一種與斑點(diǎn)叉尾鮰快速生長(zhǎng)相關(guān)的單倍型snp分子標(biāo)記及其檢測(cè)方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明專利屬于水產(chǎn)動(dòng)物分子標(biāo)記輔助育種領(lǐng)域，具體涉及一種與斑點(diǎn)叉尾鮰快速生長(zhǎng)相關(guān)的單倍型SNP分子標(biāo)記及其檢測(cè)方法和應(yīng)用。所述的SNP分子標(biāo)記從斑點(diǎn)叉尾鮰PRL基因克隆得到，該分子標(biāo)記的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。本發(fā)明還公布了上述分子標(biāo)記在斑點(diǎn)叉尾鮰生長(zhǎng)性狀分子檢測(cè)中的應(yīng)用。篩選基因型分別為AA、CC、TT、CC、AA的個(gè)體，即單倍型組合為H3/H3(ACTCA/ACTCA)的個(gè)體作為選育親本。本發(fā)明的方法，操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快，大大降低了斑點(diǎn)叉尾鮰親本篩選的盲目性，可以快速獲得生長(zhǎng)速度快且遺傳穩(wěn)定的斑點(diǎn)叉尾鮰親本。
【專利說(shuō)明】
一種與斑點(diǎn)叉尾鮰快速生長(zhǎng)相關(guān)的單倍型SNP分子標(biāo)記及其 檢測(cè)方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明專利屬于水產(chǎn)動(dòng)物分子標(biāo)記輔助育種領(lǐng)域，具體涉及一種與斑點(diǎn)叉尾鮰快 速生長(zhǎng)相關(guān)的單倍型SNP分子標(biāo)記及其檢測(cè)方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 斑點(diǎn)叉尾鮰（Ictalures punctatus)原產(chǎn)于美國(guó)，是一種重要的水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)物種， 1984年引入我國(guó)，具有肉質(zhì)細(xì)膩、適溫范圍廣、生長(zhǎng)速度快、抗病能力強(qiáng)等特點(diǎn)。然而，隨著 我國(guó)斑點(diǎn)叉尾鮰養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，已經(jīng)出現(xiàn)了明顯的生長(zhǎng)減慢、體色分化和規(guī)格不齊 等種質(zhì)衰退現(xiàn)象。因此，培育生長(zhǎng)快、經(jīng)濟(jì)性狀好、抗逆性強(qiáng)的斑點(diǎn)叉尾鮰新品種（系）已成 為當(dāng)前斑點(diǎn)叉尾鮰產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展亟待解決的重要問(wèn)題。
[0003] 催乳素(Prolactin，PRL)是由脊椎動(dòng)物垂體前葉細(xì)胞合成和分泌的單鏈多肽類激 素，具有多種生理功能，主要涉及滲透調(diào)節(jié)、生長(zhǎng)發(fā)育、免疫、內(nèi)分泌以及代謝調(diào)控等。催乳 素與生長(zhǎng)激素 (Growth hormone，GH)及生長(zhǎng)催乳素（Somatolactin,SL)具有相似的結(jié)構(gòu)和 功能，最新的分子進(jìn)化學(xué)研究表明GH基因、PRL基因和SL基因很可能均由古GH基因經(jīng)多基因 拷貝以及隨后漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程演變而來(lái)。PRL基因已經(jīng)作為生長(zhǎng)性狀的候選基因，其SNPs和 SSR多態(tài)性與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析在家禽、畜牧和水產(chǎn)動(dòng)物中已經(jīng)有較多的報(bào)道。羅非魚(yú) PRL1基因啟動(dòng)子區(qū)的一個(gè)SSR位點(diǎn)在不同鹽度水平與其生長(zhǎng)顯著相關(guān)。亞洲鱸PRL基因上的 一個(gè)SNP位點(diǎn)（c. 264+269T>C)與其體質(zhì)量、體長(zhǎng)等生長(zhǎng)性狀顯著相關(guān)，基因型為CC個(gè)體的體 質(zhì)量和體長(zhǎng)顯著性大于基因型為CT和TT的個(gè)體。因此，在斑點(diǎn)叉尾鮰中尋找鑒定PRL基因與 生長(zhǎng)性狀相關(guān)聯(lián)的SNPs及單倍型分子標(biāo)記對(duì)選育生長(zhǎng)速度快且遺傳穩(wěn)定的斑點(diǎn)叉尾鮰親 本具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種與斑點(diǎn)叉尾鮰快速生長(zhǎng)相關(guān)的單倍型SNP分子標(biāo)記及其 應(yīng)用，即利用斑點(diǎn)叉尾鮰PRL基因的一個(gè)與斑點(diǎn)叉尾鮰生長(zhǎng)性狀相關(guān)的單倍型SNP分子標(biāo)記 進(jìn)行快速生長(zhǎng)親本的篩選和鑒定。
[0005] 本發(fā)明專利所采取的技術(shù)方案是：
[0006] 本發(fā)明提供一種與斑點(diǎn)叉尾鮰快速生長(zhǎng)性狀相關(guān)的單倍型SNP分子標(biāo)記，所述的 單倍型SNP分子標(biāo)記的核苷酸序列如SEQIDN0.1和SEQIDN0 :2所示，在SEQIDN0.1序列 的第296、362、623位的堿基處分別存在A/T、C/T、C/T3個(gè)突變 ;在SEQIDN0.2序列的第94 和788位的堿基處分別存在C/T和A/G 2個(gè)突變。 一種用于檢測(cè)上述單倍型SNP分子標(biāo)記的引物，該引物包括PRLP5~13;所述PRLP5~13 的DNA序列如SEQIDN0:7~15所示。 一種用于檢測(cè)上述單倍型SNP分子標(biāo)記的試劑盒，該試劑盒包含上述的引物PRLP5~ 13。
[0007] 本發(fā)明的單倍型SNP分子標(biāo)記、引物或試劑盒在快速篩選和鑒定生長(zhǎng)斑點(diǎn)叉尾鮰 親本中的應(yīng)用。
[0008] -種快速生長(zhǎng)斑點(diǎn)叉尾鮰候選親本的篩選和鑒定方法，包括如下步驟:檢測(cè)斑點(diǎn) 叉尾鮰核心選育群體中的SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2所示的序列，對(duì)核心選育群體中每尾 斑點(diǎn)叉尾鮰候選親本的每個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行分型，選擇具有單倍型組合H3/H3(ACTCA/ACTCA) 的個(gè)體作為選育親本。
[0009] 具體包括如下步驟：
[0010] ⑴從核心選育群體中剪取待測(cè)斑點(diǎn)叉尾鮰鰭條樣品，提取基因組DNA。
[0011] (2)以提取得到的基因組DNA作為模板，利用引物PRLP5/PRLP6、PRLP7/PRLP8進(jìn)行 SNP位點(diǎn)PCR擴(kuò)增，PRLP5/PRLP6用于擴(kuò)增位點(diǎn)g· 296A>T、g· 362C>T和g· 623C>T，PRLP7/PRLP8 用于擴(kuò)增位點(diǎn)g. 94C>T和g. 788A>G，得到初次PCR產(chǎn)物。引物PRLP5、PRLP6、PRLP7和PRLP8的 DNA序列如SEQIDN0:7、SEQIDN0:8、SEQIDN0:9和SEQIDN0:10所示。
[0 012 ] ( 3)將步驟（2 )中擴(kuò)增得到的P C R產(chǎn)物純化后，分別使用引物P R L P 9、P R L P10、 PRLP11、PRLP12和PRLP13進(jìn)行延伸反應(yīng)后，在ABI自動(dòng)遺傳分析系統(tǒng)上進(jìn)行檢測(cè)分析，確定 待測(cè)候選親本每個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型。引物PRLP9、PRLP10、PRLP11、PRLP12和PRLP13的DNA序 列如SEQIDN0:11、SEQIDN0:12、SEQIDN0:13、SEQIDN0:14和SEQIDN0:15所示。 [0013] (4)分析每尾候選斑點(diǎn)叉尾鮰親本的單倍型組合，將單倍型組合為H3/H3(ACTCA/ ACTCA)的親本選擇出來(lái)留種以備后續(xù)配種。
[0014] SNP位點(diǎn)PCR擴(kuò)增使用即用型UtraTaq酶PCR試劑盒(上海捷瑞生物工程有限公司）， 反應(yīng)體系為： 2X UliraTaq Master Mix 20 pL: 基因組DNA 2 pL 1 OP上下游引物 2μ[ ddH20 14liL
[0015] 擴(kuò)增條件為：94°c預(yù)變性5min; 94°C變性30s，退火30s，72 °C延伸60s，30個(gè)循環(huán)；72 °C 延伸 lOmin。
[0016] SNPs分型使用ABI SNaPshot Multiplex PCR試劑盒(ABI，美國(guó)），反應(yīng)體系為6yL: Snapshot Mix 1 μL 延伸引物 0.1 μL 純化PCR產(chǎn)物 2ML ddH20 2.9 μL
[0017] 反應(yīng)條件為:96 °C預(yù)變性lmin; 96°C變性10s，52°C退火5s，60 °C延伸30s，共30個(gè)循 環(huán)。
[0018] 反應(yīng)結(jié)束后加入 1U ?38七六？，371€6〇111丨11，85°(：15111丨11進(jìn)行純化。以661165。311-1201^2 Size Standard為內(nèi)標(biāo)，取lyL產(chǎn)物與9yL含有Liz的Hi-Di(GS-120Liz:Hi-Di = 1:200)混合， 95°C變性3min，立即冰浴3min后上測(cè)序儀。檢測(cè)及分析采用ABI PRISM 3730X1型自動(dòng)遺傳 分析系統(tǒng)(ABI，美國(guó)），并利用Genemapper v4.1軟件進(jìn)行分型。
[0019] 5個(gè)SNPs位點(diǎn)經(jīng)多重Snapshot方法分型，每個(gè)位點(diǎn)均出現(xiàn)3種基因型。利用SHEsis 軟件分析這5個(gè)SNPs產(chǎn)生的單倍型種類和頻率，R軟件進(jìn)行基因型與性狀間的關(guān)聯(lián)分析。結(jié) 果顯示，5個(gè)SNPs中，g. 6230T和g. 788A>G對(duì)所測(cè)量的生長(zhǎng)性狀有顯著性影響(P〈0.05)，5個(gè) 位點(diǎn)重構(gòu)的單倍型，不同單倍型組合對(duì)所測(cè)量的生長(zhǎng)性狀都有顯著性影響(P〈〇.05)，其中 H3/H3(ACTCA/ACTCA)單倍型組合的體質(zhì)量和體長(zhǎng)值最大。在實(shí)際生產(chǎn)中保留單倍型組合為 H3/H3(ACTCA/ACTCA)的斑點(diǎn)叉尾鮰親本，便可獲得生長(zhǎng)速度快且遺傳穩(wěn)定的斑點(diǎn)叉尾鮰品 系。該方法相較于傳統(tǒng)的選育方法，具有目的性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快，易于推廣等優(yōu) 點(diǎn)。
[0020] 本發(fā)明的方法，大大降低了斑點(diǎn)叉尾鮰親本篩選的盲目性，縮短育種年限，可以快 速獲得生長(zhǎng)速度快且遺傳穩(wěn)定的斑點(diǎn)叉尾鮰親本。
【附圖說(shuō)明】 圖1為PRL基因示意圖及5個(gè)SNPs位點(diǎn)所處的位置 其中，引物對(duì)PRLP5/PRLP6擴(kuò)增出SNP位點(diǎn)g. 296A>T、g. 362C>T和g. 623C>T，引物對(duì) PRLP7/PRLP8擴(kuò)增出SNP位點(diǎn)g. 94C>T和g. 788A>G，除SNP位點(diǎn)g. 788A>G，其余SNP位點(diǎn)均處于 內(nèi)含子區(qū)域。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 實(shí)施例1
[0022] 1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
[0023] 本實(shí)驗(yàn)所用斑點(diǎn)叉尾鮰樣本均來(lái)自于江蘇省淡水水產(chǎn)研究所祿口試驗(yàn)基地。 1997-2004年從美國(guó)引進(jìn)德克薩斯（1997)群體、阿肯色（1999)群體、密西西比（2001)群體、 阿肯色（2003)群體和阿肯色（2004)群體405尾建立育種基礎(chǔ)群體，利用基礎(chǔ)群體進(jìn)行G0代 家系構(gòu)建。2013年6月利用G0代家系構(gòu)建G1代家系，為了減小環(huán)境對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰生長(zhǎng)的影 響，苗種培育按照同一標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，即均一的換水速率、投喂量、養(yǎng)殖密度、充氧量以及水溫。 待到家系平均日齡為520d時(shí)掃描記錄存活個(gè)體編號(hào)，采集每尾魚(yú)的尾鰭組織，95%酒精浸 泡，一20°C保存。
[0024] 在本發(fā)明中，所述的斑點(diǎn)叉尾鮰生長(zhǎng)性狀主要包括:體質(zhì)量和體重。
[0025] 1.2引物設(shè)計(jì)
[0026] 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)公布的斑點(diǎn)叉尾鮰PRL全基因序列(AF267990.1)，使用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)兩對(duì)引物?1?1^1/?1?1^2、？1?1^3/?1?1^4，擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為1762匕口和 1776bp〇
[0027] 1.3PCR 擴(kuò)增
[0028] PCR擴(kuò)增使用即用型UtraTaq酶PCR試劑盒(上海捷瑞生物工程有限公司），反應(yīng)體 系為： 2X UltraZivi/ Master Pvlix 20 μL 基因組DNA 2 .llL 10P上下游引物 2μ【 ddH20 14 μL
[0029] 擴(kuò)增條件為：94°C預(yù)變性5min; 94°C變性30s，退火30s，72 °C延伸2min，30個(gè)循環(huán)； 72 °C延伸1 Omin。1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，凝膠成像儀觀察電泳結(jié)果。
[0030] 1.4測(cè)序
[0031]紫外燈下切膠純化回收PCR產(chǎn)物，每對(duì)引物的PCR產(chǎn)物各選取12個(gè)樣本，送至上海 生工生物工程股份有限公司，直接使用ABI 3730XL測(cè)序儀(ABI，美國(guó)）測(cè)序。使用chromas軟 件觀察測(cè)序峰圖，結(jié)合ClustalX軟件進(jìn)行DNA序列比對(duì)來(lái)判斷SNP位點(diǎn)的堿基類型。
[0032] 1.5SNPs 分型
[0033] 利用引物 PRLP5/PRLP6、PRLP7/PRLP8 進(jìn)行 SNPs 位點(diǎn) PCR 擴(kuò)增，PRLP5/PRLP6 用于擴(kuò) 增位點(diǎn) g · 296A>T、g · 362C>T和 g · 623C>T，PRLP7/PRLP8 用于擴(kuò)增位點(diǎn) g · 94C>T和g · 788A>G，得 到初次PCR產(chǎn)物。
[0034] 分別使用引物PRLP9、PRLP10、PRLP11、PRLP12和PRLP13進(jìn)行延伸反應(yīng)后，在ABI自 動(dòng)遺傳分析系統(tǒng)上進(jìn)行檢測(cè)分析，確定待測(cè)候選親本每個(gè)位點(diǎn)的基因型。
[0035] SNPs位點(diǎn)PCR擴(kuò)增使用即用型UtraTaq酶PCR試劑盒（上海捷瑞生物工程有限公 司），反應(yīng)體系為： 2X UIlra7i：/i/ Master Mix 20 μL 基因組DNA 2 nL 10P上下游引物 ddH20 14 μL
[0036] 擴(kuò)增條件為:94°C預(yù)變性5min; 94°C變性30s，退火30s，72 °C延伸60s，30個(gè)循環(huán);72 °C 延伸 lOmin。
[0037] SNPs分型使用ABI SNaPshot Multiplex PCR試劑盒(ABI，美國(guó)），反應(yīng)體系為6yL: Snapshot Mix 1 [,lL 延伸引物 （λ ? μι 純化PCR產(chǎn)物 2 μ1_. ddH20 2.9
[0038] 反應(yīng)條件為:96 °C預(yù)變性lmin; 96°C變性10s，52°C退火5s，60 °C延伸30s，共30個(gè)循 環(huán)。
[0039] 反應(yīng)結(jié)束后加入 1U ?38七4?，371€6〇111丨11，85。(：15111丨11進(jìn)行純化。以661165。311-1201^2 Size Standard為內(nèi)標(biāo)，取lyL產(chǎn)物與9yL含有Liz的Hi-Di(GS-120Liz:Hi-Di = 1:200)混合， 95°C變性3min，立即冰浴3min后上測(cè)序儀。檢測(cè)及分析采用ABI PRISM 3730X1型自動(dòng)遺傳 分析系統(tǒng)(ABI，美國(guó)），并利用Genemapper v4.1軟件進(jìn)行分型。
[0040] 1.6單倍型構(gòu)建與關(guān)聯(lián)分析
[00411利用SHEsis軟件分析這5個(gè)SNPs產(chǎn)生的單倍型種類和頻率，R軟件進(jìn)行基因型與性 狀間的關(guān)聯(lián)分析，使用廣義線性模型(GLM)進(jìn)行計(jì)算。具體模型:Yi j = y+Gi+ei j，式中：Yi j 為某個(gè)性狀第i個(gè)標(biāo)記第j個(gè)個(gè)體觀測(cè)值;μ為實(shí)驗(yàn)觀測(cè)所有個(gè)體的平均值(即總體平均值）； Gi為第i個(gè)標(biāo)記的效應(yīng)值;e i j為對(duì)應(yīng)于觀察值的隨機(jī)殘差效應(yīng)。
[0042] 1.7結(jié)果分析
[0043] 序列比對(duì)結(jié)果顯示在PRL基因上共檢測(cè)到5個(gè)SNPs，分別為g.296A>T、g.362C>T、 8.62301'4.9401'和8.7884>6，均位于非編碼區(qū)。其中8.296六>1'4.36201'和8.62301'均位 于第二內(nèi)含子，g.94C>T位于第四內(nèi)含子，g.788A>G位于3'端側(cè)翼序列，如附圖1所示。這5個(gè) SNPs位點(diǎn)經(jīng)多重Snapshot方法分型，每個(gè)位點(diǎn)均出現(xiàn)3種基因型。5個(gè)SNPs位點(diǎn)重構(gòu)形成7種 單倍型，產(chǎn)生10種單倍型組合。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，不同單倍型組合對(duì)生長(zhǎng)性狀均有顯著影 響(P〈0.05)，其中H3/H3(ACTCA/ACTCA)單倍型組合的體質(zhì)量和體長(zhǎng)值最大。因此，PRL基因 的5個(gè)SNPs構(gòu)成的單倍型分子標(biāo)記可以運(yùn)用到斑點(diǎn)叉尾鮰分子標(biāo)記輔助選育中。
[0044]表1斑點(diǎn)叉尾鮰PRL基因單倍型組合與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析
[0047] 注：不同小寫(xiě)字母表示差異顯著（P〈0.05)，不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著（P〈 0·01)〇
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種與斑點(diǎn)叉尾鮰快速生長(zhǎng)相關(guān)的單倍型SNP分子標(biāo)記，其特征在于:所述的單倍型 SNP分子標(biāo)記的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示；在該序列的第296、362、623位的堿基處分 別存在A/T、C/T、C/T3個(gè)突變。2. -種與斑點(diǎn)叉尾鮰快速生長(zhǎng)相關(guān)的單倍型SNP分子標(biāo)記，其特征在于:所述的單倍型 SNP分子標(biāo)記的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示;在該序列的第94和788位的堿基處分別存 在C/T和A/G 2個(gè)突變。3. -種用于檢測(cè)權(quán)利要求1或2所述單倍型SNP分子標(biāo)記的引物，其特征在于:所述的引 物包括PRLP5~13;所述PRLP5~13的DNA序列如SEQ ID N0:7~15所示。4. 一種用于檢測(cè)權(quán)利要求1或2所述單倍型SNP分子標(biāo)記的試劑盒，其特征在于:包含權(quán) 利要求3所述的引物。5. 權(quán)利要求1或2所述的單倍型SNP分子標(biāo)記、權(quán)利要求3所述的引物或權(quán)利要求4所述 的試劑盒在快速篩選和鑒定生長(zhǎng)斑點(diǎn)叉尾鮰親本中的應(yīng)用。6. -種快速生長(zhǎng)斑點(diǎn)叉尾鮰親本的篩選方法，其特征在于:包括如下步驟:檢測(cè)斑點(diǎn)叉 尾鮰核心選育群體中的SEQ ID N0:1和SEQ ID腸：2所示的序列，選擇單倍型組合!13/!13 (ACTCA/ACTCA)的個(gè)體作為選育親本。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的篩選方法，其特征在于:包括如下步驟： (1) 從核心選育群體中剪取待測(cè)斑點(diǎn)叉尾鮰鰭條樣品，提取基因組DNA; (2) 以提取得到的基因組DNA作為模板，利用引物PRLP5/PRLP6、PRLP7/PRLP8進(jìn)行SNP位 點(diǎn) PCR 擴(kuò)增，PRLP5/PRLP6 用于擴(kuò)增位點(diǎn) g.296A>T、g.362C>T 和 g.623C>T，PRLP7/PRLP8 用于 擴(kuò)增位點(diǎn)g. 94C>T和g. 788A>G，得到初次PCR產(chǎn)物； (3 )將步驟（2 )中擴(kuò)增得到的初次PCR產(chǎn)物純化后，分別使用引物PRLP9、PRLP10、 PRLP11、PRLP12和PRLP13進(jìn)行延伸反應(yīng)后，在ABI自動(dòng)遺傳分析系統(tǒng)上進(jìn)行檢測(cè)分析，確定 待測(cè)候選親本每個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型； (4)分析每尾候選斑點(diǎn)叉尾鮰親本的單倍型組合，將單倍型組合為H3/H3(ACTCA/ ACTCA)的親本選擇出來(lái)留種以備后續(xù)配種。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的篩選方法，其特征在于：所述SNP位點(diǎn)PCR擴(kuò)增的引物PRLP5、 PRLP6、PRLP7和PRLP8的DNA序列如SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9和SEQ ID NO: 10所示。9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的篩選方法，其特征在于:所述延伸反應(yīng)的引物PRLP9、PRLP10、 PRLP11、PRLP12和PRLP13的DNA序列如SEQ ID N0:11、SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:13、SEQ ID NO: 14和SEQ ID NO: 15所示。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK105969882SQ201610466570
【公開(kāi)日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年6月23日
【發(fā)明人】張世勇, 邊文冀, 陳校輝, 王明華, 秦欽, 鐘立強(qiáng)
【申請(qǐng)人】江蘇省淡水水產(chǎn)研究所