瘤細胞。自從第一例TAA — MAGE家族被發(fā)現(xiàn)以來，使用免疫學方法已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多其它的TAA (BoonT. (1993)Int J Cancer 54:177-80. ;Boon T.et al., (1996)J Exp Med 183:725-9. ;vander Bruggen P et al. , (1991) Science254:1643-7. ;Brichard V et al. , (1993) J ExpMed 178:489-95. ;Kawakami Y et al. , (1994) J Exp Med 180:347-52·)?，F(xiàn)在，它們中的一些作為免疫治療的靶標已經(jīng)用于臨床開發(fā)。迄今發(fā)現(xiàn)的TAA包括MAGE (van derBruggen P et al. , (1991) Science 254:1643-7.)、gplOO (Kawakami Y et al. , (1994)J Exp Med 180:347-52.), SART (Shichi jo S et al. ,(1998) J Exp Med 187:277-88.)和 NY-ES0-1 (Chen Y. T. et al. , (1997) Proc. Natl. Acd. Sci. USA, 94:1914-8. ) 另一方面，某些已經(jīng)證實在腫瘤細胞中在一定程度上特異過表達的基因產(chǎn)物也顯示可以被識別作為用于誘導細胞免疫響應的靶標。這些基因產(chǎn)物包括p53 (Umano Y etal., (2001)Br J Cancer, 84:1052-7.), HER2/neu(Tanaka H et al. , (2001)Br J Cancer,84:94-9.), CEA (Nukaya I et al. , (1999) Int. J. Cancer 80,92-7·)等。盡管在有關TAA的基礎和臨床研究中已經(jīng)取得了顯著的進展(Rosenberg SAet al. , (1998)Nature Med, 4:321-7. ;Mukherji B. et al. , (1995)Proc Natl Acad SciUSA, 92:8078-82. :Hu X et al. , (1996) Cancer Res, 56:2479-83.)，但是目前可用的適于癌癥治療的候選TAA數(shù)目非常有限。在癌細胞中大量表達并且其表達僅限于癌細胞的TAA應當是免疫治療靶標的有希望的候選物。HLA-A24和HLA-A0201都是日本人和白種人中的常見HLA等位基因(DateY et al. , (1996)Tissue Antigens 47:93-101. ;Kondo A et al., (1995)JTmmunoI155 : 4307-12. ;Kubo RT et al. , (1994)J Immunol 152:3913-24. ;Imanishi etal., Proceeding of the eleventh International Histocompatibility Workshop andConference Oxford University Press, Oxford, 1065(1992) ;Williams F et al. , (1997)Tissue Antigen 49:129-33.)。因此，由這些HLA等位基因呈遞的癌抗原肽在治療日本人和白種人患者的癌癥方面可能特別有用。而且，已知低親和性CTL的體外誘導通常是通過暴露于高濃度的肽，從而在抗原呈遞細胞(APC)上產(chǎn)生高水平的可以有效激活這些CTL 的特異妝/MHC 復合體(Alexander-Miller et al. , (1996) Proc Natl Acad Sci USA93:4102-7.)。最近，HLA-I類結(jié)合肽序列可以用算法進行預測(Jounal of Immunological Methods, (1995), Vol. 185,pp. 181-190，J. Tmmunol. , (1994), Vol. 152,pp. 163-175，protein science, (2000)，Vol. 9，pp. 1838-1846)。然而，很難說預測的表位肽能夠被切割成合適的大小，并在靶細胞表面上與HLA分子一起表達，以及被CTL識別。而且，所述的算法，例如 BIMAS (http://bimas. dcrt. nih. gov/cgi_Din/molbio/Ken_parker_comboform)(Parker KC, etal. , (1994) J Immunol. ; 152 (I) : 163-75. ; Kuzushima K, et al. , (2001)Blood. ;98(6) : 1872-81.))，雖然能夠提示HLA分子結(jié)合肽，但是所提示的肽并不非常嚴格(Bachinsky MM, et. al. , Cancer Tmmun. 2005Mar 22; 5:6. ) 因此，TAA 篩選仍然存在大量 挑戰(zhàn)和困難。最近在cDNA微陣列技術中取得的進展已經(jīng)使人們能夠構(gòu)建出與正常細胞相比較的惡性細胞的基因表達譜(Okabe, H. et al. , (2001) Cancer Res.，61，2129-37. ;Lin YM. etal., (2002)Oncogene, 21;4120-8. ;Hasegawa S. et al., (2002)Cancer Res 62:7012-7·)。借助這種方法能夠更全面地理解癌細胞的復雜本質(zhì)和癌發(fā)生的機制，并使得鑒定在腫瘤中表達失調(diào)的基因更加容易(Bienz M. et al. , (2000)Cell 103，31卜20·)。在已經(jīng)鑒定的在癌癥中被上調(diào)的轉(zhuǎn)錄本中，最近發(fā)現(xiàn)了 CDH3 (GenBank Accession No. NM 001793;SEQID Nos. 1，2)，EPHA4(GenBank Accession No. L36645;SEQ ID Nos. 3，4)，ECT2(GenBankAccession No.AY37 6439;SEQ ID Nos. 5, 6),HIG2(GenBank AccessionNo. NM_013332;SEQ ID Nos. 7，8)INHBB(GenBank Accession No.NM_002193;SEQ IDNos. 9, 10) ,KIF20A(GenBank Accession No. NM_005733;SEQ IDNos. 11，12)，KNTC2(GenBankAccession No. AFO17790;SEQ ID Nos. 13，14)，TTK(GenBank Accession No. NM_003318;SEQID Nos. 15，16)和 URLClO (GenBankAccession No. NM_017527; SEQ ID Nos. 17，18)。這里通過提述方式并入上述引文的全部內(nèi)容。這些基因在所分析案例(見下文)的各種癌組織的腫瘤細胞中被特異上調(diào)，本發(fā)明人對它們特別感興趣。因此，衍生自⑶H3，EPHA4, ECT2, HIG2，INHBB, KIF20A, KNTC2, TTK和URLC10的免疫原性肽可用于選擇性殺死表達這些抗原的腫瘤細胞。本發(fā)明解決了這個需求，以及別的需求。因為細胞毒藥物例如M-VAC通常導致嚴重的不良反應，很明顯，基于已得到充分表征的作用機制，細心選擇新型的靶分子對于開發(fā)副作用風險最小的有效抗癌藥物是非常有用的。為了這個目標，前人已經(jīng)對不同癌癥和正常人類組織進行了表達譜分析。這些研究發(fā)現(xiàn)了多種在癌癥中特異過表達的基因(Lin YM, etal., Oncogene. 2002Jun 13 ; 21:4120-8. ;Kitahara 0，et al.，Cancer Res. 2001May I;61:3544-9. ;Suzuki C，et al.，Cancer Res. 2003Novl;63:7038-41. ;AshidaS，Cancer Res. 2004 Sep I; 64:5963-72. ; Ochi K，et al.，Int J Oncol. 2004Mar; 24 (3):647-55. ;Kaneta Y，et al.，Int J Oncol. 2003Sep;23:681-91. ;Obama Kj Hepatology. 2005Jun;41:1339-48. ;Kato T，et al.，Cancer Res. 2005 Jul I;65:5638-46. ;KitaharaO，et al. , Neoplasia. 2002Jul-Aug;4:295-303. ;Saito-Hisaminato A et al.，DNA Res2002，9:35-45.)。這些已鑒定出在各種癌癥中過表達的基因的實例包括但不限于⑶H3，EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIF20A, KNTC2, TTK 和 URLClO。CDH3 在以前已經(jīng)被鑒定為在膀胱癌、宮頸癌、膽管細胞癌、結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜異位、 胃癌、彌散型胃癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌、軟組織腫瘤和睪丸腫瘤中過表達。EPHA4已經(jīng)在膀胱癌、宮頸癌、膽管細胞癌、子宮內(nèi)膜異位、彌散型胃癌、卵巣癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌、前列腺癌和軟組織腫瘤中被鑒定。ECT2已經(jīng)在膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、慢性骨髄性白血病(CML)、結(jié)直腸癌、食道癌、NSCLC、淋巴瘤、前列腺癌、腎癌和小細胞肺癌(SCLC)中被鑒定。HIG2已經(jīng)在腎癌和SCLC中被鑒定。INHBB已經(jīng)在膽管細胞癌、食道癌、NSCLC、腎癌、SCLC和軟組織腫瘤中被鑒定。KIF20A已經(jīng)在膀胱癌、乳腺癌、膽管細胞癌、食道癌、NSCLC、胰腺癌、前列腺癌、腎癌和SCLC中被鑒定。KNTC2已經(jīng)在膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結(jié)直腸癌、食道癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巣癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、SCLC和軟組織腫瘤中被鑒定。TTK已經(jīng)在膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結(jié)直腸癌、食道癌、肝癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、SCLC和軟組織腫瘤中被鑒定。URCLlO已經(jīng)在膀胱癌、宮頸癌、膽管細胞癌、食道癌、胃癌、NSCLC、骨肉瘤、胰腺癌和SCLC中被鑒定。
發(fā)明概要本發(fā)明部分地基于可用于免疫治療的靶標的發(fā)現(xiàn)。因為TAA往往不具有免疫原性，所以合適靶標的發(fā)現(xiàn)是極其重要的。如上文提到的，已經(jīng)確認⑶H3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB、KIF20A、KNTC2、TTK和URLClO出在各種癌癥中被上調(diào)。更具體地說，這些基因是用全基因組范圍的cDNA微陣列進行基因表達譜分析而鑒定的。如上文討論的，已顯示⑶H3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB, KIF20A、KNTC2、TTK和URLClO的表達在從胰腺癌細胞到腎癌的各種腫瘤細胞中被特異上調(diào)。如表I中所示，CDH3的表達在34例膀胱癌中的26例，19例宮頸癌中的17例，所有的19例膽管細胞癌、34例結(jié)直腸癌中的30例，21例子宮內(nèi)膜異位中的20例，20例胃癌中的13例，8例彌散型胃癌中的7例，37例NSCLC中的36例，全部16例胰腺癌，全部21例軟組織腫瘤和全部10例睪丸腫瘤中確實被提高。表I進ー步證明EPHA4的表達在34例膀胱癌中的14例，14例宮頸癌中的8例，25例膽管細胞癌中的10例、15例子宮內(nèi)膜異位中的5例，8例彌散型胃癌中的5例，全部5例卵巢癌，全部14例胰腺癌，51例前列腺癌中的20例，和23例軟組織腫瘤中的14例中確實被提高。ECT2的表達在19例膀胱癌中的17例，12例乳腺癌中的5例，全部14例宮頸癌，全部13例膽管細胞癌，全部5例CML，8例結(jié)直腸癌中的7例，16例食道癌中的12例，16例NSCLC中的6例，10例淋巴瘤中的8例，I例胰腺癌中的I例，13例前列腺癌中的10例，6例腎癌中的3例，和13例SCLC癌腫的12例中確實被提高。HIG2的表達在20例腎癌中的19例，和9例軟組織腫瘤中的7例中確實被提高。INHBB的表達在21例膽管細胞癌中的10例，全部12例食道癌，13例NSCLC中的10例，24例腎癌中的22例，14例SCLC癌癥中的8例，和49例軟組織腫瘤中的45例中確實被提聞。KIF20A的表達在全部31例膀胱癌，61例乳腺癌中的38例，11例膽管細胞癌中的10例，19例食道癌中的7例，22例NSCLC中的21例，全部6例卵巢癌，36例前列腺癌中的17例，11例腎癌中的6例，和全部15例SCLC中確實被提高。KNTC2的表達在32例膀胱癌中的30例，56例乳腺癌中的47例，全部10例宮頸癌，22例膽管細胞癌中的16例，37例CML中的17例，10例結(jié)直腸癌中的3例，46例食道癌中的11例，19例NSCLC中的15例，8例淋巴瘤中的7例，24例骨肉瘤中的20例，5例卵巢癌中的3例，全部2例胰腺癌，37例前列腺癌中的15例，19例腎癌中的14例，全部15例SCLC，和59例軟組織腫瘤中的40例中確實被提高。TTK的表達在全部27例膀胱癌，30例乳腺癌中的25例，16例宮頸癌中的15例，全部10例膽管細胞癌，7例CML中的5例，10例結(jié)直腸癌中的6例，44例食道癌中的24例，15例肝癌中的8例，全部12例NSCLC，全部6例淋巴瘤，16例骨肉瘤中的13例，17例前列腺癌中的12例，全部15例SCLCjP 33例軟組織腫瘤中的16例中確實被提高。URLClO的表達在全部29例膀胱癌，16例宮頸癌中的15例，全部7例膽管細胞癌， 19例食道癌中的7例，全部3例胃癌，27例NSCLC中的24例，19例骨肉瘤中的15例，5例胰腺癌中的4例，43例軟組織腫瘤中的33例中確實被提高。本發(fā)明至少部分地基于這些基因(CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB、KIF20A、KNTC2、TTK和URLC10)的基因產(chǎn)物的特異表位肽的鑒定，其具有誘導特異針對相應分子的細胞毒T淋巴細胞(CTL)的能力。如下文中將詳細介紹的，用衍生自CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB、KIF20A、KNTC2、TTK 或 URLClO 的、可結(jié)合 HLA_A*2402 或 HLA_A*0201 的候選肽刺激健康供體的外周血單個核細胞(PBMC)。然后建立具有特異針對用每種候選肽沖擊(pulse)的HLA-A24或HLA-A2陽性靶細胞的細胞毒性的CTL克隆和/或細胞系。這些結(jié)果證明，這些肽是HLA-A24或HLA-A2限制性表位肽，能夠誘導針對表達CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB、KIF20A、KNTC2、TTK或URLClO的細胞的強カ而特異的免疫響應。因此，本發(fā)明提供了用于治療或預防與CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB, KIF20A、KNTC2、TTK或URLClO過表達相關的疾病，例如癌癥，的方法。這些方法涉及向需要的受試者施用本發(fā)明 CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB, KIF20A、KNTC2、TTK 和/或 URLClO 多肽的步驟。施用這些肽的結(jié)果可導致抗腫瘤免疫的誘導。因此，本發(fā)明提供了用于在受試者體內(nèi)誘導抗腫瘤免疫的方法，這些方法涉及向受試者施用⑶H3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB,KIF20A、KNTC2、TTK和/或URLClO多肽的步驟，本發(fā)明還提供了用于治療或預防與⑶H3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB, KIF20A、KNTC2、TTK 和/或 URLClO 過表達相關的疾病例如癌癥的藥物組合物，該藥物組合物包含CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB, KIF20A、KNTC2、TTK和URLClO多肽。這些癌癥的實例包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜異位、食道癌、胃癌、彌散型胃癌、肝、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巣癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤和睪丸腫瘤。本發(fā)明進一歩提供了用于預防上述疾病的手術后復發(fā)的方法。關于上述具體的目標和目的，本領域的技術人員可以理解，本發(fā)明的ー個或多個方面可以滿足特定的目的，而ー個或多個其它的方面則可以滿足某些其它的目的。各個目標可能不能全面等同地適用于本發(fā)明的每ー個方面。因此，對于本發(fā)明任ー個方面而言，本文中的目的可以分別地看待。結(jié)合附圖和實施例閱讀下面的詳細說明書，本發(fā)明的目的和特征將變得更加清晰明了。然而，應當理解，無論是本發(fā)明的前述概要還是下文的詳細說明書都是優(yōu)選的實施方案，并不對本發(fā)明或者本發(fā)明的其它可選擇實施方案構(gòu)成限制。特別地，盡管本文是參考大量的具體實施方案對本發(fā)明進行介紹，但是應當意識到，這些描述只是本發(fā)明的舉例說明，不應認為對本發(fā)明具有限制。在不背離如附加權利要求中描述的本發(fā)明的精神和范圍的前提下，本領域的技術人員可以進行各種修改和適用。類似地，根據(jù)上述概要和下文介紹的某些實施方案，本發(fā)明的其它目的、特征、利益和優(yōu)勢是容易想到的，對本領域的技術人員而言也是顯而易見的。這些目的、特征、利益和優(yōu)勢在所附的實施例、數(shù)據(jù)、圖表以及其合理的推論(無論是就其本身還是聯(lián)系本文引用的參考文獻)的基礎上是容易想到的。附圖簡述通過聯(lián)系附圖的簡要說明和本發(fā)明的詳細介紹以及下面的優(yōu)選實施方案，本發(fā)明的各個方面和應用對于技術人員而言將變得顯而易見。
[
圖1-1]圖I描述了表位肽的篩選結(jié)果，其顯示，CDH3-A24-10-332(SEQ ID NO: 34),CDH3-A24-10-470 (SEQ ID NO:358)、CDH3-A24-9_513(SEQ ID NO:19)、CDH3-A24-9_406(SEQID N0:22)、CDH3-A24-10-807(SEQ ID NO :30)和 CDH3-A24-10-655 (SEQ ID NO :344)顯示出強的IFN-gamma產(chǎn)生。〃a〃是陰性肽的實例，其雖然可能具有與HLA_A*2402的結(jié)合活性，但沒有檢測出誘導CTL的能力。〃b〃表現(xiàn)了 CDH3-A24-10-332(SEQ ID NO:34)的CTL誘導能力。IFN-gamma ELISP0T 測定顯示與對照相比 CDH3-A24-10-332 (SEQID NO:34)展示了高效的IFN-gamma產(chǎn)生，并且從畫框的孔所示的陽性孔#4建立的CTL系被證明具有特異針對用表位肽沖擊過的靶細胞的響應?！╟〃描述了 CDH3-A24-10-470(SEQ ID NO:358)的CTL誘導能力。通過 IFN-gammaELISPOT 測定顯示 CDH3-A24-10-470(SEQ ID NO:358)與對照相比具有強的IFN-gamma產(chǎn)生，并且從畫框的孔所示的陽性孔#4建立的CTL系被證明具有特異針對經(jīng)表位肽沖擊的靶細胞的響應?！?!〃描述了 CDH3-A24-9-513(SEQ ID NO: 19)的CTL 誘導能力。IFN-gamma ELISP0T 測定顯示與對照相比 CDH3-A24-9-513 (SEQ ID NO: 19)具有強的IFN-gamma產(chǎn)生。左圖畫框的孔所示的#6孔證明了針對經(jīng)表位肽沖擊的祀細胞的特異性響應。而且，從中圖畫框的孔所示的陽性孔#5建立的CTL系顯示了針對經(jīng)表位肽沖擊的靶細胞的特異性響應?！╡〃描述了 CDH3-A24-9-406(SEQ ID NO: 22)的CTL誘導能力。IFN-gamma ELISP0T測定顯示與對照相比CDH3-A24-9-406 (SEQID NO:22)顯示強的IFN-gamma產(chǎn)生，并且從畫框的孔所示的陽性孔#2建立的CTL系顯示了針對經(jīng)表位肽沖擊的靶細胞的特異性響應。[圖1-2]圖I描述了表位肽的篩選結(jié)果，其顯示，CDH3-A24-10-332(SEQ ID NO: 34),CDH3-A24-10-470 (SEQ ID NO:358)、CDH3-A24-9_513(SEQ ID NO:19)、CDH3-A24-9_406(SEQID N0:22)、CDH3-A24-10-807(SEQ ID NO :30)和 CDH3-A24-10-655 (SEQ ID NO :344)顯示出強的 IFN-gamma 產(chǎn)生?！╢"描述了 CDH3-A24-10-807 (SEQ ID NO :30)的 CTL 誘導能力。IFN-gamma ELISP0T 測定證明，與對照相比，CDH3-A24-10-807 (SEQ ID NO: 30)具有強的IFN-gamma產(chǎn)生，并且從畫框的孔所示的陽性孔#5建立了 CTL系和克隆。用所述肽建立的CTL克隆顯示了針對用全長⑶H3基因和HLA-A24分子二者轉(zhuǎn)染的C0S7的特異性CTL活性(右下圖)。另ー方面，制備了用全長⑶H3而沒有用HLA-A24轉(zhuǎn)染的C0S7和用HLA-A24而沒有用全長⑶H3轉(zhuǎn)染的C0S7作為陰性對照。所述CTL克隆顯示出針對用⑶H3和HLA-A24二者轉(zhuǎn)染的C0S7的高特異性CTL活性?！╣"描述了 CDH3-A24-10-655 (SEQID NO:344)的CTL誘導能力。IFN-gamma ELISPOT測定顯示與對照相比CDH3-A24-10-655 (SEQ ID NO:344)具有強的IFN-gamma產(chǎn)生，并且從畫框的孔所示的陽性孔#1建立了 CTL系和克隆。針對所述肽產(chǎn)生的建立的CTL克隆顯示特異針對用全長⑶H3基因和HLA-A24分子二者轉(zhuǎn)染的C0S7的CTL活性(右下圖)。另ー方面，制備了用全長⑶H3而沒有用HLA-A24轉(zhuǎn)染的C0S7和用HLA-A24而沒有用全長⑶H3轉(zhuǎn)染的C0S7作為陰性對照。所述CTL克隆顯示出針對用CDH3和HLA-A24 二者轉(zhuǎn)染的C0S7的高的特異性CTL活性。[圖2]圖2描述了表位肽的篩選結(jié)果，其顯示，Epha4-A24-9-453(SEQ ID N0:41)、
Epha4-A24-9-5(SEQ ID NO:44)、Epha4-A24-9_420(SEQ ID NO:48)、Epha4_A24-9_869(SEQID N0:46)、Epha4-A24-10-24(SEQ ID NO:78)Epha4-A02-9_501(SEQ ID NO:376)和Epha4-A02-9-165 (SEQ ID NO:379)顯示出強的 IFN-gamma 產(chǎn)生。〃a〃 描述了陰性肽的實例，其雖然可能具有與HLA的結(jié)合活性，但沒有檢測出CTL誘導能力。"b"描述了Epha4-A24-9-453 (SEQID NO:41)的 CTL 誘導能力。IFN-gamma ELISPOT 測定顯示與對照相比Epha4-A24-9-453 (SEQ ID NO:41)具有強的IFN-gamma產(chǎn)生，并且從畫框的孔所示的陽性孔#3建立的CTL系顯示特異針對經(jīng)表位肽沖擊的靶細胞的響應?！╟〃描述了 Epha4-A24-9-5 (SEQ ID NO:44)的 CTL-誘導能力。IFN-gamma ELISPOT 測定顯示與對照相比Epha4-A24-9-5(SEQ ID NO:44)顯示強的IFN-gamma產(chǎn)生，并且從畫框的孔所示的陽性孔#2建立的CTL系顯示特異針對經(jīng)該表位肽沖擊的靶細胞的響應?！?!〃描述7 Epha4-A24-9-420 (SEQ IDNO:48)的 CTL 誘導能力。IFN-gamma ELISPOT 測定顯示與對照相比Epha4-A24-9-420(SEQ ID NO:48)顯示強的IFN-gamma產(chǎn)生。上圖畫框的孔所示的#6孔證明了特異針對經(jīng)該表位肽沖擊的靶細胞的響應。而且，從中圖畫框的孔所示的陽性孔#6建立的CTL系證明了特異針對經(jīng)表位肽沖擊的靶細胞的響應?！╡〃描述了Epha4-A24-9-869 (SEQ ID NO:46)的 CTL 誘導能力。IFN-gamma ELISPOT 測定顯示與對照相比Epha4-A24-9-869(SEQ ID NO:46)具有強的IFN-gamma產(chǎn)生，并且從畫框的孔所示的陽性孔#5建立的CTL系證明了特異針對經(jīng)表位肽沖擊的靶細胞的響應。〃f"描述7 Epha4-A24-10-24(SEQ ID NO: 78)的 CTL 誘導能力。IFN-gamma ELISPOT 測定顯示與對照相比Epha4-A24-10-24(SEQ ID NO: 78)具有強的IFN-gamma產(chǎn)生，并且從畫框的孔所示的陽性孔#4建立的CTL系證明了特異針對用表位肽沖擊的靶細胞的響應?！╣"描述了Epha4-A02-9-501(SEQ ID NO:376)的 CTL 誘導能力。IFN-gamma ELISPOT 測定顯示與對照相比Epha4-A02-9-501(SEQ ID NO:376)具有強的IFN-gamma產(chǎn)生，并且從畫框的孔所示的陽性孔#8建立了 CTL系和克隆。用Cr釋放測定(CRA)測量了所建立的CTL系針對用肽沖擊的靶細胞的細胞毒活性(下圖)，CTL系具有非常強的特異針對用肽沖擊的靶細胞的細胞毒活性?！╤〃描述了 Epha4-A02-9-165(SEQ ID NO:379)的 CTL 誘導能力。IFN-gammaELISPOT 測定顯示與對照相比 Epha4-A02-9-165(SEQ ID NO:379)具有強的 IFN-gamma 產(chǎn)生，并且從畫框的孔所示的陽性孔#3建立了 CTL系和克隆。用Cr釋放測定(CRA)測量了所建立的CTL系針對用肽沖擊的靶細胞的細胞毒活性(右圖)，CTL系具有非常強的特異針對用肽沖擊的靶細胞的細胞毒活性。
[圖3]圖3描述了表位肽的篩選結(jié)果，其進ー步證明，ECT2-A24-9-515(SEQIDNO: 80), ECT2-A24-10-40 (SEQ ID NO: 100)和 ECT2-A24-10-101 (SEQ IDN0:101)顯示出強的IFN-gamma產(chǎn)生。〃a〃描述了陰性肽的實例，其雖然可能具有與HLA的結(jié)合活性但沒有檢測出具有CTL-誘導能力。〃b〃描述了 ECT2-A24-9-515(SEQ ID NO:80)的CTL誘導能力。IFN-gamma ELISPOT 測定顯示與對照相比 ECT2-A24-9-515 (SEQ ID NO:80)顯示強的IFN-gamma產(chǎn)生。左圖畫框的孔所示的#5和#7孔顯示了特異針對用表位肽沖擊的靶細胞的響應。而且，從第二圖中的畫框的孔所示的陽性孔#7建立的CTL系顯示了特異針對用表位肽沖擊的靶細胞的響應。通過Cr釋放測定(CRA)測量CTL系針對內(nèi)源表達ECT2和HLA-A24的癌細胞系TE6的細胞毒活性，CTL克隆具有非常強的針對TE6的細胞毒活性。另一方面，效應細胞沒有顯示CTL系針對癌細胞系的細胞毒活性，沒有檢測出僅表達ECT2的TE5。〃c〃描述了 ECT2-A24-10-40(SEQ ID NO: 100)的 CTL 誘導能力。IFN-gamma ELISPOT測定顯示與對照相比ECT2-A24-10-40(SEQ ID NO: 100)具有強的IFN-gamma產(chǎn)生，并且從 畫框的孔所示的陽性孔#2建立了 CTL系和克隆。用所述肽產(chǎn)生并建立的CTL克隆顯示了特異針對用全長ECT2基因和HLA-A24分子二者轉(zhuǎn)染的C0S7的CTL活性。另ー方面，制備了用全長ECT2而沒有用HLA-A24轉(zhuǎn)染的C0S7，用HLA-A24和作為全長ECT2的替代物的URLClO基因轉(zhuǎn)染的C0S7，和用HLA-A24轉(zhuǎn)染并用ECT2-10-101沖擊的C0S7，作為陰性對照。CTL克隆顯示出針對同時用ECT2和HLA-A24轉(zhuǎn)染的C0S7的高的特異CTL活性?！?!〃描述了ECT2-A24-10-101(SEQ IDN0:101)的 CTL誘導能力。IFN-gamma ELISPOT測定顯示與對照相比ECT2-A24-10-101(SEQ ID NO: 101)具有強的IFN-gamma產(chǎn)生，并且從畫框的孔所示的陽性孔#1建立了 CTL系。用所述肽產(chǎn)生并建立的CTL克隆顯示了特異針對同時用全長ECT2基因和HLA-A24分子轉(zhuǎn)染的C0S7的CTL活性。制備了用全長ECT2而沒有用HLA-A24轉(zhuǎn)染的C0S7、用HLA-A24和作為全長ECT2的替代物的URLClO基因轉(zhuǎn)染的C0S7、和用HLA-A24轉(zhuǎn)染并用ECT2-10-101沖擊的C0S7，作為陰性對照。CTL克隆顯示出針對同時用ECT2和HLA-A24轉(zhuǎn)染的C0S7的高特異CTL活性。[圖4-1]圖4描述了表位肽的篩選結(jié)果，其進ー步證明，HIG2-A24-9-19 (SEQIDNO: I 10)，HIG2-A24-9-22 (SEQ ID NO : I I I )，H I G2-A24-9-8 (SEQ IDNO:387), HIG2-A24-10-7 (SEQ ID NO : I I 2)，HI G2-A24-I O-I 8 (SE Q IDNO:394), HIG2-A02-9-15 (SEQ ID NO:116)，HIG2-A02-9-4 (SEQ ID NO:117)和HIG2-A02-10-8 (SEQ ID NO: 121)顯示出強的IFN-gamma產(chǎn)生?！╝〃描述了陰性肽的實例，其雖然可能具有與HLA的結(jié)合活性但沒有檢測出具有CTL-誘導能力。"b"描述了HIG2-A24-9-19 (SEQ ID NO: 110)的 CTL 誘導能力。IFN-gamma ELISPOT 測定顯示與對照相比HIG2-A24-9-19 (SEQ ID N0:110)具有強的IFN-gamma產(chǎn)生，并且從畫框的孔所示的陽性孔#6建立的CTL系顯示了特異針對用表位肽沖擊的靶細胞的響應。"c〃描述了HIG2-A24-9-22 (SEQ ID N0:111)的 CTL 誘導能力。IFN-gamma ELISPOT 測定顯示與對照相比HIG2-A24-9-22 (SEQ ID NO: 111)顯示強的IFN-gamma產(chǎn)生，并且從畫框的孔所示的陽性孔#7建立的CTL系和克隆證明了特異針對用表位肽沖擊的靶細胞的響應?！╠〃描述了 HIG2-A24-9-8 (SEQ ID NO:387)的 CTL 誘導能力。IFN-gamma ELISPOT 測定顯示與對照相比HIG2-A24-9-8(SEQ ID NO:387)具有強的IFN-gamma產(chǎn)生，并且從畫框的孔所示的陽性孔#5建立的CTL系和克隆證明了特異針對用表位肽沖擊的靶細胞的響應。"e〃描述了HIG2-A02-9-8 (SEQ ID NO: 114)的 CTL 誘導能力。IFN-gamma ELISPOT 測定顯示與對照相比HIG2-A02-9-8 (SEQ ID NO: 114)具有強的IFN-gamma產(chǎn)生，并且從畫框的孔所示的陽性孔#10建立了 CTL系。用所述肽產(chǎn)生并建立的CTL系顯示了特異針對同時用全長HIG2基因和HLA-A02分子轉(zhuǎn)染的293T的CTL活性。制備了用全長HIG2而沒有用HLA-A02轉(zhuǎn)染的293T、用HLA-A02和作為全長HIG2的替代物的FoxP3基因轉(zhuǎn)染的293T、以及用HLA-A02轉(zhuǎn)染并用HIG2-9-15沖擊的293T作為陰性對照。CTL系針對同時用HIG2和HLA-A02轉(zhuǎn)染的293T顯示了高的特異CTL活性。[圖4-2]圖4描述了表位肽的篩選結(jié)果，其進ー步證明，HIG2-A24-9-19 (SEQID NO:I 10)，HIG2-A24-9-22 (SEQ ID NO : 11 I)，HIG2-A24-9-8(SEQ IDNO : 387), HIG2-A24-10-7 (SEQ ID NO : I I 2)，H I G2-A24-I O-I 8 (SEQ ID NO:394), HIG2-A02-9-15 (SEQ ID NO:116)，HIG2-A02-9-4 (SEQ ID NO:117)和HIG2-A02-10-8 (SEQ ID NO: 121)顯示出強的 IFN-gamma 產(chǎn)生。〃f "描述了HIG2-A24-10-7 (SEQ ID NO: 112)的 CTL 誘導能力。IFN-gamma ELISPOT 測定顯示與對照相比HIG2-A24-10-7 (SEQ ID NO: 112)具有強的IFN-gamma產(chǎn)生，并且從畫框的孔所示的陽性孔#1和#7建立的CTL系或克隆顯示了特異針對用該表位肽沖擊的靶細胞的響應。"g〃描述了 HIG2-A24-10-18(SEQ ID NO:394)的 CTL 誘導能力。IFN-gamma ELISPOT 測定顯示與對照相比HIG2-A24-10-18(SEQ ID NO:394)具有強的IFN-gamma產(chǎn)生，并且從畫框的孔所示的陽性孔#7建立的CTL系和克隆顯示了特異針對用該表位肽沖擊的靶細胞的響應。〃h〃描述了 HIG2-A02-9-15(SEQ ID NO: 116)的 CTL 誘導能力。IFN-gamma ELISPOT 測定顯示與對照相比HIG2-A02-9-15(SEQ ID NO: 116)具有強的IFN-gamma產(chǎn)生，并且從畫框的孔所示的陽性孔#10建立了 CTL系。用所述肽產(chǎn)生并建立的CTL系顯示了特異針對同時用全長HIG2基因和HLA-A02分子轉(zhuǎn)染的C0S7的CTL活性。制備了用全長HIG2而沒有用HLA-A02轉(zhuǎn)染的C0S7和用HLA-A02轉(zhuǎn)染并用HIG2-9-8肽沖擊的C0S7，作為陰性對照。CTL系顯示出針對同時用HIG2和HLA-A02轉(zhuǎn)染的C0S7的高特異CTL活性。[圖4-3]圖4描述了表位肽的篩選結(jié)果，其進ー步證明，HIG2-A24-9-19 (SEQID NO:I 10)，HIG2-A24-9-22 (SEQ ID NO : 11 I)，HIG2-A24-9-8(SEQ IDNO : 387), HIG2-A24-10-7 (SEQ ID NO : I I 2)，H I G2-A24-I O-I 8 (SEQ IDNO:394), HIG2-A02-9-15 (SEQ ID NO:116)，HIG2-A02-9-4 (SEQ ID NO:117)和HIG2-A02-10-8 (SEQ ID NO: 121)顯示出強的 IFN-gamma 產(chǎn)生?！╥ "描述了HIG2-A02-9-4(SEQ ID NO: 117)的 CTL 誘導能力。IFN-gamma ELISPOT 測定顯示與對照相比HIG2-A02-9-4 (SEQ ID NO: 117)具有強的IFN-gamma產(chǎn)生，并且從畫框的孔所示的陽性孔#10建立了 CTL系和克隆。用所述肽產(chǎn)生并建立的CTL系顯示了特異針對同時用全長HIG2基因和HLA-A02分子轉(zhuǎn)染的C0S7的CTL活性(中圖)。另外，制備了用全長HIG2而沒有用HLA-A02轉(zhuǎn)染的C0S7，用HLA-A02和作為全長HIG2替代物的TTK基因轉(zhuǎn)染的C0S7，和用HLA-A02轉(zhuǎn)染并用HIG2-9-8沖擊的C0S7，作為陰性對照。通過Cr釋放測定(CRA)測量了 CTL克隆針對同時用全長HIG2基因和HLA-A02分子轉(zhuǎn)染的293T和針對內(nèi)源表達HIG2和HLA-A02的癌細胞系Caki-I的細胞毒活性(下圖)，CTL克隆針對同時用HIG2基因和HLA-A02轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)染子，以及針對Caki-I均具有極強的細胞毒活性。另ー方面，效應細胞沒有顯示具有針對僅用HIG2或者僅用HLA-A02轉(zhuǎn)染的293T以及針對僅表達HIG2的癌細胞系 A498 的 CTL 系的細胞毒活性。"j"描述了 HIG2-A02-10-8(SEQ ID NO: 121)的 CTL-誘導能力。IFN-gamma ELISPOT測定顯示與對照相比HIG2-A02-10-8 (SEQ ID NO: 121)具有強的IFN-gamma產(chǎn)生，并且從畫框的孔所示的陽性孔#9建立的CTL系證明了特異針對用該表位肽沖擊的靶細胞的響應。[圖5-1]圖5描述了表位肽的篩選結(jié)果，其進ー步證明，INHBB-A24-9-180 (SEQIDNO:395)，INHBB-A24-10-180 (SEQ ID NO:I 33)，INHBB-A24-10-305 (SEQ IDNO: 135), INHBB-A24-10-7 (SEQ ID NO: 137)和 INHBB-A24-10-212 (SEQ ID NO: 426)顯示出強的IFN-gamma產(chǎn)生。〃a〃描述了陰性肽的實例，其雖然可能具有與HLA的結(jié)合活性但沒有檢測出具有CTL誘導能力?！╞〃描述了 INHBB-A24-9-180(SEQ ID NO:395)的CTL誘導能 力。IFN-gamma ELISPOT 測定顯示與對照相比 INHBB-A24-9-180 (SEQ ID NO:395)顯示強的IFN-gamma產(chǎn)生，并且從畫框的孔所示的陽性孔#7建立了 CTL系和克隆。通過Cr釋放測定(CRA)測量所建立的CTL克隆針對同時表達INHBB和HLA-A02的腫瘤細胞Miapaca2的CTL活性(下圖)，效應細胞顯示出針對Miapaca2的高的特異細胞毒活性。另ー方面，它沒有顯示出針對表達INHBB而非HLA-A02的Caki-I的顯著特異細胞毒活性?！╟〃描述了INHBB-A24-10-180 (SEQ ID NO: 133)的 CTL 誘導能力。IFN-gamma ELISPOT 測定顯示與對照相比INHBB-A24-10-180(SEQ ID NO: 133)具有強的IFN-gamma產(chǎn)生，并且從畫框的孔所示的陽性孔#3建立了 CTL系。用所述肽產(chǎn)生并建立的CTL系顯示了針對同時用全長INHBB基因和HLA-A24分子轉(zhuǎn)染的293T的高的特異CTL活性。另外，制備了用全長INHBB而沒有用HLA-A24轉(zhuǎn)染的293T和用HLA-A24轉(zhuǎn)染并用INHBB-10-305肽沖擊的293T，作為陰性對照。[圖5-2]圖5描述了表位肽的篩選結(jié)果，其進ー步證明，INHBB-A24-9-180 (SEQID NO:395)，INHBB-A24-10-180 (SEQ ID NO:133), INHBB-A24-10-305 (SEQ IDNO: 135), INHBB-A24-10-7 (SEQ ID NO: 137)和 INHBB-A24-10-212 (SEQ ID N0:426)顯示出強的 IFN-gamma 產(chǎn)生。〃(!〃描述了 INHBB-A24-10-305 (SEQ ID NO: 135)的 CTL 誘導能力。IFN-gamma ELISPOT 測定顯示與對照相比 INHBB-A24-10-305 (SEQ ID NO: 135)具有強的IFN-gamma產(chǎn)生，并且從畫框的孔所示的陽性孔#2建立了 CTL系和克隆。用所述肽產(chǎn)生并建立的CTL克隆顯示了針對同時用全長INHBB基因和HLA-A24分子轉(zhuǎn)染的293T的高特異CTL活性。另外，制備了用全長INHBB而沒有用HLA-A24轉(zhuǎn)染的293T和用HLA-A24轉(zhuǎn)染并用INHBB-10-180肽沖擊的293T，作為陰性對照?！╡〃描述了 INHBB-A24-10-7 (SEQ IDNO: 137))的 CTL誘導能力。IFN-gamma ELISPOT測定顯示與對照相比 INHBB-A24-10-7 (SEQID NO: 137))顯示了強的IFN-gamma產(chǎn)生，并且從上圖的畫框的孔所示的陽性孔#8和下圖的畫框的孔所示的#2建立了 CTL系。來自#8孔的CTL系針對同時用全長INHBB基因和HLA-A24分子轉(zhuǎn)染的293T顯示了高的特異CTL活性。另外，制備了用全長INHBB而沒有用HLA-A24轉(zhuǎn)染的293T和用HLA-A24轉(zhuǎn)染并用INHBB-10-40肽沖擊的293T，作為陰性對照?！╢"描述了 INHBB-A24-10-212(SEQ ID NO :426)的 CTL 誘導能力。IFN-gamma ELISPOT 測定顯示與對照相比INHBB-A24-10-212(SEQ ID NO:426)具有強的IFN-gamma產(chǎn)生，并且從畫框的孔所示的陽性孔#1建立的CTL系顯示了特異針對用表位肽沖擊的靶細胞的響應。[圖6-1]圖6描述了表位肽的篩選結(jié)果，其進ー步證明，KIF20A-A24-10-304(SEQ IDNO:186), KIF20A-A24-9-383(SEQ ID NO:178), KIF20A-A24-10-66(SEQ ID NO:194)和KIF20A-A24-9-305 (SEQ ID NO: 174)顯示出強的 IFN-gamma 產(chǎn)生。"a"描述了陰性肽的實例，其雖然可能具有與HLA的結(jié)合活性但沒有檢測出具有CTL-誘導能力。。"b"描述了KIF20A-A24-10-304(SEQ ID NO: 186)的 CTL 誘導能力。IFN-gamma ELISPOT 測定顯示與對照相比KIF20A-A24-10-304(SEQ ID NO: 186)顯示強的IFN-gamma產(chǎn)生。右下圖中畫框的孔所示的#5孔證明了特異針對用表位肽沖擊的靶細胞的響應。而且，從左上圖中畫框的孔所示的陽性孔#5建立的CTL系和克隆也證明了特異針對用表位肽沖擊的靶細胞的響 應。用所述肽產(chǎn)生并建立的CTL克隆顯示了特異針對用全長KIF20A基因轉(zhuǎn)染的24-LCL的CTL活性。另外，制備了用模擬(mock)載體轉(zhuǎn)染的24-LCL，作為陰性對照。通過Cr釋放測定(CRA)測量了 CTL克隆針對同時表達KIF20A和HLA-A24的腫瘤細胞Miapaca2的細胞毒活性，CTL克隆具有非常強的特異針對Miapaca2的細胞毒活性(右下圖)。另ー方面，沒有顯示出特異針對表達KIF20A而非HLA-A24的PK59的細胞毒活性。〃c〃描述了KIF20A-A24-9-383 (SEQ ID NO: 178)的 CTL 誘導能力。IFN-gamma ELISPOT 測定顯示與對照相比KIF20A-A24-9-383(SEQ ID NO: 178)顯示強的IFN-gamma產(chǎn)生。右圖中畫框的孔所示的#3和4孔證明了特異針對用表位肽沖擊的靶細胞的響應。而且，從左圖中畫框的孔所示的陽性孔#3建立的CTL系也證明了特異針對用表位肽沖擊的靶細胞的響應。所建立的CTL系證明了針對同時用全長KIF20A基因和HLA-A24分子轉(zhuǎn)染的C0S7的高特異CTL活性。另外，制備了用全長KIF20A而沒有用HLA-A24轉(zhuǎn)染的C0S7和用HLA-A24轉(zhuǎn)染并用KIF20A-9-621肽沖擊的C0S7，作為陰性對照。[圖6-2]圖6描述了表位肽的篩選結(jié)果，其進ー步證明，KIF20A-A24-10-304(SEQ IDNO: 186), KIF20A-A24-9-383 (SEQ ID NO: 178)，KIF20A-A24-10-66 (SEQ ID NO:194)和 KIF20A-A24-9-305 (SEQ ID NO: 174)顯示出強的 IFN-gamma 產(chǎn)生?！╠〃 描述了KIF20A-A24-10-66(SEQ ID NO: 194)的 CTL 誘導能力。IFN-gamma ELISPOT 測定顯示與對照相比KIF20A-A24-10-66(SEQ ID NO: 194)具有強的IFN-gamma產(chǎn)生，并且從左上圖中畫框的孔所示的陽性孔#6和中下圖中畫框的孔所示的#3建立的CTL系證明了特異針對用表位肽沖擊的靶細胞的響應。而且，通過有限稀釋從來自#6孔的CTL系選出的CTL克隆顯示了特異針對靶細胞的CTL活性。所建立的CTL克隆顯示出特異針對同時用全長KIF20A基因和HLA-A24分子轉(zhuǎn)染的C0S7的CTL活性。另外，制備了用全長KIF20A而沒有用HLA-A24轉(zhuǎn)染的C0S7，用HLA-A24和作為全長KIF20A的替代物的URLC10基因轉(zhuǎn)染的C0S7，以及用HLA-A24轉(zhuǎn)染并用KIF20A-10-308肽沖擊的C0S7，作為陰性對照?！╡〃描述了KIF20A-A24-9-305 (SEQ ID NO: 174)的 CTL誘導能力。IFN-gamma ELISPOT測定顯示與對照相比KIF20A-A24-9-305(SEQ ID NO: 174)具有強的IFN-gamma產(chǎn)生，并且從左上圖中畫框的孔所示的陽性孔#2和中下圖中畫框的孔所示的#6建立的CTL系證明了特異針對用表位肽沖擊的靶細胞的響應。而且，通過有限稀釋從來自#2孔的CTL系選出的CTL克隆證明了特異針對靶細胞的CTL活性。通過Cr釋放測定(CRA)測量了 CTL克隆針對同時表達KIF20A和HLA-A24的腫瘤細胞MIapaca2的細胞毒活性，CTL克隆具有非常強的針對MIapaca2的細胞毒活性。另ー方面，針對表達KIF20A而不表達HLA-A24的PK59沒有顯示出顯著的特異細胞毒活性。[圖7-1]圖7描述了表位肽的篩選結(jié)果，其進ー步證明，KNTC2-A24-9-309 (SEQID NO: 196) , KNTC2-A24-9-124 (SEQ ID NO:20 2) , KIF20A-A24-9-1 54 (SEQID NO:210) KNTC2-A24-9-150 (SEQ ID NO : 213)，KNTC2-A24-10-452 (SEQ IDNO: 214), KNTC2-A24-10-227 (SEQ ID NO: 217)和 KNTC2-A24-10-273 (SEQ ID NO: 223)顯示出強的IFN-gamma產(chǎn)生?！╝〃描述了陰性肽的實例，其雖然可能具有與HLA的結(jié)合活性但沒有檢測出具有CTL-誘導能力。?！╞〃描述了 KNTC2-A24-9-309(SEQ ID NO: 196)的CTL i秀 導能力。IFN-gamma ELISPOT 測定顯示與對照相比 KNTC2-A24-9-309 (SEQ ID NO: 196)具有強的IFN-gamma產(chǎn)生，并且從畫框的孔所示的陽性孔#8建立的CTL系證明了特異針對用該表位肽沖擊的靶細胞的響應?！╟〃描述了 KNTC2-A24-9-124(SEQ ID NO:202)的CTL誘導能力。IFN-gamma ELISPOT 測定顯示與對照相比 KNTC2-A24-9-124(SEQ ID N0:202)具有強的IFN-gamma產(chǎn)生，并且從畫框的孔所示的陽性孔#5建立的CTL系證明了特異針對用該表位肽沖擊的靶細胞的響應?！?!〃描述了 KIF20A-A24-9-154(SEQ ID N0:210)的CTL誘導能力。IFN-gamma ELISPOT 測定顯示與對照相比 KIF20A-A24-9-154(SEQ ID N0:210)具有強的IFN-gamma產(chǎn)生，并且從畫框的孔所示的陽性孔#5建立的CTL系和克隆證明了特異針對用表位肽沖擊的靶細胞的響應?！╡〃描述了 KNTC2-A24-9-150(SEQ ID N0:213)的CTL誘導能力。IFN-gamma ELISPOT測定顯示與對照相比 KNTC2-A24-9-150 (SEQ ID NO:213)具有強的IFN-gamma產(chǎn)生，并且從畫框的孔所示的陽性孔#7建立的CTL系證明了特異針對用該表位肽沖擊的靶細胞的響應。[圖7-2]圖7描述了表位肽的篩選結(jié)果，其進ー步證明，KNTC2-A24-9-309 (SEQID NO: 196) , KNTC2-A24-9-124 (SEQ ID NO:20 2) , KIF20A-A24-9-1 54 (SEQID NO:210)KNTC2-A24-9-150 (SEQ ID NO:213) , KNTC2-A24-10-452 (SEQ IDNO:214), KNTC2-A24-10-227 (SEQ ID N0:217)和 KNTC2-A24-10-273 (SEQ ID NO:223)顯示出強的 IFN-gamma 產(chǎn)生。〃f"描述了 KNTC2-A24-10-452 (SEQ ID NO: 214)的 CTL 誘導能力。IFN-gamma ELISPOT 測定顯示與對照相比 KNTC2-A24-10-452 (SEQ ID NO:214)具有強的IFN-gamma產(chǎn)生，并且從左上圖中畫框的孔所示的陽性孔#4和中圖中畫框孔#5建立的CTL系和克隆顯示了特異針對用該表位肽沖擊的靶細胞的響應。而且，通過有限稀釋從來自#5孔的CTL系選出的CTL克隆證明了特異針對靶細胞的CTL活性。從#4孔建立的CTL系顯示出特異針對同時用全長KNTC2基因和HLA-A24分子轉(zhuǎn)染的HEK293的CTL活性。另外，制備了用全長KNTC2而沒有用HLA-A24轉(zhuǎn)染的HEK293，用HLA-A24而沒有用全長KNTC2轉(zhuǎn)染的HEK293，和用HLA-A24轉(zhuǎn)染并用KNTC-9-309肽沖擊的HEK293，作為陰性對照。〃g〃描述了 KNTC2-A24-10-227(SEQ ID N0:217)的 CTL 誘導能力。IFN-gamma ELISPOT 測定顯示與對照相比KNTC2-A24-10-227(SEQ ID N0:217)具有強的IFN-gamma產(chǎn)生，并且從畫框的孔所示的陽性孔#1建立的CTL系證明了特異針對用表位肽沖擊的靶細胞的響應?！╤〃描述7 KNTC2-A24-10-273 (SEQ ID NO:223)的 CTL 誘導能力。IFN-gamma ELISPOT 測定顯示與對照相比KNTC2-A24-10-273(SEQ IDNO:223)具有強的IFN-gamma產(chǎn)生，并且從畫框的孔所示的陽性孔#8建立的CTL系證明了特異針對用該表位肽沖擊的靶細胞的響應。[圖8-1]圖8描述了表位肽的篩選結(jié)果，其進ー步證明，TTK-A02-9-462 (SEQIDN0:227), TTK-A02-9-719(SEQ ID NO:233)，TTK-A02-9-547(SEQ ID NO:228)和TTK-A02-10-462 (SEQ ID NO :254)顯示出強的IFN-gamma產(chǎn)生。〃a〃描述了陰性肽的實例，其雖然可能具有與HLA的結(jié)合活性但沒有檢測出具有CTL-誘導能力。"b"描述了TTK-A02-9-462 (SEQ ID NO:227)的 CTL 誘導能力。IFN-gamma ELISPOT 測定顯示與對照相比TTK-A02-9-462 (SEQ ID NO: 227)具有強的IFN-gamma產(chǎn)生，并且從畫框的孔所示的陽性孔M建立的CTL系和兩個克隆證明了特異針對用表位肽沖擊的靶細胞的響應。所建立的CTL克隆顯示出針對同時用TTK基因和HLA-A02分子轉(zhuǎn)染的C0S7的高特異CTL活性。 另外，制備了用全長TTK而沒有用HLA-A02轉(zhuǎn)染的C0S7，用HLA-A02而沒有用全長TTK轉(zhuǎn)染的C0S7，和用HLA-A02轉(zhuǎn)染并用TTK-9-547肽沖擊的TTK，作為陰性對照?！╟〃描述了TTK-A02-9-719(SEQ ID NO:233)的 CTL 誘導能力。IFN-gamma ELISPOT 測定顯示與對照相比TTK-A02-9-719(SEQ ID NO:233)具有強的IFN-gamma產(chǎn)生，并且從畫框的孔所示的陽性孔#1建立了 CTL系和克隆。所建立的CTL系針對同時用全長TTK基因和HLA-A02分子轉(zhuǎn)染的C0S7顯示出高的特異CTL活性。另外，制備了用全長TTK而沒有用HLA-A02轉(zhuǎn)染的C0S7以及用HLA-A02和作為全長TTK的替代物的HIG2基因轉(zhuǎn)染的C0S7，作為陰性對照。[圖8-2]圖8描述了表位肽的篩選結(jié)果，其進ー步證明，TTK-A02-9-462 (SEQIDN0:227), TTK-A02-9-719(SEQ ID NO:233)，TTK-A02-9-547 (SEQ ID NO:228)和 TTK-A02-10-462 (SEQ ID NO:254)顯示出強的 IFN-gamma 產(chǎn)生?！╠〃 描述了TTK-A02-9-547 (SEQ ID NO:228)的 CTL 誘導能力。IFN-gamma ELISPOT 測定顯示與對照相比TTK-A02-9-547 (SEQ ID NO: 228)具有強的IFN-gamma產(chǎn)生，并且從畫框的孔所示的陽性孔#2建立了 CTL系和克隆。所建立的CTL系顯示出針對同時用全長TTK基因和HLA-A02分子轉(zhuǎn)染的C0S7的高特異CTL活性。另外，制備了用全長TTK而沒有用HLA-A02轉(zhuǎn)染的C0S7，用HLA-A02而沒有用全長TTK轉(zhuǎn)染的C0S7，和用HLA-A02轉(zhuǎn)染并用TTK-10-462沖擊的C0S7，作為陰性對照。[圖8-3]圖8描述了表位肽的篩選結(jié)果，其進ー步證明，TTK-A02-9-462 (SEQ ID NO: 227)、TTK-A02-9-719(SEQ ID NO:233)、TTK-A02-9_547(SEQ ID NO:228)和TTK-A02-10-462(SEQID NO:254)顯示出強的 IFN-gamma 產(chǎn)生?！╡〃描述了 TTK-A02-10-462 (SEQ ID NO:254)的CTL 誘導能力。IFN-gammaELISPOT 測定顯示與對照相比 TTK-A02-10-462 (SEQ ID NO:254)具有強的IFN-gamma產(chǎn)生，并且從畫框的孔所示的陽性孔#8建立了 CTL系和3個克隆。所建立的CTL克隆顯示出針對同時用全長TTK基因和HLA-A02分子轉(zhuǎn)染的C0S7的高特異CTL活性。另外，制備了用全長TTK而沒有用HLA-A02轉(zhuǎn)染的C0S7，用HLA-A02而沒有用全長TTK轉(zhuǎn)染的C0S7，和用HLA-A02轉(zhuǎn)染并用TTK-9-547肽沖擊的C0S7，作為陰性對照。[圖9-1]圖9描述了表位肽的篩選結(jié)果，其進ー步證明，URLC10-A02-9-206 (SEQ IDNO:271), URLC10-A02-9-212(SEQ ID NO:272)和 URLC10-A02-10-211(SEQ ID NO:288) M示出強的IFN-ga_a產(chǎn)生?！╝〃描述了陰性肽的實例，其雖然可能具有與HLA的結(jié)合活性但沒有檢測出具有CTL-誘導能力。〃b〃描述了 URLC10-A02-9-206(SEQ ID N0:271)的CTL誘導能力。IFN-gamma ELISPOT 測定 顯示與對照相比 URLC10-A02-9-206 (SEQ ID N0:271)具有強的IFN-gamma產(chǎn)生，并且從畫框的孔所示的陽性孔#7建立的CTL系顯示了特異針對用表位肽沖擊的靶細胞的響應?！╟〃描述了 URLC10-A02-9-212(SEQ ID NO:272)的CTL誘導能力。IFN-gamma ELISPOT 測定顯示與對照相比 URLC10-A02-9-212 (SEQ ID NO:272)具有強的IFN-gamma產(chǎn)生，并且從畫框的孔所示的陽性孔#3建立的CTL系證明了特異針對用表位肽沖擊的靶細胞的響應?！?!〃描述了 URLC10-A02-10-211(SEQ ID NO:288)的CTL誘導能力。IFN-gamma ELISPOT 測定顯示與對照相比 URLC10-A02-10-211 (SEQ IDNO:288)具有強的IFN-gamma產(chǎn)生，并且從畫框的孔所示的陽性孔#5建立的CTL系證明了特異針對用表位肽沖擊的靶細胞的響應。[圖9-2]圖9描述了表位肽的篩選結(jié)果，其進ー步證明，URLC10-A02-9-206 (SEQ IDNO:271), URLC10-A02-9-212(SEQ ID NO:272)和 URLC10-A02-10-211(SEQ ID NO:288) M示出強的IFN-gamma產(chǎn)生?！ɡm(xù)d〃，所建立的CTL克隆顯示出針對同時用全長URLClO基因和HLA-A02分子轉(zhuǎn)染的C0S7、HEK293和293T的高特異CTL活性。另外，制備了用全長URLClO而沒有用HLA-A02轉(zhuǎn)染的HEK293或293T，和用HLA-A02轉(zhuǎn)染并用URLC10-10-64沖擊的C0S7、HEK293或293T，作為陰性對照。在本附圖中，〃+〃表示經(jīng)肽沖擊的靶物，〃-〃表示無肽沖擊的祀物，〃R〃表示響應物(Responder), 〃S〃表示刺激物(Stimulator), 〃E〃表示效應物(Effctor), 〃T〃 表示祀物(Target)。發(fā)明詳細說明除非特別指出，否則本文使用的詞語〃一〃、〃 ー個〃和〃該〃的意思是指〃至少ー個”。除非特別定義，否則本文使用的全部科技術語具有與本發(fā)明所述領域普通技術人員所共同理解的相同的意思。本發(fā)明部分地基于可用于免疫治療的靶標的發(fā)現(xiàn)。新TAA特別是可誘導強力而特異的抗腫瘤免疫響應的TAA的鑒定，為進一步開發(fā)肽疫苗策略在各種類型癌癥中的臨床應用提供了依據(jù)(Boon T et al. , (1996) J Exp Medl83:725-9. ;van derBruggen P et al. , (1991)Science 254:1643-7. ;Brichard V etal., (1993)J ExpMed 178:489-95. ;Kawakami Y et al. ,(1994) J Exp Med 180:347-52. ;Shichijo Set al. , (1998) J Exp Med 187:277-88. ; Chen YT et al. , (1997) Proc. Natl. Acd. Sci.USA,94:1914-8. ;Harris CC, (1996)J Natl Cancer Inst88:1442-55. ;ButterfieldLH et al. , (1999) Cancer Res 59:3134-42. ; Vissers JL et al. , (1999) CancerRes 59: 5554-9. ; van der Burg SH et al. , (1996) J. Immunol 156: 3308-14. ; TanakaF et al., (1997)Cancer Res 57:4465-8. ;Fujie T et al. , (1999)IntJ Cancer80:169-72. ;Kikuchi M et al. , (1999)Int J Cancer 81:459-66. ;Oiso M et al. , (1999)Int J Cancer 81:387-94.)。由于TAA往往沒有免疫原性，所以發(fā)現(xiàn)合適的靶標是極其重要的課題。如上文指出的，CDH3 (GenBank 登錄號 NM_001793; SEQ ID Nos. I, 2)，EPHA4 (GenBank 登錄號 L36M5; SEQ ID Nos. 3, 4)，ECT2 (GenBank 登錄號 AY376439; SEQ ID Nos. 5，6)，HIG2 (GenBank 登錄號 NMjn3332; SEQ ID Nos. 7, 8)INHBB (GenBank 登錄號 NM_002193; SEQ ID Nos. 9，10)， KIF20A (GenBank 登錄號 NM_005733; SEQ ID Nos. 11,12)，KNTC2 (GenBank 登錄號 AF017790; SEQ ID Nos. 13，14)，TTK (GenBank 登錄號 NM_003318; SEQ ID Nos. 15，16)和URLClO (GenBank 登錄號 NM_017527; SEQ ID Nos. 17，18)在先前已經(jīng)通過 cDNA 微陣列技術被鑒定為在各種癌癥中過表達。在本發(fā)明中，衍生自CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB、KIF20A、KNTC2、TTK 或 URLC10的肽被證明是HLA-A24和HLA-A2限制性的TAA表位，其中HLA-A24和HLA-A2是在日本人和白種人群中普遍發(fā)現(xiàn)的HLA等位基因。具體地，利用它們對HLA-A24或HLA-A2的結(jié)合親和性，鑒定出了衍生自 CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB, KIF20A、KNTC2、TTK 或 URLC10 的、可結(jié)合HLA-A24或HLA-A2的肽候選物。通過在體外用負載有這些肽的樹突細胞(DC)對T細胞進行刺激之后，使用如下的肽成功地建立了 CTL。CDH3-A24-9-513(SEQ ID NO:19)，CDH3-A24-9-406(SEQ ID NO:22)，CDH3-A24-10-807(SEQ ID NO :30),CDH3-A24-10-332(SEQ ID NO :34),CDH3-A24-10-655(SEQ ID NO :344),CDH3-A24-10-470(SEQ ID NO :358),EphA4-A24-9-453(SEQ ID N0:41),EphA4-A24-9-5(SEQ ID NO :44),EphA4-A24-9-869(SEQ ID NO :46),EphA4-A24-9-420(SEQ ID NO :48),EphA4-A24-10-24(SEQ ID NO :78),EphA4-A02-9-501(SEQ ID NO :376),EphA4-A02-9-165(SEQ ID NO :379),ECT2-A24-9-515(SEQ ID NO :80),ECT2-A24-10-40(SEQ ID NO:100)，ECT2-A24-10-101(SEQ ID NO:101)，HIG2-A24-9-19(SEQ ID NO:110)，HIG2-A24-9-22(SEQ ID NO:111)，HIG2-A24-9-8(SEQ ID NO :387),
HIG2-A24-10-7(SEQ ID NO:112)，HIG2-A24-10-18(SEQ ID NO :394),HIG2-A02-9-8(SEQ ID NO:114)，HIG2-A02-9-15(SEQ ID NO:116)，HIG2-A02-9-4(SEQ ID NO:117)，HIG2-A02-10-8(SEQ ID NO:121)，INHBB-A24-9-180(SEQ ID NO :395),INHBB-A24-10-180(SEQ ID NO:133)，INHBB-A24-10-305(SEQ ID NO:135)，INHBB-A24-10-7(SEQ ID NO:137)，INHBB-A24-10-212(SEQ ID NO :426),KIF20A-A24-9-305(SEQ ID NO:174)，
KIF20A-A24-9-383(SEQ ID NO:178)，KIF20A-A24-10-304(SEQ ID NO:186)，KIF20A-A24-10-66(SEQ ID NO:194)，KNTC2-A24-9-309(SEQ ID NO:196)，KNTC2-A24-9-124(SEQ ID NO :202),KNTC2-A24-9-154(SEQ ID NO:210)，KNTC2-A24-9-150(SEQ ID NO:213)，KNTC2-A24-10-452(SEQ ID NO:214)，KNTC2-A24-10-227(SEQ ID NO:217)，KNTC2-A24-10-273(SEQ ID NO :223),TTK-A02-9-462(SEQ ID NO :227),TTK-A02-9-547(SEQ ID NO :228),TTK-A02-9-719(SEQ ID NO :233),TTK-A02-10-462(SEQ ID NO :254),URLC-A02-9-206(SEQ ID NO:271)，URLC-A02-9-212(SEQ ID NO :272)和URLC-A02-10-211(SEQ ID NO :288)這些肽是每種HLA-A24或HLA-A2限制性TTA的表位肽。因為這些抗原在大多數(shù)癌癥中過表達并且與腫瘤細胞增殖相關，因此它們可以用作針對癌癥的免疫治療靶標。癌癥實例包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜異位、食道癌、胃癌、彌散型胃癌、肝、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巣癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤和睪丸腫瘤。因此，本發(fā)明進ー步提供了治療或預防受試者體內(nèi)與⑶H3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB、KIF20A、KNTC2、TTK和/或URLClO過表達相關的疾病例如癌癥的方法，這些方法包括向受試者施用小于大約40個氨基酸的免疫原性肽的步驟，其經(jīng)常小于大約20個氨基酸，通常小于大約15個氨基酸，并且具有如下的氨基酸序列SEQ ID N0:19、22、30、34、344、358、41、44、46、48、78、376、379、80、100、101、110、111、387、112、394、114、116、117、121、395、133、135、137、426、174、178、186、194、196、202、210、213、214、217、223、227、228、233、254、271,272 或 288?；蛘?，免疫原性肽可以具有如下提出的氨基酸序列，SEQ ID NO: 19、22、30、34、344、358、41、44、46、48、78、376、379、80、100、101、110、111、387、112、394、114、116、117、121、395、133、135、137、426、174、178、186、194、196、202、210、213、214、217、223、227、228、233、254、271、272或288，且其中有I個、2個或數(shù)個(例如最多5個)氨基酸被替換、刪除或添加，只要所得的變體肽保留免疫原活性即可(也就是可誘導特異針對表達CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB, KIF20A、KNTC2、TTK 和/或 URLClO 的細胞例如癌細胞的 CTL 的能力)。被替換、刪除或添加的殘基的數(shù)目一般為5個氨基酸或者更少，優(yōu)選地4個氨基酸或更少，更優(yōu)選地3個氨基酸或者更少，再更加優(yōu)選地I個或2個氨基酸。預期的癌癥包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜異位、食道癌、胃癌、彌散型胃癌、肝、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巣癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組 織腫瘤和睪丸腫瘤。而且，本發(fā)明提供了用于防止上述這些疾病的手術后復發(fā)的方法。
已知變體肽(即通過向原始氨基酸序列替換、刪除或添加I個、2個或多個氨基酸殘基修飾使氨基酸序列而得的肽)可以保持原來的生物活性(Mark DF et al.，(1984)Proc Natl Acad Sci USA 81:5662-6. ;Zoller MJ and Smith Μ, (1982)Nucleic AcidsRes 10:6487-500. ;Dalbadie-McFarland G et al. , (1982)Proc Natl Acad Sci USA79:6409-13.)。在本發(fā)明的語境中，優(yōu)選地，氨基酸修飾的結(jié)果是保留原始氨基酸側(cè)鏈的性質(zhì)(該過程被稱作保守氨基酸替換)。氨基酸側(cè)鏈性質(zhì)的實例包括疏水氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)，親水氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)，和具有如下共有功能基團或特征的側(cè)鏈脂肪族側(cè)鏈(G、A、V、L、I、P);含有羥基的側(cè)鏈(S、T、Y);含有硫原子的側(cè)鏈(C、M)；含有羧酸和氨基的側(cè)鏈(D、N、E、Q);含有堿基的側(cè)鏈(R、K、H);和含有芳香基的側(cè)鏈(H、F、Y、W)。注意，插入字母表示的是氨基酸的單字母編碼。在優(yōu)選實施方案中，免疫原性肽是九肽(9聚體)或十肽(10聚體)。本發(fā)明進ー步提供在受試者體內(nèi)誘導針對與CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB,KIF20A、KNTC2、TTK和/或URLClO的過表達相關的疾病(例如癌癥)的抗腫瘤免疫的方法，這樣的方法包括向需要的受試者施用本發(fā)明免疫原性肽，即具有SEQ ID NO: 19,22,30,34、344、358、41、44、46、48、78、376、379、80、100、101、110、111、387、112、394、114、116、117、121、395、133、135、137、426、174、178、186、194、196、202、210、213、214、217、223、227、228、233、254、271、272或288的氨基酸序列的肽或其變體(即包含I個、2個或數(shù)個(例如最多5個)氨基酸的替換、刪除或添加)的步驟。預期的癌癥包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜異位、食道癌、胃癌、彌散型胃癌、肝、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巣癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤和睪丸腫瘤。在本發(fā)明的語境中，受試者優(yōu)選是哺乳動物。哺乳動物的實例包括，但不限于，例如人、非人靈長動物、小鼠、大鼠、狗、貓、馬或牛。在本發(fā)明中，肽可以通過體內(nèi)或離體(ex vivo)程序施用給受試者。而且，本發(fā)明還提供了九肽或十肽用于制造用于治療或預防與CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB、KIF20A、
的過表達相關的疾病(例如癌癥)的免疫原性組合物的應用，所述九肽或十肽從具有如下氨基酸序列的肽中選出SEQ ID N0:19、22、30、34、344、358、41、44、46、48、78、376、379、80、100、101、110、111、387、112、394、114、116、117、121、395、133、135、137、426、174、178、186、194、196、202、210、213、214、217、223、227、228、233、254、271、272 或288(以及其變體)。預期的癌癥包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜異位、食道癌、胃癌、彌散型胃癌、肝、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巣癌、胰腺癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤和睪丸腫瘤。下列肽的同源性分析證明，它們與來源于任何已知人類基因產(chǎn)物的肽均沒有顯著的同源性。CDH3-A24-9-513(SEQ ID NO:19)，CDH3-A24-9-406(SEQ ID NO:22)，CDH3-A24-10-807(SEQ ID NO :30), CDH3-A24-10-332(SEQ ID NO :34),CDH3-A24-10-655(SEQ ID NO :344),CDH3-A24-10-470(SEQ ID NO :358),EphA4-A24-9-453(SEQ ID NO :41),EphA4-A24-9-5(SEQ ID NO :44),EphA4-A24-9-869(SEQ ID NO :46),EphA4-A24-9-420(SEQ ID NO :48),EphA4-A24-10-24(SEQ ID NO :78),EphA4-A02-9-501(SEQ ID NO :376),EphA4-A02-9-165(SEQ ID NO :379),ECT2-A24-9-515(SEQ ID NO:80)，ECT2-A24-10-40(SEQ ID NO:100)，ECT2-A24-10-101(SEQ ID NO:101)，HIG2-A24-9-19(SEQ ID NO:110)，HIG2-A24-9-22(SEQ ID NO:111)，HIG2-A24-9-8(SEQ ID NO :387),HIG2-A24-10-7(SEQ ID NO:112)，HIG2-A24-10-18(SEQ ID NO :394),HIG2-A02-9-8(SEQ ID NO:114)，HIG2-A02-9-15(SEQ ID NO:116)，HIG2-A02-9-4(SEQ ID NO:117)，HIG2-A02-10-8(SEQ ID NO:121)，INHBB-A24-9-180(SEQ ID NO :395),INHBB-A24-10-180(SEQ ID NO:133)，INHBB-A24-10-305(SEQ ID NO:135)，INHBB-A24-10-7(SEQ ID NO:137)，INHBB-A24-10-212(SEQ ID NO :426),KIF20A-A24-9-305(SEQ ID NO:174)，KIF20A-A24-9-383(SEQ ID NO:178)，
KIF20A-A24-10-304(SEQ ID NO:186)，KIF20A-A24-10-66(SEQ ID NO:194)，KNTC2-A24-9-309(SEQ ID NO:196)，KNTC2-A24-9-124(SEQ ID NO :202),KNTC2-A24-9-154(SEQ ID NO:210)，KNTC2-A24-9-150(SEQ ID NO:213)，KNTC2-A24-10-452(SEQ ID NO:214)，KNTC2-A24-10-227(SEQ ID NO:217)，
KNTC2-A24-10-273(SEQ ID NO :223),TTK-A02-9-462(SEQ ID NO :227),TTK-A02-9-547(SEQ ID NO :228),TTK-A02-9-719(SEQ ID NO :233),TTK-A02-10-462(SEQ ID NO :254),URLC-A02-9-206(SEQ ID NO:271)，URLC-A02-9-212(SEQ ID NO :272)和URLC-A02-10-211(SEQ ID NO :288)因此，針對這些分子的免疫治療導致未知或不良免疫響應的可能性顯著降低。關于HLA抗原，這里提供的數(shù)據(jù)顯示，A-24型或A-2型抗原(它們據(jù)稱在日本人中高表達)有利于獲得有效的結(jié)果。更加優(yōu)選使用A-2402和A-0201等亞型。典型地，在臨床上，預先對需要治療的患者的HLA抗原類型進行檢查，這樣就有可能選擇具有針對患者抗原的高水平的結(jié)合親和性，或者具有通過抗原呈遞誘導細胞毒T細胞(CTL)的能力的合適的肽。而且，為了獲得具有高的結(jié)合親和性和CTL誘導能力的肽，可以在天然存在的 CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB, KIF20A、KNTC2、TTK 和 URLClO 的部分肽的氨基酸序列的基礎上進行I個、2個或數(shù)個(例如最多5個)氨基酸的替換、刪除或添加。這里，術語“數(shù)個”是指5個或者更少，更優(yōu)選地3個或者更少。而且，除了自然被展示的肽之外，由于通過與HLA抗原結(jié)合而展示的肽的序列的規(guī)則性已經(jīng)知曉(Kubo RT, et al.，(1994)J. Immunol. , 152, 3913-24. ; Rammensee HG, et al. , (199t>; Immunogenetics. 41:178-228. ;Kondo A, et al. , (1995) J. Immunol. 155:4307-12.)，所以可以根據(jù)這些規(guī)則性對本發(fā)明的免疫原性肽進行修飾。例如，可以優(yōu)選地使用N端第二個氨基酸被苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸或色氨酸替換的、具有高HLA-24結(jié)合親和性的肽。類似地，也可以有利地使用C端氨基酸被苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸替換的肽。另一方面，可以有利地使用N端第二個氨基酸被亮氨酸或甲硫氨酸替換，或者C端氨基酸被纈氨酸或亮氨酸替換的、具有高HLA-A2結(jié)合親和性的肽。替換不僅可以在末端氨基酸上進行，也可以在肽的潛在TCR識別位點處進行。許多研究已經(jīng)證明，肽內(nèi)氨基酸替換可以等同于或者優(yōu)于原來的肽，例如 CAP1, p53(264_272), Her-2/neu(369-377)or gplOO(209_217) (Zarembaet al. Cancer Res. 57, 4570-4577, 1997, T. K. Hoffmann et al. J Immunol. (2002) FebI;168 (3):1338-47. , S. 0. Dionne et al. Cancer Tmmunol immunother. (2003)52:199-206和 S. 0. Dionne et al. Cancer Immunology, Immunotherapy (2004) 53，307-314)。而且，可以向肽的N端和/或C端添加I到2個氨基酸。
然而，當肽序列與具有不同功能的內(nèi)源或外源蛋白質(zhì)的氨基酸序列的一部分相同時，可能會誘發(fā)副作用，例如自身免疫紊亂或者針對特定物質(zhì)的過敏綜合癥。因此，優(yōu)選地要避免免疫原序列與已知蛋白的氨基酸序列匹配的情況。這種情況可以通過用可獲得的數(shù)據(jù)庫進行同源性檢索加以避免。如果同源性檢索確認，其中有I個、2個或數(shù)個不同氨基酸被替換的肽在自然界不存在，那么為了例如增加與HLA抗原的結(jié)合親和性和/或增加CTL誘導性進行的上述氨基酸序列的修飾的危險就能夠避免。盡管與上述HLA抗原具有高結(jié)合親和性的肽被預期可高度有效地作為癌癥疫苗，但是必須對根據(jù)以高結(jié)合親和性的存在為指標選出的候選肽進行檢驗，考察其CTL誘導能力的實際存在。CTL誘導能力可以通過下述方式常規(guī)地加以確認誘導攜帯有人MHC抗原的抗原呈遞細胞(例如B淋巴細胞、巨噬細胞和樹突細胞)，或者更具體地，衍生自人外周血單核白細胞的樹突細胞，在用目標肽刺激之后，與CD8陽性細胞進行混合，并測量針對靶細胞的細胞毒活性。作為反應系統(tǒng)，可以使用可表達人HLA抗原的轉(zhuǎn)基因動物(例如在下列文獻中介紹的，BenMohamed L, et al. , (2000)Hum. Immunol. ;61 (8) :764-79 相關文獻、書籍、鏈接)。例如，可以用51Cr等放射性同位素標記靶細胞，并且可以根據(jù)靶細胞釋放的放 射性計算細胞毒活性?；蛘?，可以通過測量在攜帯有固定化肽的抗原呈遞細胞的存在下由CTL產(chǎn)生并釋放的IFN-ga_a,并用抗_IFN_ga_a單克隆抗體使培養(yǎng)基上的抑制區(qū)可視化來加以檢驗。作為檢查上述肽CTL誘導能力的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)與HLA抗原具有高結(jié)合親和性的肽不一定具有高誘導能力。然而，從具有由下列肽表示的氨基酸序列的肽構(gòu)成的群組中選擇的九肽或十肽則顯示出特別高的CTL誘導能力。CDH3-A24-9-513(SEQ ID NO:19)，CDH3-A24-9-406(SEQ ID NO:22)，CDH3-A24-10-807(SEQ ID NO :30),CDH3-A24-10-332(SEQ ID NO :34),CDH3-A24-10-655(SEQ ID NO :344),CDH3-A24-10-470(SEQ ID NO :358),EphA4-A24-9-453(SEQ ID NO :41),EphA4-A24-9-5(SEQ ID NO :44),EphA4-A24-9-869(SEQ ID NO :46),EphA4-A24-9-420(SEQ ID NO :48),EphA4-A24-10-24(SEQ ID NO :78),EphA4-A02-9-501(SEQ ID NO :376),EphA4-A02-9-165(SEQ ID NO :379),ECT2-A24-9-515(SEQ ID NO :80),ECT2-A24-10-40(SEQ ID NO:100)，ECT2-A24-10-101(SEQ ID NO:101)，HIG2-A24-9-19(SEQ ID NO:110)，HIG2-A24-9-22(SEQ ID NO:111)，HIG2-A24-9-8(SEQ ID NO :387),
HIG2-A24-10-7(SEQ ID NO:112)，HIG2-A24-10-18(SEQ ID NO :394),HIG2-A02-9-8(SEQ ID NO:114)，HIG2-A02-9-15(SEQ ID NO:116)，HIG2-A02-9-4(SEQ ID NO:117)，HIG2-A02-10-8(SEQ ID NO:121)，INHBB-A24-9-180(SEQ ID NO :395),INHBB-A24-10-180(SEQ ID NO:133)，
INHBB-A24-10-305(SEQ ID NO:135)，INHBB-A24-10-7(SEQ ID NO:137)，INHBB-A24-10-212(SEQ ID NO :426),KIF20A-A24-9-305(SEQ ID NO:174)，KIF20A-A24-9-383(SEQ ID NO:178)，KIF20A-A24-10-304(SEQ ID NO:186)，KIF20A-A24-10-66(SEQ ID NO:194)，KNTC2-A24-9-309(SEQ ID NO:196)，KNTC2-A24-9-124(SEQ ID NO :202),KNTC2-A24-9-154(SEQ ID NO:210)，KNTC2-A24-9-150(SEQ ID NO:213)，KNTC2-A24-10-452(SEQ ID NO:214)，KNTC2-A24-10-227(SEQ ID NO:217)，KNTC2-A24-10-273(SEQ ID NO :223),TTK-A02-9-462(SEQ ID NO :227),TTK-A02-9-547(SEQ ID NO :228),TTK-A02-9-719(SEQ ID NO :233),TTK-A02-10-462(SEQ ID NO :254),URLC-A02-9-206(SEQ ID NO:271)，URLC-A02-9-212(SEQ ID NO :272)和URLC-A02-10-211(SEQ ID NO :288)如上文指出的，本發(fā)明提供了具有細胞毒T細胞誘導能力的肽，S卩，具有SEQ IDN0:19、22、30、34、344、358、41、44、46、48、78、376、379、80、100、101、110、lll、387、112、394、114、116、117、121、395、133、135、137、426、174、178、186、194、196、202、210、213、214、217、223、227、228、233、254、271、272或288的氨基酸序列的肽或其變體(即有I個、2個或數(shù)個
氨基酸被替換、刪除或添加的那些)。優(yōu)選地，由在下列序列中表示的9個或10個氨基酸所構(gòu)成的氨基酸序列或它們的變體不與任何其它內(nèi)源蛋白質(zhì)相關的氨基酸序列相匹配SEQ IDN0:19、22、30、34、344、358、41、44、46、48、78、376、379、80、100、101、110、111、387、112、394、114、116、117、121、395、133、135、137、426、174、178、186、194、196、202、210、213、214、217、223、227、228、233、254、271、272 或 288。
特別地，從N端起第二個氨基酸處變?yōu)榱涟彼峄蚣琢虬彼岬陌被崽鎿Q，C端氨基酸變?yōu)槔i氨酸或亮氨酸的氨基酸替換，和N端和/或C端處I到2個氨基酸的氨基酸添加，是優(yōu)選變體的實例。本領域的技術人員會認識到，除了氨基酸替換和添加之外，肽的免疫學活性片段也可以在本發(fā)明的方法中使用。用于確定活性片段的方法是本領域眾所周知的。用經(jīng)過修飾的肽刺激獲得的CTL克隆能夠識別原來的肽，并對表達原來的肽的細胞造成損傷。本發(fā)明的肽可以用眾所周知的技術制備。例如，肽可以合成制備，使用重組DNA技術或者化學合成。本發(fā)明的肽可以単獨合成，或者作為包含2個或更個肽的較長多肽合成。本發(fā)明的肽優(yōu)選地是分離的，即，基本上沒有其它的天然存在的宿主細胞蛋白質(zhì)及其片段。本發(fā)明的肽可以含有修飾，例如糖基化、側(cè)鏈氧化或磷酸化；只要該修飾不破壞本文所述的肽的生物活性即結(jié)合HLA抗原并誘導CTL的能力即可。其它的修飾包括摻入D氨基酸或其它氨基酸模擬物，它們可以例如用來增加肽的血清半衰期。
而且，本發(fā)明可以包含篩選有I個、2個或數(shù)個氨基酸被替換的肽的方法，其中所述肽包含選自下組的氨基酸序列，SEQ ID N0:SEQ ID NO: 19、22、30、34、344、358、41、44、46、48、78、80、100、101、110、111、387、112、394、395、133、135、137、426、174、178、186、194、196、202、210、213、214、217或223，所述方法包括如下步驟(a)確認對含有I個、2個或數(shù)個氨基酸的替換物的整個序列沒有顯著的序列同源性；(b)測量候選替換物肽的CTL誘導能力；和(c)選擇CTL誘導能力等于或者高于原始肽的肽。例如，在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供了ー種方法用于鑒定能夠誘導針對表達至少ー種腫瘤相關抗原的細胞的CTL的肽，其中該腫瘤相關抗原是選自下組的抗原CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB、KIF20A、KNTC2、TTK 和 URLC10，所述方法包括如下步驟(i)提供或產(chǎn)生至少ー個候選序列，其包含通過向原始氨基酸序列替換、刪除或添加I個、2個或數(shù)個氨基酸殘基而被修飾的氨基酸序列，其中該原始氨基酸序列選自下組SEQ ID N0:19、22、30、34、344、358、41、44、46、48、78、80、100、101、110、lll、387、112、394、395、133、135、137、426、174、178、186、194、196、202、210、213、214、217 或 223 ；(ii)選擇與衍生自除所述腫瘤相關抗原之外的任何已知人基因產(chǎn)物的肽均無實質(zhì)顯著同源性的候選序列；(iii)使由從步驟(ii)中選出的候選序列組成的肽與抗原呈遞細胞接觸；(iv)使步驟(C)中的抗原呈遞細胞與T細胞接觸，以評估肽刺激T細胞的能力；和(V)鑒定CTL誘導能力等于或高于由原始氨基酸序列組成的肽的肽。優(yōu)選地，氨基酸被替換為保守該氨基酸側(cè)鏈性質(zhì)的不同氨基酸(該過程稱作保守氨基酸替換)。氨基酸側(cè)鏈性質(zhì)的實例有疏水氨基酸(ム、1、し1^、？、1、￥、￥)，親水氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)，和具有如下共有功能基團或特征的側(cè)鏈脂肪族側(cè)鏈(G、A、V、L、I、P);含有羥基的側(cè)鏈(S、T、Y);含有硫原子的側(cè)鏈(C、M);含有羧酸和氨基的側(cè)鏈(D、N、E、Q);含有堿基的側(cè)鏈(R、K、H);和含有芳香基的側(cè)鏈(H、F、Y、W)。注意，插入字母表示的是氨基酸的單字母編碼。在本發(fā)明中，實質(zhì)顯著的同源性是，例如，與所比較的已知人基因產(chǎn)物有超過90%，優(yōu)選地95%，更優(yōu)選地99%或100%的同一性。
本發(fā)明的肽可以制備為包括本發(fā)明的2個或數(shù)個肽的組合，用作與⑶H3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB, KIF20A、KNTC2、TTK和/或URLClO的過表達相關的疾病(例如癌癥)的疫苗，這種疫苗可體內(nèi)誘導CTL。預期的癌癥包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜異位、食道癌、胃癌、彌散型胃癌、肝、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巣癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟 組織腫瘤和睪丸腫瘤。這些肽可以構(gòu)成合劑(cocktail)，或者可以通過標準技術彼此偶聯(lián)。例如，這些肽可以表達成單個多肽序列。組合中的肽可以是相同的也可以是不同的。通過施用本發(fā)明的肽，肽被高密度地呈遞在抗原呈遞細胞的HLA抗原上，其進ー步誘導可特異地與在所展示肽和HLA抗原之間形成的復合體進行反應的CTL?；蛘?，可以用本發(fā)明的肽刺激在細胞表面上具有本發(fā)明固定化肽的抗原呈遞細胞。將這些細胞再次施用給相應受試者可誘導CTL，結(jié)果，可以提高針對靶細胞的攻擊性。更具體地，本發(fā)明提供了用于治療和/或預防與CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB、KIF20A、KNTC2、TTK和/或URLClO過表達相關疾病(例如癌癥)的増殖、轉(zhuǎn)移等的藥物，其包括一種或多種本發(fā)明的肽或者編碼這些肽的多核苷酸。本發(fā)明的肽或多核苷酸特別有用于治療 CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIF20A, KNTC2, TTK 和/或 URLClO 相關疾病，例如癌癥。預期的癌癥包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜異位、食道癌、胃癌、彌散型胃癌、肝、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巣癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤和睪丸腫瘤。本發(fā)明的肽可以作為用傳統(tǒng)制劑方法配制的藥物組合物直接施用給受試者。在這種情況下，除了本發(fā)明的肽之外，還可以視情況包含通常用于藥物的載體、賦形劑等，但沒有特殊的限制。本發(fā)明的免疫原性組合物可以用于治療和預防與⑶H3，EPHA4, ECT2, HIG2,INHBB, KIF20A, KNTC2, TTK和/或URLClO的過表達相關的疾病，例如癌癥。預期的癌癥包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜異位、食道癌、胃癌、彌散型胃癌、肝、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巣癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤和睪丸腫瘤。包含一種或多種本發(fā)明的肽作為活性成分的用于治療和/或預防與⑶H3，EPHA4,ECT2, HIG2, INHBB, KIF20A, KNTC2, TTK和/或URLClO的過表達相關的疾病(例如癌癥)的免疫原性組合物，還可以進ー步包含佐劑，以便有效地建立細胞免疫?；蛘撸鼈兛梢院推渌钚猿煞掷缈拱﹦┮黄鹗┯?。預期的癌癥包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜異位、食道癌、胃癌、彌散型胃癌、肝、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巣癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤和睪丸腫瘤。合適的制劑包括顆粒(granules)。合適的佐劑在文獻中有介紹(Johnson AG. (1994) Clin. Microbiol. Rev. , 7:277-89.) 佐劑實例包括，但不限干，磷酸鋁、氫氧化鋁和明礬。而且，可以方便地使用脂質(zhì)體制劑、藥物結(jié)合于數(shù)mcm直徑球珠的顆粒制劑、和脂質(zhì)與肽結(jié)合的制劑。施用的方法可以是ロ服、皮內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)注射等，并可以包括系統(tǒng)施用或針對靶腫瘤附近的局部施用。本發(fā)明肽的劑量可以根據(jù)所治療的疾病、患者的年齡、體重、施用方法等進行合適的調(diào)節(jié)。盡管劑量一般為0. OOlmg-IOOOmg,優(yōu)選地0. Olmg-IOOmg,更優(yōu)選地0. Img-IOmg,優(yōu)選地從數(shù)天到數(shù)月施用一次，本領域的技術人員可以容易地選擇合適的劑量和施用方法，這些參數(shù)的選擇和優(yōu)化完全在本領域的常規(guī)技術范圍之內(nèi)。本發(fā)明進一歩提供了稱作外來體(exosomes)的細胞外囊泡，其在表面上呈遞由本發(fā)明肽和HLA抗原之間形成的復合體。外來體可以通過使用，例如，在已公開的國際申請日文翻譯特表平11-510507號和特表2000-512161中詳細介紹的方法來制備，更優(yōu)選地，用從治療和/或預防所針對的受試者獲得的抗原呈遞細胞來制備。與本發(fā)明的肽相似，本發(fā)明的外來體可以作為癌癥疫苗進行預防注射。所用HLA抗原的類型必須與需要治療和/或預防的受試者的類型相匹配。例如，在日本人群中，HLA-A24或HLA-A2，特別是HLA-A2402或HLA-A0201，經(jīng)常是合適的。在一些實施方案中，本發(fā)明的藥劑包括可初始化(prime)細胞毒T淋巴細胞的成分。脂質(zhì)已被確認為是能夠在體內(nèi)針對病毒抗原初始化CTL的作用劑。例如，可以將棕櫚酸殘基附接到賴氨酸殘基的ε-和α-氨基，然后連接到本發(fā)明的免疫原性肽上。然后可以將脂質(zhì)化的肽或是直接在膠束或顆粒中施用，或者摻入到脂質(zhì)體中施用，或者在佐劑中乳化后施用。作為CTL應答的脂質(zhì)初始化的另ー個實例，大腸桿菌脂蛋白，例如三棕櫚酰-S-甘 油酰半胱氨酰絲氨酰-絲氨酸(P3CSS)，在共價附接到合適的肽后，可以用來初始化CTL (見例如 Deres et al. , Nature 342:561,1989)。本發(fā)明的免疫原性組合物還可以包括編碼本文公開的ー種或多種免疫原性肽的核酸。見例如 Wolff JA et al. , (1990) Science 247:1465-8;美國專利 Nos. 5，580，859; 5，589，466; 5，804，566; 5，739，118; 5，736，524; 5，679，647;和 W098/04720?；?DNA的輸送技術的實例包括“裸DNA”,輔助(布比卡因(bupivicaine)、聚合物、肽介導)輸送，陽離子脂質(zhì)體復合體，和顆粒介導的(基因槍)或壓カ介導的輸送(見例如美國專利No. 5，922，687)。本發(fā)明的肽還可以用病毒或細菌載體表達。合適的表達載體的實例包括減毒的病毒宿主，例如痘苗(vaccinia)或禽痘(fowlpox)。這種方法涉及使用例如痘苗病毒作為載體來表達編碼該肽的核苷酸序列。一旦引入到宿主內(nèi)，重組的痘苗病毒表達免疫原性肽，借此引發(fā)免疫應答。在免疫方案中有用的痘苗載體和方法在下列文獻中有介紹，例如美國專利4，722，848。另一種載體是BCG(卡介苗)。BCG載體在Stover et al. , Nature351:456-60, 1991中有介紹。很多其他的可用于治療性給藥或免疫的載體，例如腺病毒和腺伴隨病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)載體、脫毒的炭疽毒素載體等，是本領域中已知的。見例如 Shata et al. , Mol Med Today 6:66-71，2000; Shedlocket al. J Leukoc Biol 68:793-806，2000;Hipp et al. , In Vivo 14:571-85,2000。本發(fā)明還提供了使用一種或多種本發(fā)明的肽誘導抗原呈遞細胞的方法?？乖蔬f細胞的誘導可以通過下述方式實現(xiàn)從外周血單核細胞誘導樹突細胞，然后在體外、離體或體內(nèi)使本發(fā)明的ー種或多種肽接觸(刺激)它們。當向受試者施用本發(fā)明的肽時，在受試者體內(nèi)誘導出固定有本發(fā)明肽的抗原呈遞細胞。或者，可以在將本發(fā)明的肽固定到抗原呈遞細胞之后，將細胞作為疫苗施用給受試者。例如，離體施用可以包括如下步驟a :從受試者收集抗原呈遞細胞，和b :使步驟a的抗原呈遞細胞與本發(fā)明的肽接觸?；蛘?，根據(jù)本發(fā)明，提供了本發(fā)明的肽在制造可誘導抗原呈遞細胞的藥物組合物中的應用。進ー步，本發(fā)明還提供了用于誘導抗原呈遞細胞的本發(fā)明的肽。通過步驟b獲得的抗原呈遞細胞可以作為疫苗施用給受試者。本發(fā)明還提供了用于誘導具有高水平的細胞毒T細胞誘導能力的抗原呈遞細胞的方法，其中該方法包括在體外向抗原呈遞細胞轉(zhuǎn)化基因的步驟，該基因包括編碼本發(fā)明一種或多種肽的多核苷酸。所引入的基因可以是DNA或RNA的形式。關于引入的方法，沒有特殊的限制，可以恰當?shù)厥褂帽绢I域通常進行的各種方法，例如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、電穿孔和磷酸鈣方法。更具體地，轉(zhuǎn)染可以按照下列文獻中的描述來實施Reeves ME, et al.，(1996)Cancer Res.，56:5672-7. ;Butterfield LH, et al.，(1998)J.Immunol.，161:5607-13.
;Boczkowski D, et al. , (1996) J. Exp. Med. , 184:465-72.;已公開國際申請的日文翻譯No. 2000-509281。通過將基因轉(zhuǎn)化到抗原呈遞細胞，基因在細胞內(nèi)經(jīng)歷轉(zhuǎn)錄、翻譯等，然后所得的蛋白質(zhì)被MHC-I或-II類加工，并通過呈遞途徑呈遞部分肽。本發(fā)明進一歩提供了使用本發(fā)明的ー種或多種肽來誘導CTL的方法。當向受試者施用本發(fā)明的肽時，在受試者體內(nèi)誘導出CTL，藉此提高免疫系統(tǒng)靶定腫瘤組織中表達CDH3，EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIF20A, KNTC2, TTK 和/或 URLClO 的細胞(例如癌細胞)的強度。預期的癌癥包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜異位、食道癌、胃癌、彌散型胃癌、肝、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巣癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤和睪丸腫瘤?；蛘?，本發(fā)明的肽可以用于離體治療方法的語境中，其中在體外使本發(fā)明的ー種或多種肽接觸(刺激)從受試者來源的抗原呈遞細胞和CD8陽性細胞或外周血單核白細胞，誘導CTL之后，將細胞返回到受試者體內(nèi)。例如，該方法可以包括如下步驟a :從受試者收集抗原呈遞細胞，b :使步驟a的抗原呈遞細胞與本發(fā)明的肽接觸，c :將步驟b的抗原呈遞細胞與CD8+T細胞混合并共培養(yǎng)，從而誘導細胞毒T細胞；和d :從步驟c的共培養(yǎng)物中收集OT8+T細胞?；蛘?，根據(jù)本發(fā)明，提供了本發(fā)明的肽在制造可誘導CTL的藥物組合物中的應用。進ー步，本發(fā)明還提供了用于誘導CTL的本發(fā)明的肽。通過步驟d獲得的具有細胞毒活性的CD8+T細胞可以作為疫苗施用給受試者。本發(fā)明進一歩提供了用本發(fā)明的肽誘導的分離的細胞毒T細胞。通過用呈遞有ー種或多種本發(fā)明的肽的抗原呈遞細胞進行刺激而誘導出的細胞毒T細胞優(yōu)選地來源于作為治療和/或預防對象的受試者，這些細胞毒T細胞能夠單獨地施用，或與其它藥物，包括本發(fā)明的一種或多種肽或具有抗腫瘤活性的外來體，組合施用。所得的細胞毒T細胞特異針對呈遞有本發(fā)明肽，或者優(yōu)選地，呈遞有與用于誘導的肽相同的肽，的靶細胞發(fā)揮作用。靶細胞可以是內(nèi)源表達 CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB、KIF20A、KNTC2、TTK 和/或 URLClO的細胞，或者是被 CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB, KIF20A、KNTC2、TTK 和/或 URLClO 基因轉(zhuǎn)染的細胞。由于受本發(fā)明的肽的刺激而在細胞表面上呈遞這些肽的細胞也可以成為攻擊的靶標。本發(fā)明還提供了可呈遞由HLA抗原和本發(fā)明ー種或多種肽之間形成的復合物的抗原呈遞細胞。該抗原呈遞細胞通過與本發(fā)明的肽或編碼這些肽的核苷酸接觸而獲得，其優(yōu)選地來源于治療和/或預防所針對的受試者，并能夠作為疫苗單獨地施用或與其它藥物包括本發(fā)明的肽、外來體或細胞毒T細胞組合施用。本發(fā)明還提供了包含編碼能夠形成T細胞受體(TCR)的亞單位的多肽的核酸的組合物，并提供了其使用方法。TCR亞單位具有形成TCR的能力，所述TCR為T細胞提供針對呈遞 CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB, KIF20A、KNTC2、TTK 或 URLClO 的腫瘤細胞的特異性。通過使用本領域已知的方法，可以鑒定被一種或多種本發(fā)明的肽誘導的CTL的TCR亞單位的 α-和 β-鏈核酸(W02007/032255 和 Morgan et al.、J Immunol、171、3288 (2003))。衍生的 TCR 優(yōu)選地結(jié)合以高親合力展示 CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB, KIF20A、KNTC2、TTK或URLClO的靶細胞，且任選地在體內(nèi)或體外介導對呈遞⑶H3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB,KIF20A、KNTC2、TTK或URLClO肽的靶細胞的有效殺傷。編碼TCR亞單位的核酸可以被整合到合適的載體內(nèi)，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。這些 載體是本領域眾所周知的。核酸或含有它們的載體可以被有用地轉(zhuǎn)染進T細胞，該T細胞優(yōu)選地來自患者。有利地，本發(fā)明提供了制成的(off-the-shelf)組合物，其允許對患者自身的T細胞(或者其它哺乳動物的T細胞)進行快速的修飾，從而快速而容易地產(chǎn)生具有優(yōu)異的癌細胞殺傷性質(zhì)的修飾T細胞。另外，本發(fā)明提供了這樣的CTL，它們是通過用編碼TCR亞單位多肽的核酸進行轉(zhuǎn)導而制備的，所述TCR亞單位多肽可以在HLA-A24或HLA-A2的背景下結(jié)合⑶H3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB, KIF20A、KNTC2、TTK 或 URLClO 肽，例如 SEQ ID NO: 19、22、30、34、344、358、41、44、46、48、78、376、379、80、100、101、110、111、387、112、394、114、116、117、121、395、133、135、137、426、174、178、186、194、196、202、210、213、214、217、223、227、228、233、254、271、272或288。轉(zhuǎn)染的CTL能夠在體內(nèi)歸巢到(homing to)癌細胞，并能通過眾所周知的體外培養(yǎng)方法(例如，Kawakami et al. , J Immunol.，142，3452-3461 (1989))進行擴增。本發(fā)明的T細胞可用于形成免疫組合物，用于治療或預防需要治療或保護的受試者體內(nèi)的癌癥(W02006/031221)。在本發(fā)明的語境中，術語“疫苗”(也稱作免疫原性組合物)是指在接種到動物體內(nèi)時可誘導抗腫瘤免疫或抑制癌癥的物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，具有SEQ IDNO: 19、22、30、34、344、358、41、44、46、48、78、80、100、101、110、111、387、112、394、395、133、135、137、426、174、178、186、194、196、202、210、213、214、217或223氨基酸序列多肽被提議是HLA-A24限制性表位肽，而具有 SEQ ID N0:376、379、114、116、117、121、227、228、233、254、271、272 或 288的氨基酸序列的多肽被提議是HLA-A2限制性表位肽，其可以誘導針對表達CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB、KIF20A、KNTC2、TTK 和 / 或 URLC10 的細胞，例如表達 CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB, KIF20A、KNTC2、TTK和/或URLC10的癌細胞，的強而特異的免疫響應。預期的癌癥包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜異位、食道癌、胃癌、彌散型胃癌、肝、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤和睪丸腫瘤。因此，本發(fā)明還包括用具有SEQ ID NO: 19、22、30、34、344、358、41、44、46、48、78、376、379、80、100、101、110、111、387、112、394、114、116、117、121、395、133、135、137、426、174、178、186、194、196、202、210、213、214、217、223、227、228、233、254、271、272 或 288 的氨
基酸序列的多肽或其變體(即包含I個、2個或數(shù)個(例如最多5個)氨基酸替換、刪除或添加)誘導抗腫瘤免疫的方法。一般地，抗腫瘤免疫包括如下的免疫響應-針對含有表達CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIF20A, KNTC2, TTK 和 / 或 URLClO的細胞的腫瘤的細胞毒淋巴細胞的誘導，-可識別含有表達CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIF20A, KNTC2, TTK 和 / 或URLClO的細胞的腫瘤的抗體的誘導，和-抗腫瘤細胞因子的產(chǎn)生的誘導。 因此，當某種肽在接種到動物體內(nèi)時可誘導這些免疫響應中的任何一種時，則可以確定該肽具有誘導抗腫瘤免疫的效果。肽的抗腫瘤免疫誘導作用可以通過在體內(nèi)或體外觀察宿主免疫系統(tǒng)針對該肽的響應來檢測。例如，用于檢測細胞毒T淋巴細胞的誘導的方法是眾所周知的。進入活體的外來物質(zhì)通過抗原呈遞細胞(APC)的作用被呈遞給T細胞和B細胞。由于受抗原的刺激，以抗原特異性的方式響應由APC呈遞的抗原的T細胞分化成細胞毒T細胞(也稱作細胞毒T淋巴細胞或CTL)，然后增殖；這個過程在本文中稱作T細胞的“激活”。因此，由特定的肽所致的CTL誘導作用可以通過由APC向T細胞呈遞該肽然后檢測CTL的誘導來加以評估。而且，APC具有激活CD4+T細胞、CD8+T細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞和NK細胞的作用。因為⑶4+T細胞在抗腫瘤免疫中也是重要的，所以肽的抗腫瘤免疫誘導作用可以用這些細胞的激活效應作為指標來進行評估。使用樹突細胞(DC)作為APC用于評估CTL誘導作用的方法是本領域眾所周知的。DC是一種代表性的APC，在APC中具有最強的CTL誘導作用。在本方法中，最初使測試多肽與DC接觸，然后使該DC與T細胞接觸。在與DC接觸之后，如果檢測到具有針對目標細胞的細胞毒作用的T細胞，則顯示測試多肽具有誘導細胞毒T細胞的活性。CTL針對腫瘤的活性可以用例如51Cr標記的腫瘤細胞的裂解作為指標進行檢測。或者，眾所周知可以使用3H-胸苷攝取活性或LDH (乳糖脫氫酶)釋放作為指標來評估腫瘤細胞破壞的程度。而且，還可以通過測量在攜帶有固定化肽的抗原呈遞細胞的存在下由CTL產(chǎn)生和釋放的IFN-ga_a來進行檢查，其中利用抗IFN-ga_a抗體使IFN_ga_a可視化,例如ELISP0T測定。除了 DC，還可以使用外周血單核細胞(PBMC)作為APC。已有報道，通過在GM-CSF和IL-4的存在下培養(yǎng)PBMC可以提高CTL的誘導。類似地，已顯示通過在鑰孔戚血藍蛋白(KLH)和IL-7的存在下培養(yǎng)PBMC可以誘導CTL。通過這些方法確認具有CTL誘導活性的測試多肽是具有DC激活效應和隨后的CTL誘導活性的多肽。因此,可誘導針對表達CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB, KIF20A、KNTC2、TTK和/或URLClO的細胞的CTL的多肽可以用作針對與CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB,KIF20A、KNTC2、TTK和/或URLClO相關的疾病(例如癌癥)的疫苗。而且，通過與所述多肽接觸而獲得了誘導針對 CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB、KIF20A、KNTC2、TTK 和 / 或 URLClO的過表達相關的疾病(例如癌癥)的CTL的能力的APC，也可用作針對該疾病的疫苗。而且，由于APC呈遞多肽抗原而獲得了細胞毒性的CTL也可用作針對⑶H3、EPHA4、ECT2、HIG2、1順88、1(正2(^、謂1^2、1'1'1(和/或^1^(10相關疾病(例如癌癥)的疫苗。這些利用由APC和 CTL 導致的抗腫瘤免疫來治療 CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB, KIF20A、KNTC2、TTK 和 /或URLClO相關疾病(例如癌癥)的方法被稱作細胞免疫治療。預期的癌癥包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜異位、食道癌、胃癌、彌散型胃癌、肝、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤和睪丸腫瘤。一般地，當使用多肽進行細胞免疫治療時，通過組合多種具有不同結(jié)構(gòu)的多肽并使它們與DC接觸可以提高誘導CTL的效力。因此，當用蛋白片段刺激DC時，使用多種類型片段的混合物是有利的。多肽對抗腫瘤免疫的誘導可以進一步通過觀察針對腫瘤的抗體產(chǎn)生的誘導來加以確認。例如，當在用某種多肽免疫的實驗動物體內(nèi)誘導出針對該多肽的抗體時，并且當腫瘤細胞的生長、增殖和/或轉(zhuǎn)移被那些抗體抑制時，則可以確定該多肽可誘導抗腫瘤免疫。通過施用本發(fā)明的疫苗可以誘導抗腫瘤免疫，而抗腫瘤免疫的誘導有為治療和預防與 CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB, KIF20A、KNTC2、TTK 和 / 或 URLClO 過表達相關的疾病，例如癌癥提供了可能。針對與 CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB, KIF20A、KNTC2、TTK 和/或URLClO的過表達相關的疾病(例如癌癥)的治療或者其發(fā)生的預防可以包括抑制表達 CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB, KIF20A、KNTC2、TTK 和 / 或 URLClO 的細胞(例如癌細 胞)的生長，使這些細胞退化(involution),和抑制這些細胞(例如癌細胞)的出現(xiàn),在疾病(例如癌癥)的治療或預防還包括降低患有CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB, KIF20A、KNTC2、TTK和/或URLClO相關疾病(例如癌癥)的個體的死亡率，減少血液中的疾病標志，減輕與該疾病相伴的可檢測癥狀等。這些治療和預防效果優(yōu)選地是統(tǒng)計學顯著的，例如以5%或更低的顯著水平觀察，其中將疫苗針對與CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB, KIF20A、KNTC2、TTK和/或URLClO相關的疾病(例如癌癥)的治療或預防效果與沒有疫苗施用的對照進行比較。例如，可以使用Student’ s t_檢驗、Mann-Whitney U-檢驗或ANOVA來確定統(tǒng)計學顯著性。由于本發(fā)明提供了用于治療或預防與CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB, KIF20A、KNTC2、TTK和/或URLClO的過表達相關的疾病(例如癌癥)的方法，可以向患有疾病或具有發(fā)生該疾病的危險(或者易于發(fā)生疾病)的受試者預防性或治療性地施用治療化合物或組合物。這些受試者可以用標準的臨床方法加以鑒定。在本發(fā)明的語境中，預防性施用發(fā)生在表現(xiàn)出明顯的疾病癥狀之前，從而使疾病或疾患被防止，或者其進程被延遲。在醫(yī)學領域中，術語“預防”包括任何可減輕由疾病造成的死亡率或發(fā)病率負荷的活動。預防可以在一級、二級和三級預防水平上發(fā)生。一級預防可以避免疾病的發(fā)展，而二級和三級水平的預防包括旨在防止疾病發(fā)展和癥狀出現(xiàn)、以及通過恢復功能和減少疾病相關并發(fā)癥來減輕已經(jīng)確立的疾病的負面影響的活動。在癌癥治療中，術語“有效的”是指治療可以導致受試者體內(nèi)癌癥的大小(size)、廣泛性(prevalence)或轉(zhuǎn)移潛力降低。當預防性地進行處理時，“有效”的意思是該處理可延緩或防止癌癥的出現(xiàn)或者減輕癌癥的臨床癥狀。癌癥的評價可以用標準臨床規(guī)程進行。而且，可以結(jié)合任何用于診斷或治療癌癥的已知方法來確定治療的有效性。例如，可以通過組織病理學診斷或者通過鑒定癥狀上的異常(symptomatic anomalies)來診斷癌癥。上述具有免疫活性的肽或者編碼這樣的肽的多核苷酸或載體可以和佐劑組合。佐劑是指在與具有免疫活性的肽一起(或者順次)施用時能夠提高針對該肽的免疫響應的化合物。合適的佐劑的實例包括霍亂毒素、沙門氏菌毒素、明礬等，但并不僅限于此。而且，本發(fā)明的疫苗可以適當?shù)嘏c藥學可接受的載體組合。這些載體的實例有滅菌水、生理鹽水、磷酸鹽緩沖液、培養(yǎng)液等。而且，疫苗可以根據(jù)需要含有穩(wěn)定劑、懸浮劑、防腐劑、表面活性劑等。疫苗可以系統(tǒng)或局部給藥。疫苗施用可以是單次施用或者通過多次施用進行加強。在使用APC或CTL作為本發(fā)明的疫苗時，可以通過例如離體方法治療或預防與CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB, KIF20A、KNTC2、TTK 和 / 或 URLClO 的過表達相關的疾病(例如癌癥)。更具體地，收集接受治療或預防的受試者的PBMC，在離體條件下使之與本發(fā)明的肽接觸。在APC或CTL誘導之后，可以將細胞施用給受試者。APC還可以通過離體地將編碼該肽的載體引入到PBMC中進行誘導。體內(nèi)誘導的APC或CTL可以在施用之前被克隆。通過克隆和培養(yǎng)具有高靶細胞損傷活性的細胞，可以更有效地進行細胞免疫治療。而且，以這種方式分離的APC和CTL不僅可以用于針對細胞所來源的個體進行細胞免疫治療，還可以針對其它個體中相似類型的疾病進行細胞免疫治療。下列實施例描述了本發(fā)明的各個方面。提供這些實施例僅僅是為了舉例說明本發(fā)明并幫助普通技術人員制作和使用它們。這些實施例不以任何方式對本發(fā)明的范圍構(gòu)成限 制。盡管在實踐或測試本發(fā)明時可以使用與本文所介紹的相似或等價的方法和材料，但是下文介紹了合適的方法和材料。
實施例下文中，通過下面的實施例對本發(fā)明進行舉例說明，但本發(fā)明不受這些實施例的限制。然而，這里描述的材料和方法等僅僅是用來例證本發(fā)明的不同方面，并不意圖以任何方式對本發(fā)明的范圍構(gòu)成限制。因此，在實踐或測試本發(fā)明時可以使用與本文描述的相似或等價的材料、方法等。材料和方法細胞系A24-LCL細胞(HLA-A24)，人B成淋巴細胞系是通過用Epstain_bar病毒轉(zhuǎn)化建立的。T2 細胞，C0S7, A498, Caki-2 和 HEK 293 從 ATCC 購得。Caki-I 和 MIAPaca-2 購于 JCRB。PK-45P, PK-59, TE-5 和 TE-6 購于 TKG。293T 購于 GenHunter。CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIF20A, KNTC2, TTK 和 URLClO 衍牛肽的候詵物篩選使用結(jié)合預測軟件〃BIMAS〃 (http://bimas. dcrt. nih. gov/cgi_bin/molbio/ken_parker_comboform)(Parker KC, et al., (1994)J Immunol. ;152 (I):163-75. ;KuzushimaK, et al. , (2001) Blood. ; 98 (6) : 1872-81.)預測了衍生自 CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB、KIF20A、KNTC2、TTK 或 URLClO 的可結(jié)合 HLA_A*2402 或 HLA_A*0201 分子的 9 聚體和 10 聚體肽。這些肽由Sigma(日本札幌)根據(jù)標準固相合成方法合成，并用反相HPLC純化。肽的純度(>90%)和身份分別用分析HPLC和質(zhì)譜分析確定。肽溶解在二甲基亞砜(DMSO)中，濃度為20mg/ml，并存儲于-80攝氏度。體外CTL誘導使用單核細胞衍生的樹突細胞(DC)作為抗原呈遞細胞(APC)，誘導針對被呈遞在HLA上的肽的CTL響應。DC是根據(jù)別處介紹的方法(Nukaya I et al.，(1999) Int.J. Cancer 80, 92-7. , Tsai V et al. , (1997) J. Immunol 158:1796-802.)在體外產(chǎn)生的。簡而言之，將外周血單個核細胞(PBMC)[它們是使用Fic0Il-Paque(Pharmacia)溶液從正常志愿者(HLA-A*2402和/或HLA-A*0201)分離的]通過附著到塑料組織培養(yǎng)瓶(BectonDickinson)進行分離，從而富集單核細胞組分。將富集了單核細胞的群體在含有2%熱失活自體同源血清(AS)的 AIM-V(Invitrogen)中、在 1000U/ml GM-CSF(Genzyme)和 IOOOU/ml IL-4 (Genzyme)的存在下進行培養(yǎng)。培養(yǎng)7天后,在3 μ g/ml的β2_微球蛋白的存在下，用20 μ g/ml本發(fā)明的合成肽在20°C的AM-V中對這些細胞因子產(chǎn)生的DC沖擊4個小時。然后用MMCGOyg/mldOmin)使這些經(jīng)肽沖擊的DC失活，并將它們以1:20的比例與自體同源CD8+T細胞混合，其中自體同源CD8+T細胞是通過用Dynabeads M-450CD8 (Dynal)和DETACHa BEAD (D ynal)進行陽性篩選獲得的。將這些培養(yǎng)物置于在48孔板(Corning)中；每個孔含有I. 5xl04個經(jīng)過肽沖擊的DC，3xl05CD8+個T細胞和10ng/mlIL_7 (Genzyme)，溶于O. 5ml AIM-V/2%AS中。3天后，向這些培養(yǎng)物補充IL_2 (CHIRON)至終濃度為20IU/ml。在第7天和第14天，用經(jīng)過自體同源肽沖擊的DC再次刺激T細胞。每次通過與上述相同的方法制備DC。在第21天，經(jīng)過第3輪的肽刺激后，針對經(jīng)肽沖擊的A24-LCL細胞或T2細胞檢驗CTL。CTL擴增稈序使用與RiddellSR等所介紹的相似方法(Walter EA et al. , (1995)N Engl J Med333:1038-44. ; Riddel SR, et al. , (1996) Nature Med. 2:216-23.)在培養(yǎng)物中擴增 CTL。在40ng/ml抗-0)3單克隆抗體(Pharmingen)的存在下,將總共5xl04個CTL與已利用MMC使之失活的兩種人B成淋巴細胞系一起重新懸浮在25mlAM-V/5%AS中。開始培養(yǎng)I天之后，向培養(yǎng)物添加120IU/mlIL-2。在第5、8和11天，向培養(yǎng)物添加含有30IU/ml IL-2的新鮮AIM-V/5%ASoCTL克降的津立在96孔圓底微滴定板(Nalge Nunc International)上進行稀釋,使每孔含有O. 3個、I個、和3個CTL。在總共150 μ I/孔的含有5%AS的AIM-V中，將CTL與7xl04個細胞/孔的兩種人B成淋巴細胞系、30ng/ml的抗-⑶3抗體和125U/ml的IL-2共培養(yǎng)。10天后，向培養(yǎng)基添加50微升/孔的IL-2，使IL-2的終濃度為125U/ml。在第14天，對CTL的CTL活性進行檢驗，用和上述相同的方法進行CTL克隆的擴增。特異CTL活件為了檢驗特異CTL 活性，進行了 IFN-gamma ELI SPOT 測定和 IFN-gamma ELISA 測定。簡而言之，制備了經(jīng)肽沖擊的A24-LCL或T2細胞(IxlO4個/孔)作為刺激細胞。將在48孔板中培養(yǎng)后的細胞或經(jīng)過有限稀釋后的CTL克隆作為響應細胞。IFN-gamma ELI SPOT測定和ELISA測定按照制造商的程序進行。強制表汰靶基因和HLA-A02或HLA-A24中之一或二者的細胞的津立通過PCR擴增編碼靶基因或HLA-A02或HLA-A24的開放閱讀框的cDNA。將該PCR擴增產(chǎn)物克隆到 pcDNA3. Imyc-His 載體(Invitrogen)中。用 LlPOFECTAMINE(Invitrogen)根據(jù)制造商推薦的程序?qū)⑦@些質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進入沒有靶基因、HLA-A02和HLA-A24的正常人細胞系C0S7或293T中。或者，利用GenePulserII (Biorad)通過電穿孔將含有靶基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進入A24-LCL中。簡而言之，在140V和1000 μ F下，用IOmcg質(zhì)粒沖擊2. 5χ106個A24-LCL細胞。轉(zhuǎn)染2天后，用細胞裂解液處理被轉(zhuǎn)染的細胞，并用作CTL活性測定的靶細胞。細胞毒測定通過4小時51Cr釋放測定評估細胞毒活性。用濃度為20 μ g/mL的肽過夜沖擊靶細胞。在37°C用100 μ Ci的Na251CrO4標記靶細胞I小時，然后用RPMI1640沖洗3次。將靶細胞(IxlO4個/100 μ L)和100 μ L的不同數(shù)目的效應細胞置于圓底96孔微滴定板(Corning)中，總體積為200 μ L，在37°C CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時。培養(yǎng)后，從每孔收集100微升上清，用gamma計數(shù)器測量放射性。自發(fā)釋放是指在沒有效應細胞時培養(yǎng)基中的靶細胞的放射性，最大釋放是用IM HCl處理情況下的靶細胞的放射性。百分比特異放射性是根據(jù)如下的公式計算確定的
%特異性溶解=[(實驗釋放-自發(fā)釋放)/(最大釋放-自發(fā)釋放)]xl00。結(jié)果癌癥中被提高的CDH3, EPHA4. ECT2. HIG2. INHBB. KIF20A. KNTC2. TTK 和 URLClO 的用cDNA-微陣列從各種癌癥中獲得的全基因表達譜數(shù)據(jù)顯示，如下基因的表達被提聞。CDH3 (GenBank 登錄號 NM_001793; SEQ ID Nos. I, 2)，EPHA4 (GenBank 登錄號 L36645; SEQ ID Nos. 3，4)，ECT2 (GenBank 登錄號 AY376439; SEQ ID Nos. 5，6)，HIG2 (GenBank 登錄號 NM_013332; SEQ ID Nos. 7,8)，INHBB (GenBank 登錄號 NM_002193; SEQ ID Nos. 9，10)，KIF20A (GenBank 登錄號 NM_005733; SEQ ID Nos. 11,12)，KNTC2 (GenBank 登錄號 AF017790; SEQ ID Nos. 13，14)，TTK (GenBank 登錄號 NM_003318; SEQ ID Nos. 15，16)和URLClO (GenBank 登錄號 NM_017527; SEQ ID Nos. 17，18)與相應的正常組織相比，⑶H3的表達在如下的癌癥中確實被提高。34例膀胱癌中的26例，19例宮頸癌中的17例，19例膽管細胞癌中的19例，34例結(jié)直腸癌中的30例，21例子宮內(nèi)膜異位中的20例，20例胃癌中的13例，8例彌散型胃癌中的7例，37 例 NSCLC 中的 36 例，16例胰腺癌中的16例，21例軟組織腫瘤中的21例，和10例睪丸腫瘤中的10例。與相應的正常組織相比，EPHA4的表達在如下的癌癥中確實被提高。34例膀胱癌中的14例，14例宮頸癌中的8例，
25例膽管細胞癌中的10例、15例子宮內(nèi)膜異位中的5例，8例彌散型胃癌中的5例，5例卵巢癌中的5例，
14例胰腺癌中的14例，51例前列腺癌中的20例，和23例軟組織腫瘤中的14例。與相應的正常組織相比，ECT2的表達在如下的癌癥中確實被提高。19例膀胱癌中的17例，21例乳腺癌中的5例，14例宮頸癌中的14例，13例膽管細胞癌中的13例，5例CML中的5例，8例結(jié)直腸癌中的7例，16例食道癌中的12例，16 例 NSCLC 中的 6 例，IO例淋巴瘤中的8例，I例胰腺癌中的I例，13例前列腺癌中的IO例，6例腎癌中的3例，和13例SCLC癌腫的12例。與相應的正常組織相比，HIG2的表達在20例腎癌中的19例，和9例軟組織腫瘤中的7例中確實被提高。與相應的正常組織相比，INHBB的表達在如下癌癥中確實被提高。21例膽管細胞癌中的10例，12例食道癌中的12例，13 例 NSCLC 中的 10 例，24例腎癌中的22例，14例SCLC癌腫的8例，和49例軟組織腫瘤中的45例。與相應的正常組織相比，KIF20A的表達在如下癌癥中確實被提高。31例膀胱癌中的31例，61例乳腺癌中的38例，11例膽管細胞癌中的10例，19例食道癌中的7例，22 例 NSCLC 中的 21 例，6例卵巢癌中的6例，36例前列腺癌中的17例，11例腎癌中的6例，和
15 例 SCLC 中的 15 例。與相應的正常組織相比，KNTC2的表達在如下癌癥中確實被提高。32例膀胱癌中的30例，56例乳腺癌中的47例，10例宮頸癌中的10例，22例膽管細胞癌中的16例，37 例 CML 中的 17 例，10例結(jié)直腸癌中的3例， 46例食道癌中的11例，19 例 NSCLC 中的 15 例，8例淋巴瘤中的7例，24例骨肉瘤中的20例，5例卵巢癌中的3例，2例胰腺癌中的2例，37例前列腺癌中的15例，19例腎癌中的14例，15例SCLC中的15例，和59例軟組織腫瘤中的40例。與相應的正常組織相比，TTK的表達在如下癌癥中確實被提高。27例膀胱癌中的27例，30例乳腺癌中的25例，16例宮頸癌中的15例，10例膽管細胞癌中的10例，7例CML中的5例，10例結(jié)直腸癌中的6例，44例食道癌中的24例，15例肝癌中的8例，12 例 NSCLC 中的 12 例，6例淋巴瘤中的6例，16例骨肉瘤中的13例，17例前列腺癌中的12例，15例SCLC中的15例，和33例軟組織腫瘤中的16例。與相應的正常組織相比，URLClO的表達在如下癌癥中確實被提高。29例膀胱癌中的29例，16例宮頸癌中的15例，7例膽管細胞癌中的7例，19例食道癌中的7例，3例胃癌中的3例，
27 例 NSCLC 中的 24 例，19例骨肉瘤中的15例，5例胰腺癌中的4例，43例軟組織腫瘤中的33例。
[表I]與相應的正常組織相比，在癌組織中觀察到的CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、
INHBB, KIF20A、KNTC2、TTK或URLClO被上調(diào)的病例的比率
_ CDH3 EPHA4 ECT2 HIG2 INHBB
膀貌癌~~2&34 14/34 117/19 丨 -■
乳腺癌:— -—5/12 - ~ -
￥1 癌 ... ................................~7/19 8/14 14/14 --
膽管細胞癌.........19/19—'—"mi25~ 13/13 — - 10/21"
CML- 5/5 <*-
Ikimi——— ~1θ/34~ ' - .................7/8 -—
子宮內(nèi)暖異位..................20/21 5/15 ~~ --
食道癌........~~-~ - 12/16.......................-..........~~........12/12
W#. . ~ 13/20 - -—. ......-...............-—彌散在!宵癌_____________7/8__________________________.................- ___________________-__________一
H'f"麗—■.垂—
非小細胸■肺癌..........................................................................................36/3~ ——■-............................6/16.........................-..........................10/13
..................— - ...... -.......~......8/1:0........ - .........................-................
骨肉瘤__-__-__--__-
#l-#s....................................— - 5/5 -................ -
~ Μβ~......14/14............ 1/1 - ~ -
前列線癌.-__________ 20/51____________'10/13 - —_________________________________-_______________________
腎癌 _.......................-____~ ____________________-______________________________ 3/6 19/20—______________22/24_____
胞肺癌......................................................................—-- 12/13 - 8/14
HIr 腫瘤..........................................................~τ ηΓ 14/23 -..................7/9— 4 獅
睪丸 Bt 瘤__10/10 -__-__-__-
KIF20A K3yrC2 TTK URLC1Q
Il貌癌 ..............................________31/3Γ]—30/32 127/271 29/2F"
Illii................................................................................................................................................Μ6Γ 47/56 25B0 .................-...........—
宮賴癌'- IWlF'15/16—15/16—'
膽管 _胞H—10/11 "" 16/22 ~10/ 0 ^^/7^
Q-1L·-.一- 17/37 5/7 -—
直腸癌 ......................................................:——3/10 6/10 -—
子宮內(nèi)1 異位-__-__--
jrit#—— ........ ~7/19 11/46— 24/44^—...7/19~
胃癌__；____-__3/3
彌散4!胃癌---
—―奸癌........................................... — - ~-~ 8/15 一…-
~非小細胸肺癌 .............................21/22— ~ 57 9" 12/12 ~24/27
淋巴癌I 7/8 6/6 -
骨肉瘤 ........................................................................................................................................................-20/24 13/16 15/19~
薇癌署·__3/5__二__"
ft腺癌6/6—_——.瓦―4/5 哪
IF列線癌15/37____________12/17_________________________________^______~—
腎 M6/11 14/19__--
小細fe難癌^ ^isns ——ImT isns —-
軟組織胂瘤__- 40/59 16/33 33/43
睪九腫瘤__:__二__-__~
衍牛自CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB、KIF20A、KNTC2、TTK 或 URLClO 的 HLA-A24或HLA-A2結(jié)合肽的預測表2按照結(jié)合親和性順序給出了⑶H3的HLA_A*2402結(jié)合肽。表2A給出了衍生自⑶H3的9聚體，表2B給出了衍生自⑶H3的10聚體。表3按照結(jié)合親和性順序給出了 EPHA4的HLA_A*2402結(jié)合肽和HLA_A*0201結(jié)合肽。表3A給出了衍生自EPHA4的9聚體的HLA_A*2402結(jié)合肽，表3B顯示了衍生自EPHA4的10聚體的HLA-A*2402結(jié)合肽。表3C顯示了衍生自EPHA4的9聚體的HLA_A*0201結(jié)合肽。表4按照結(jié)合親和性順序給出了 ECT2的HLA_A*2402結(jié)合肽。表4A給出了衍生自ECT2的9聚體肽，表4B顯示了衍生自ECT2的10聚體肽。
表5給出了 HIG2的HLA_A*2402結(jié)合肽和HLA_A*0201結(jié)合肽。表5A給出了衍生自HIG2的9聚體HLA-A*2402結(jié)合肽，表5B給出了衍生自HIG2的10聚體HLA_A*2402結(jié)合肽，表5C顯示了衍生自HIG2的9聚體HLA-A*0201結(jié)合肽，表顯示了衍生自HIG2的10聚體HLA-A*0201結(jié)合肽。表6給出了 INHBB的HLA_A*2402結(jié)合肽和HLA_A*0201結(jié)合肽。表6A顯示了衍生自INHBB的9聚體HLA-A*2402結(jié)合肽，表6B給出了衍生自INHBB的10聚體HLA_A*2402結(jié)合肽，表6C顯示了衍生自INHBB的9聚體HLA-A*0201結(jié)合肽，表6D顯示了衍生自INHBB的10聚體HLA-A*0201結(jié)合肽。表7按照結(jié)合親和性順序給出了 KIF20A的HLA_A*2402結(jié)合肽。表7A給出了衍生自KIF20A的9聚體肽，表7B顯示了衍生自KIF20A的10聚體肽。表8按照結(jié)合親和性順序給出了 KNTC2的HLA_A*2402結(jié)合肽。表8A給出了衍生自KNTC2的9聚體肽，表8B給出了衍生自KNTC2的10聚體肽。表9按照結(jié)合親和性順序給出了 TTK的HLA_A*0201結(jié)合肽。表9A給出了衍生自TTK的9聚體肽，表9B給出了衍生自TTK的10聚體肽。表10按照結(jié)合親和性順序給出了 URLClO的HLA_A*0201結(jié)合肽。表IOA給出了衍生自URLClO的9聚體肽，表IOB給出了衍生自URLClO的10聚體肽。關于表中術語的解釋和定義起始位置(Start position),是指從N端起算的氨基酸編號。結(jié)合得分(Binding score),來源于“材料和方法”中介紹的〃BIMAS〃。陽性供體數(shù)(Positive donor number),是指其Q)8+_T細胞可以通過用抗原呈遞細胞的離體刺激被誘導成為特異CTL的供體的數(shù)目。這表示為(陽性供體數(shù)/全部供體數(shù))。陽性孔數(shù)(Positivewell number),是指通過 IFN-gamma ELISP0T 測定可以檢測出特異IFN-ga_a產(chǎn)生的孔的數(shù)目。從一個供體可以制備4_8個孔。這顯示為(陽性孔數(shù)/IFN-gamma ELI SPOT測定所檢測的孔數(shù))。陽性CTL系，是指從陽性孔建立的CTL系的數(shù)目。CTL的產(chǎn)生通過ELISA確定。這顯示為(已建立的CTL系數(shù)/IFN-gamma ELISP0T測定檢測的陽性孔數(shù))。無陽性供體，不是指沒有可檢測的陽性孔，而是指沒有建成的CTL系。表中用粗體字顯示的肽具有T細胞刺激活性。
在陽性供體編號、陽性孔編號和陽性CTL系中用表示無數(shù)據(jù)，意思是出于任何原因?qū)е逻@些肽不能被合成。[表2A-1]衍生自CDH3的HLA_A*2402結(jié)合9聚體肽
權利要求
1.ー種少于大約15個氨基酸的分離的肽，其選自由包含SEQ ID N0:19、22、30、34、344、358、41、44、46、48、78、80、100、101、110、111、387、112、394、395、133、135、137、426、174、178、186、194、196、202、210、213、214、217或223的氨基酸序列的肽所組成的群組。
2.ー種具有細胞毒T細胞誘導能力的肽，其中所述肽包含選自SEQ IDN0:19、22、30、34、344、358、41、44、46、48、78、80、100、101、110、111、387、112、394、395、133、135、137、426、174、178、186、194、196、202、210、213、214、217或223的氨基酸序列，其中替換、刪除或添加了 I個、2個或數(shù)個氨基酸。
3.權利要求2的肽，其中自N端起的第二個氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸或色氨酸。
4.權利要求2或3的肽，其中C端氨基酸是苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸。
5.ー種少于大約15個氨基酸的分離的肽，其選自由包含SEQ ID N0:376、379、114、116、117、121、227、228、233、254、271、272或288的氨基酸序列的肽所組成的群組。
6.ー種具有細胞毒T細胞誘導能力的肽，其中所述肽包含選自SEQ IDN0:376、379、114、116、117、121、227、228、233、254、271、272或288的氨基酸序列，其中替換、刪除或添加了 I個、2個或數(shù)個氨基酸。
7.權利要求6的肽，其中自N端起的第二個氨基酸是亮氨酸或甲硫氨酸。
8.權利要求6或7的肽，其中C端氨基酸是纈氨酸或亮氨酸。
9.一種用于治療或預防與SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15和/或17的基因的過表達相關的疾病的藥物組合物，所述組合物包含權利要求1-8的一種或多種肽或編碼所述肽的多核苷酸。
10.權利要求9的藥物組合物，其中與SEQID ΝΟ:1、3、5、7、9、11、13、15和/或17的基因相關的疾病包括癌癥。
11.權利要求10的藥物組合物，其中所述癌癥包括膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜異位、食道癌、胃癌、彌散型胃癌、肝、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤和睪丸腫瘤。
12.—種外來體，該外來體在其表面上呈遞包含權利要求1-4的肽和HLA抗原的復合體。
13.權利要求12的外來體，其中該HLA抗原是HLA-A24。
14.權利要求13的外來體，其中該HLA抗原是HLA-A2402。
15.—種外來體,該外來體在其表面上呈遞包含權利要求5-8的肽和HLA抗原的復合體。
16.權利要求15的外來體，其中該HLA抗原是HLA-A2。
17.權利要求16的外來體，其中該HLA抗原是HLA-A0201。
18.一種誘導具有高的細胞毒T細胞誘導能力的抗原呈遞細胞的方法，包括使抗原呈遞細胞與權利要求1-8的肽相接觸的步驟。
19.通過使T細胞與權利要求1-8的肽接觸來誘導細胞毒T細胞的方法。
20.一種誘導具有高的細胞毒T細胞誘導能力的抗原呈遞細胞的方法，所述方法包括將包含編碼權利要求1-8的肽的多核苷酸的基因轉(zhuǎn)移至抗原呈遞細胞的步驟。
21.一種分離的細胞毒T細胞，其通過使T細胞與權利要求1-8的肽接觸而被誘導，或者被編碼TCR亞單位多肽的核酸轉(zhuǎn)導，其中所述TCR亞單位多肽在HLA-A24或HLA-A2的背景下與權利要求1-8中任ー項的肽結(jié)合。
22.ー種抗原呈遞細胞，其包含HLA抗原與權利要求1-8的肽之間形成的復合體。
23.通過權利要求18-20的方法誘導的抗原呈遞細胞。
24.一種用于抑制表達SEQ ID ΝΟ:1、3、5、7、9、11、13、15和/或17的基因的細胞的增殖的疫苗，其中該疫苗包含權利要求1-8的肽作為活性成分。
25.權利要求24的疫苗，其中表達SEQID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15和/或17的基因的細胞包括癌癥。
26.權利要求25的疫苗，其中所述癌癥包括膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜異位、食道癌、胃癌、彌散型胃癌、肝、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巣癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤和睪丸腫瘤。
27.權利要求26的疫苗，其被配制用于施用給HLA抗原為HLA-A24或HLA-A2的受試者。
28.一種治療或預防受試者中與SEQ ID ΝΟ:1、3、5、7、9、11、13、15和/或17的基因的過表達相關疾病的方法，包括向所述受試者施用疫苗，該疫苗包含權利要求1-8的肽、其免疫學活性片段、或編碼所述肽或免疫學活性片段的多核苷酸。
29.權利要求28的方法，其中與SEQID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15和/或17的基因的過表達相關的疾病包括癌癥。
30.權利要求29的用于治療或預防癌癥的方法，其中癌細胞包括膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜異位、食道癌、胃癌、彌散型胃癌、肝、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巣癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤和睪丸腫瘤。
31.一種用于篩選有I個、2個或數(shù)個氨基酸被替換的肽的方法，其中所述肽包括選自SEQ ID N0:19、22、30、34、344、358、41、44、46、48、78、80、100、101、110、lll、387、112、394、395、133、135、137、426、174、178、186、194、196、202、210、213、214、217 或 223 的氨基酸序列，所述方法包括如下步驟 (a)確認對于I個、2個或數(shù)個氨基酸的替換物的整個序列沒有顯著的序列同源性； (b)測量候選替換物肽的CTL誘導能力；和 (c)選擇CTL誘導能力等于或高于原始肽的肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于表達腫瘤相關抗原的癌癥的肽疫苗。本發(fā)明提供具有如SEQ ID NO:19、22、30、34、344、358、41、44、46、48、78、376、379、80、100、101、110、111、387、112、394、114、116、117、121、395、133、135、137、426、174、178、186、194、196、202、210、213、214、217、223、227、228、233、254、271、272或288所示的氨基酸序列的肽，以及具有上述氨基酸序列并且其中替換、刪除或添加了1個、2個或多個(例如最多5個)氨基酸的肽，這些肽具有細胞毒T細胞誘導能力。本發(fā)明還提供了用于治療或預防與CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB、KIF20A、KNTC2、TTK和/或URLC10的過表達相關的疾病(例如癌癥)的藥物，其含有一種或多種這樣的肽作為活性成分。本發(fā)明的肽還可以用作疫苗。
文檔編號C12N5/10GK102863514SQ20121035262
公開日2013年1月9日 申請日期2008年2月21日 優(yōu)先權日2007年2月21日
發(fā)明者角田卓也, 大澤龍司 申請人:腫瘤療法科學股份有限公司