專利名稱：一個簇毛麥6vs染色體特異的分子標記6vs-ut及其用途的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及分子生物學和遺傳育種科學技術(shù)領域，具體涉及一個特異追蹤簇毛麥6VS染色體的分子標記及其用法。·
背景技術(shù)：
小麥是全球三大糧食作物之一，也是我國總產(chǎn)第一的糧食作物，是保障我國糧食安全的重要決定因素之一。小麥在其生育進程中常會受到生物或非生物脅迫的影響。小麥白粉病是一種世界性小麥病害，近年來隨著我國農(nóng)田水利設施改善和水肥條件提高，其危害逐年加重。通過遠緣雜交和染色體工程技術(shù)手段育成的小麥-簇毛麥T6AL. 6VS易位系對目前已發(fā)現(xiàn)的白粉病生理小種均表現(xiàn)高抗或免疫，其抗白粉病基因Pm21位于簇毛麥6V染色體短臂上(6VS)，是目前對小麥白粉病抗譜最廣、抗性最強的基因(見參考文獻ChenPD, Qi LL, Zhou B，Zhang SZ, Liu DJ. Development and molecular cytogenetic analysisof wheat-Haynaldia villosa 6VS/6AL translocation lines specifying resistance topowdery mildew. Theor Appl Genet, 1995，91 (6-7) : 1125-1128)。近年來 T6AL. 6VS 易位系在小麥抗白粉病新品種選育中得到廣泛利用，目前已育成20多個抗白粉病小麥新品種，推廣面積超過5000萬畝。T6AL. 6VS易位系是在普通小麥遺傳背景中由簇毛麥6V染色體短臂(6VS)替換了普通小麥6A染色體的短臂(6AS)，從而形成T6AL. 6VS易位染色體。由于簇毛麥與普通小麥親緣關(guān)系較遠，導致二者不發(fā)生染色體重組，T6AL. 6VS易位染色體始終以易位的形式出現(xiàn)在后代中。目前，未發(fā)現(xiàn)利用T6AL.6VS易位系培育的新品種或新品系中出現(xiàn)染色體易位形式的改變。因此，簇毛麥6VS控制的性狀及其載有的DNA序列均以協(xié)同傳遞的方式出現(xiàn)在后代中。目前，部分研究已公布了部分與6VS上抗白粉病基因Pm21連鎖的相關(guān)分子標記OPTni徹、0PT1719QQ、SCAR1400, SCAR1265, NAU/XiBaol5902 和 NAU/XiBaol61586。但是，總體而言，這些標記在標記輔助選擇育種中都存在不穩(wěn)定的缺點，一個原因是由標記類型決定的，如RAPD標記0PT1714QQ和0PT1719QQ ;其次是由于標記序列過長(大多接近或超過1000bp)、PCR反應體系和反應條件要求苛刻，PCR結(jié)果可重復性差造成的。這些缺點均不利于標記輔助選擇技術(shù)在小麥育種實踐中的應用。EST (expressed sequence tag,表達序列標簽)是指從植物不同組織來源的cDNA文庫中隨機挑選克隆，對其5’和3’端進行測序獲得的短cDNA序列。EST-STS(sequence-tagged site, STS)標記是直接依據(jù)已經(jīng)定位于基因組物理圖上的EST序列設計引物，對基因組或者cDNA進行擴增，從中尋找與目的基因連鎖或具有染色體特異性的EST標記。由于EST-STS標記直接來源于表達基因序列，保守性較高，特別有利于界定物種之間的差異。因此，基于比較基因組學原理，利用與小麥親緣關(guān)系較近的短柄草的基因組序列信息，可以開發(fā)普通小麥親緣物種簇毛麥特定染色體的特異性EST-STS分子標記。本發(fā)明就是基于上述思想指導下，利用比較基因組學原理，根據(jù)可電子定位于短柄草3號染色體短臂的小麥族作物EST序列設計以PCR技術(shù)為基礎的EST-STS標記，篩選簇毛麥6V染色體短臂(6VS)特異性分子標記，用于快速檢測和追蹤普通小麥遺傳背景中T6AL. 6VS易位染色體及其控制的抗白粉病性狀，為小麥抗白粉病分子標記輔助選擇育種提供新型、實用、高效的分子標記。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種特異追蹤簇毛麥6VS染色體的分子標記及其用法，它利用比較基因組學原理，根據(jù)可電子定位于短柄草3號染色體短臂的小麥EST序列，設計以PCR技術(shù)為基礎的EST-STS標記引物。由于聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨率有限，所用親本材料的PCR擴增產(chǎn)物雖然實際長度不同，但在電泳過程中卻顯示出相似的遷移率。對此，本發(fā)明對PCR產(chǎn)物進行克隆和測序，進而重新設計特異性引物，篩選簇毛麥6VS染色體特異性分子標記，為抗白粉病小麥-簇毛麥T6AL. 6VS易位系在小麥抗白粉病新品種培育中的應用提供一種新型、實用、高效的分子標記輔助選擇技術(shù)。
為了解決背景技術(shù)所存在的問題，本發(fā)明是采用以下技術(shù)方案根據(jù)可電子定位于短柄草3號染色體短臂的小麥EST序列BE445603設計引物，從簇毛麥及普通小麥基因組中擴增對應的DNA片段，經(jīng)克隆和測序后，針對DNA片段中長度差異較大的區(qū)域進一步設計標記引物，該標記引物擴增出的一段301bp的DNA條帶位于簇毛麥6VS染色體，可以特異地追蹤6VS染色體及其控制的抗小麥白粉病性狀，標記引物序列為6VS-UTF :5，-GAAGACTGGTAGCGATGCAGTCA-3’(SEQ ID NO. 5)，6VS-UTR :5’ -AGAACAGATACACCTCCACTGACCA-3’(SEQ ID NO. 6)。本發(fā)明還公開了所述的簇毛麥6VS染色體特異的分子標記6VS-UT在追蹤小麥-簇毛麥T6AL. 6VS易位染色體中的用途。用所述的簇毛麥6VS染色體特異的分子標記6VS-UT追蹤小麥-簇毛麥T6AL. 6VS易位染色的方法，是用該分子標記引物對待測材料進行PCR擴增，擴增出301bp條帶的材料，為含有小麥-簇毛麥T6AL. 6VS易位染色體的材料。本發(fā)明所述分子標記的具體用法為(I)PCR反應體系10ii L反應體系中含約10 20ng模板DNA，lXPCRbuffer，
I.5mmol L-1MgCl2^OOmmol rMNTP，兩條引物終濃度各為 0. 2iimol L_1,0. 5UTaq DNA 聚合酶，用無菌蒸懼水補充反應體系至10 ii L ;(2) PCR反應程序94°C預變性3分鐘；94°C變性20秒，60°C退火30秒，72°C延伸30秒，32個循環(huán)；72°C延伸5分鐘；4°C保存；(3)PCR產(chǎn)物檢測PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，用銀染法染色。本發(fā)明在利用T6AL. 6VS易位系為親本進行抗白粉病性狀的追蹤時，凡是擴增出301bp條帶的材料，都含有小麥-簇毛麥T6AL. 6VS易位染色體，并對白粉病表現(xiàn)高抗；凡是不能擴增出301bp條帶的材料，都不具有T6AL. 6VS易位染色體，相應丟失由6VS染色體控制的白粉病抗性。本發(fā)明具有以下有益效果I、本發(fā)明的分子標記6VS-UT在鑒定簇毛麥6VS染色體時特異性強已開發(fā)的分子標記0PT1714(i(i和0PT1719(KI都非6VS特異性標記，只有在親本間存在與6VS的多態(tài)性時，才可以利用，而使用6VS-UT時，無論涉及何種親本，只要出現(xiàn)301bp條帶，就可以確定材料中含有6VS染色體。2、本發(fā)明的6VS染色體特異性EST-STS標記相較SCAR標記更易于識別PCR擴增失敗導致的“假陰性”:本發(fā)明的標記為共顯性標記，在普通小麥遺傳背景中，無論是否具有T6AL. 6VS易位染色體，都可以擴增出兩條背景條帶，可用于判斷PCR擴增是否成功，排除“假陰性”。3、本發(fā)明的分子標記穩(wěn)定性好，容易為育種實踐利用本發(fā)明的標記由于目標條帶較短，僅301bp，PCR擴增時對DNA模板質(zhì)量的要求不高，在部分降解的DNA模板中仍能有效擴增出目標產(chǎn)物，且目標產(chǎn)物呈現(xiàn)為強帶，易于判斷，有利于提高標記輔助選擇的效率。


圖I :序列比對結(jié)果。UT-HV :簇毛麥中的序列；UT_TA :普通小麥中的序列。箭頭所示為重新設計的引物位置。圖2 M DNA marker DL2000 ；1 :簇毛麥；2 :普通小麥；3 :小麥-簇毛麥易位系T6AL. 6VS ；R :分離群體中的抗病材料；S :分離群體中的感病材料。箭頭所示為301bp的特異性條帶。
具體實施例方式本發(fā)明具體實施方式
采用以下技術(shù)方案根據(jù)可電子定位于短柄草3號染色體短臂的小麥EST序列BE445603設計引物，從簇毛麥及普通小麥基因組中擴增對應的DNA片段，經(jīng)克隆和測序后，針對DNA片段中長度差異較大的區(qū)域進一步設計標記引物，該標記引物擴增出的一段301bp的DNA條帶，該條帶位于簇毛麥6VS染色體，可以特異地追蹤6VS染色體及其控制的抗小麥白粉病性狀。實施例I、引物的設計選擇短柄草3號染色體短臂上的保守基因，在NCBI或Graingenes數(shù)據(jù)庫中進行BLAST分析,檢索到小麥EST序列BE445603,用Primer Premier 5. 0軟件設計引物，引物序列為UT-Pl :5’ -CCAAATGAAGCGTATTGTGCTTG-3’ (SEQ ID NO. I),UT-P2 :5’ -GTAGATGGTCTGATCAAATTCTTCTGGT-3’(SEQ ID NO. 2)。2、簇毛麥6VS染色體特異性EST-STS標記的篩選(I)PCR擴增以簇毛麥、普通小麥、小麥-簇毛麥易位系T6AL. 6VS為材料(均為公知公用種質(zhì)材料，由南京農(nóng)業(yè)大學細胞遺傳研究所提供)，提取基因組DNA后進行PCR擴增，IOu L PCR反應體系中含約 10 20ng模板DNA，I XPCRbuffer，I. 5mmol L_lMgC12，200mmolL-ldNTP，兩條引物終濃度各為0. 2iimolL-l，0. 5U Taq DNA聚合酶，用無菌蒸餾水補充反應體系至10 ii L ；PCR反應程序為94°C預變性3分鐘；94°C變性20秒，60°C退火30秒，72°C延伸30秒，32個循環(huán)；72°C延伸5分鐘；4°C保存。(2) PCR產(chǎn)物的檢測PCR擴增產(chǎn)物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠(29:1)上進行電泳分離，采用銀染法染色。(3)PCR產(chǎn)物的克隆與測序由于簇毛麥、普通小麥的PCR產(chǎn)物具有相似的遷移率，所以回收各自的PCR產(chǎn)物后，分別與pMD18-T (TAKARA公司)連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞后，篩選出陽性克隆進行測序。簇毛麥的PCR產(chǎn)物為917bp (SEQ ID NO. 3)，普通小麥的PCR產(chǎn)物為901bp (SEQ ID NO. 4)。對兩條序列進行比對分析，進而重新設計一對引物(見圖I):6VS-UTF :5， -CCAGGAGGGCCTCCAGGA-3’ (SEQ ID NO. 5),6VS-UTR :5’ -CTGGGAGCTCCTGCTGCGT-3’ (SEQ ID NO. 6)。(4)多態(tài)性標記的確定以重新設計的引物，按上述方法進行PCR及電泳檢測，篩選到一個簇毛麥6VS染色體特異的分子標記6VS-UT，以該標記引物進行PCR擴增，能在普通小麥中擴增到兩個背景條帶，在簇毛麥中擴增到一條301bp的DNA條帶，而在小麥-簇毛麥易位系T6AL. 6VS中，既能擴增到兩個背景條帶，也能擴增到一條301bp條帶(見圖2中f 3)，表明301bp條帶可定位于簇毛麥6VS染色體，因此，分子標記6VS-UT能在小麥背景中特異性追蹤簇毛麥6VS染色體。3、簇毛麥6VS染色體特異性標記6VS-UT在分子標記輔助選擇育種中的應用利用篩選到的簇毛麥6VS染色體特異性標記引物6VS-UT，對寧麥9號(公知公用，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院培育)與抗白粉病T6AL. 6VS易位系(公知公用，由南京農(nóng)業(yè)大學細胞遺傳研究所創(chuàng)制并提供)雜交組合的分離群體進行鑒定，結(jié)合白粉病抗性鑒定，結(jié)果顯示在所有供試材料中，凡具有301bp條帶的材料,都表現(xiàn)高抗白粉?。环踩笔?01bp條帶的材料都表現(xiàn)高感白粉病(見圖2中R或S)。該結(jié)果表明，本發(fā)明開發(fā)的EST-STS標記6VS-UT能有效追蹤小麥背景中的簇毛麥6VS染色體，在分子標記輔助選擇育種中具有潛在的應用價值。
權(quán)利要求
1.一個簇毛麥6VS染色體特異的分子標記6VS-UT，其特征在于該分子標記引物的具體序列為6VS-UTF :5’ -GAAGACTGGTAGCGATGCAGTCA-3’，6VS-UTR :5’ -AGAACAGATACACCTCCACTGACCA-3’。
2.權(quán)利要求I所述的簇毛麥6VS染色體特異的分子標記6VS-UT在追蹤小麥-簇毛麥T6AL. 6VS易位染色體中的用途。
3.一種用權(quán)利要求I所述的簇毛麥6VS染色體特異的分子標記6VS-UT追蹤小麥-簇毛麥T6AL. 6VS易位染色的方法，是用該分子標記引物對待測材料進行PCR擴增，擴增出301bp條帶的材料，為含有小麥-簇毛麥T6AL. 6VS易位染色體的材料。
全文摘要
本發(fā)明公開了一個特異追蹤簇毛麥6VS染色體的分子標記6VS-UT及其用法，它涉及分子生物學和遺傳育種科學技術(shù)領域。本發(fā)明根據(jù)可電子定位于短柄草3號染色體短臂的小麥EST序列BE445603設計引物，從簇毛麥與普通小麥基因組中擴增并克隆對應的DNA，在測序的基礎上進一步設計特異性分子標記引物，具體序列為SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示，以標記引物進行PCR時能擴增出一條301bp的特異性DNA條帶，能快速有效地追蹤簇毛麥6VS染色體及其控制的抗小麥白粉病性狀，在小麥抗白粉病分子標記輔助選擇育種中具有較強的實用價值。
文檔編號C12N15/11GK102851281SQ20121035369
公開日2013年1月2日 申請日期2012年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月20日
發(fā)明者何華綱, 朱姍穎, 別同德, 霍金金, 李晶晶 申請人:江蘇大學