用于檢測微量組織中braf基因突變的引物組合及其應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于檢測微量組織中BRAF基因突變的引物組合，其包括預擴增引物組、用于檢測11號外顯子突變的引物組、用于檢測15號外顯子突變的引物組；該方法旨在將微量的DNA通過預擴增得到較高濃度的DNA模板，結(jié)合直接測序法檢測樣本中BRAF基因的突變情況；將該引物組合應用于制備檢測BRAF基因突變的檢測試劑中，可檢測樣本的DNA濃度低至100pg，且可以同時檢測BRAF基因第11和15號外顯子的所有突變，本發(fā)明提供的檢測方法靈敏度高，特異性強，成本低，適用于臨床腫瘤患者BRAF基因突變的檢測，具有很好的臨床應用價值。
【專利說明】
用于檢測微量組織中份iVIf基因突變的引物組合及其應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于生物檢測技術領域，具體涉及一種用于微量組織中基因突變檢 測的引物組合及其在腫瘤用藥選擇和疾病診斷相關方面的應用。
【背景技術】
[0002] 基因是1988年由Ikawa等首先在人類尤因肉瘤中發(fā)現(xiàn)并克隆確認的一種能 轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞且有活性的DNA序列。BRAF基因與ARAF、CRAF基因同屬RAF家族，命名為鼠類 肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1，位于人染色體7q34，長約190kb，編碼783個氨基酸的蛋白， 相對分子質(zhì)量為84436,有CR1、CR2和CR3三個保守區(qū)。BRAF是Ras-Raf-MEK-ERK信號轉(zhuǎn)導通 路重要的轉(zhuǎn)導因子，其功能的編碼區(qū)由2510對堿基組成，主要通過有絲蛋白激酶通路中的 絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶來發(fā)揮作用，該酶將細胞表面的受體和RAS蛋白通過MEK和ERK與核 內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子相連接，啟動多種因子參與調(diào)控細胞內(nèi)多種生物學事件，如細胞生長、分化和 調(diào)亡(Wanchoo R, et al, 2016; Mandal R, et al, 2016)。研究表明，在多種人類惡性腫 瘤中，如惡性黑色素瘤、結(jié)直腸癌、肺癌、甲狀腺癌、肝癌及胰腺癌，均存在不同比例的BRAF 突變（Caparica R, et al, 2015; Semrad TJ, et al, 2016)。
[0003] F突變主要有兩種類型：1.11%位于exonl 1上的甘氨酸環(huán)，如G463、G465、G468 的點突變;2.89%的突變發(fā)生在exonl5上的激活區(qū)，其中約92%位于第1799核苷酸上，T突 變?yōu)锳，導致其編碼的谷氨酸由纈氨酸取代(V600E)(G er^ler B，et al，2015)。此外，僅不 至Ijl%的癌組織同時存在突變與RAS突變，且在這1%中，突變幾乎均為非V600E 突變。以上兩種類型的突變均能使BRAF激酶活性及NIH3T3細胞轉(zhuǎn)化能力提高，但以后者更 為重要。V600E突變能模擬T598和S601兩個位點的磷酸化作用，使BRAF蛋白激活。
[0004] 2011年Π )Α批準維羅非尼用于治療晚期（轉(zhuǎn)移性)或不可切除的黑色素瘤，尤其是 攜有BRAFV600E基因變異腫瘤者。該藥的安全性和療效評估基于一項國際單中心研究。該研 究納入675例BRAFV600E變異的初治晚期黑色素瘤患者，入選者被隨機分入維羅非尼組或達 卡巴嗪組。結(jié)果顯示，在維羅非尼組患者未達到中位生存期終點時（77%的患者生存），達卡 巴嗪組患者中位生存期為8個月（64%的患者生存）。BRAF是位于KRAS下游級聯(lián)信號通路上的 一個重要蛋白，當BRAF基因發(fā)生突變后，其編碼生成的蛋白產(chǎn)物無需接受上游信號蛋白的 活化便始終處于激活狀態(tài)，啟動下游細胞信號轉(zhuǎn)導途徑，引起細胞增殖，從而使EGFR抑制劑 西妥昔單克隆抗體和帕尼單克隆抗體等療效減弱或無效。因此，腫瘤病人在用藥之前進行 BRAF基因的突變檢測，將有利于這些患者選擇最好的治療方式。
[0005] 目前針對突變的檢測方法有很多，如直接測序法，該法對樣本要求較高，檢 測范圍有限。多態(tài)性分析法(RFLP)，是將PCR與限制性酶切相結(jié)合的一種方法，此實驗操作 繁瑣，檢測周期長，成本高昂，存在第一輪酶切不完全導致的假陽性。Taqman水解探針法，使 用擴增阻滯突變系統(tǒng)(ARMS)與熒光探針結(jié)合來檢測突變，針對該方法設計的引物，使得突 變型得到擴增，野生型無法擴增，從而增強了突變信號，便于檢測。但是ARMS技術應用最后 一個堿基不匹配并不能完全阻滯野生型DNA的擴增，存在假陽性的風險，且只能針對特異性 位點檢測。此外，如高效液相色譜、毛細血管電泳等，需要特殊的儀器設備，且操作復雜，不 利于在臨床上進行大范圍的推廣。核酸序列擴增法(NASBA)、自序序列復制法(3SR)和鏈置 換復制法(SDA)雖均為等溫擴增法，但是它們對目的序列的擴增特異性不強。
[0006] 盡管如此，突變的檢測方法仍以腫瘤組織標本檢測為金標準，但是臨床上 常常由于組織樣本獲取不足量，使其檢測具有一定的局限性。因此臨床上亟需一種高效準 確全面地檢測微量組織中基因突變的產(chǎn)品及方法，以便于為腫瘤個性化治療服務。
[0007] 為此，本發(fā)明利用恒溫擴增與直接測序相結(jié)合的方法，建立了一套針對微量組織 樣本中基因所有突變類型檢測的技術流程，該檢測方法靈敏度高，特異性強，成本 低，有利于臨床使用和推廣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于提供一種具有高特異性和靈敏度的檢測微量組織樣本中 基因突變的引物組合，以組織DNA為檢測對象，結(jié)合恒溫預擴增技術和普通PCR技術，通過直 接測序法確定腫瘤樣本中有無5 F基因突變，可對F基因的突變進行準確的檢測。
[0009] 本發(fā)明提供的引物組合能檢測出洲#基因發(fā)生在第11和15號外顯子的所有突變。
[0010] 本發(fā)明提供的用于檢測似#基因突變的引物組合包括如SEQ ID N0:1- SEQ ID NO: 18所示的預擴增引物組、如SEQ ID NO: 19- SEQ ID N0:20所示的用于檢測11號外顯子 突變的引物組、如SEQ ID N0:21- SEQ ID N0:22所示的用于檢測15號外顯子突變的引物組。
[0011] 本發(fā)明的另一目的是將上述引物組合應用在制備檢測仰#基因突變的檢測試劑中。
[0012] 本發(fā)明的另一目的是將上述引物組合應用于制備用于檢測基因突變的檢 測試劑盒中，所述試劑盒組分還包含下列常規(guī)組分中的一種或幾種:聚合酶、引物組合、PCR 反應緩沖液、dNTP、BSA、去離子水。
[0013] 本發(fā)明用于檢測基因突變的引物組合的檢測使用方法，具體步驟如下： (1)引物稀釋 將primerl_primel8分別稀釋后混勾制得Primer Mix(表1)，其中primerl_primerl6引 物的終濃度為0 · 05-0 · ΙμΜ，primer 17-primer 18引物的終濃度為 1_3μΜ;primer 19_primer22 引物(表1)稀釋至5-10μΜ。
[0014] (2)預擴增 在擴增管中加入lyL的10X反應緩沖液、2·5yL的Primer Mix、100-1000pg微量DNA模板 (本發(fā)明采用的DNA模板來源于結(jié)腸癌病人組織，并按照《分子克隆實驗指南》中所述常規(guī)方 法提取組織DNA)、用去離子水補足至8.8yL;混勻，98°C預變性5-10min，然后置于冰上10-2〇min;再加入0.5yL dNTP (10mM each)、0.2yL 100XBSA以及0.5yL phi29 DNA聚合酶， 30-35°C擴增過夜，65°C加熱10_20min使酶失活。
[0015] (3)使用PCR純化試劑盒純化上述預擴增產(chǎn)物。
[0016] (4)57^尸基因突變檢測 針對基因的11、15號外顯子突變，分別采用如SEQ ID N0:19- SEQ ID N0:20所 示的引物組檢測11號外顯子突變;如SEQ ID NO:21- SEQ ID NO:22所示的引物組檢測15號 外顯子突變。
[0017] 配置PCR反應總體系為25yL:其中Pfu Mix混合液12.5yL、所述正向引物（5-10μΜ) 的體積〇.5-lyL、反向引物（5-10μΜ)的體積0.5-lyL、預擴增產(chǎn)物l-2yL、用水補足至25yL。 PCR反應條件為:①94°C，5min預變性;②94°C，30s變性;③55°C，30s退火;④72°C，35s延伸； 循環(huán)②至④35次;⑤72 °C，5min;測序檢測。
[0018] 本發(fā)明的檢測優(yōu)勢在于:①本發(fā)明采用多引物組合、利用恒溫擴增及普通PCR相結(jié) 合的方法，解決了組織樣本中初始DNA含量低的，無法進行基因突變檢測的局限性； ②本發(fā)明中使用的試劑價格低廉，可大批量的處理樣本；③本發(fā)明方法擴增效率高，如 100pg的DNA經(jīng)擴增后可得到lOOOng/yL;可同時檢測多位點的突變情況;④本發(fā)明方法DNA 擴增后DNA忠實性好。總之，使用本發(fā)明方法可實現(xiàn)對微量組織樣本中的'基因的突變 情況進行高效、準確的檢測，其對于臨床腫瘤早期篩查，指導臨床用藥，以及監(jiān)測腫瘤的預 后具有很好的實際應用價值。
[0019] 表1:引物1-22的核苷酸序列

【附圖說明】
[0020] 圖1是本發(fā)明針對l〇〇〇pg的DNA模板擴增結(jié)果;其中A圖為預擴增結(jié)果(3次重復）;B 圖為F基因11、15號外顯子擴增結(jié)果； 圖2是本發(fā)明針對500pg的DNA模板擴增結(jié)果;其中A圖為預擴增結(jié)果(3次重復）;B圖為 因11、15號外顯子擴增結(jié)果； 圖3是本發(fā)明針對100pg的DNA模板擴增結(jié)果。A圖為預擴增結(jié)果（3次重復）；B圖為 因11、15號外顯子擴增結(jié)果； 圖4是本發(fā)明針對100(^的0嫩模板中5以，基因11、15號外顯子測序結(jié)果圖； 圖5是本發(fā)明針對500pg的DNA模板中萬以廠基因11、15號外顯子測序結(jié)果圖； 圖6是本發(fā)明針對100?8的0嫩模板中57^，基因11、15號外顯子測序結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0021] 下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。以下實施例僅用于說明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，該領域的技術人員可以根據(jù)上述本
【發(fā)明內(nèi)容】
對本發(fā)明做 出一些非本質(zhì)的改進和調(diào)整。下述實施例中，若非特異表明，所用試劑均為分析純，所有試 劑均可從商業(yè)渠道獲得，百分比均為質(zhì)量百分比。文中未注明具體條件的實驗方法，通常按 照《分子克隆實驗指南》中所述常規(guī)條件，或試劑制造廠商所建議的條件實施。除非另行定 義，文中所使用的所有專業(yè)和科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。
[0022] 實施例l:1000pg的DNA模板中基因突變檢測 1、實驗材料 phi29 DNA聚合酶，lOXreaction buffer，dNTP (10nM)，100XBSA，1000pg的 DNA模 板，去離子水，primerl-p;rimel8 (即Primer Mix)，2XPfu Mix，primerl9-p;rimer22，PCR 儀，超薄產(chǎn)物純化試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司DP203)，1%的瓊脂糖凝膠，電泳儀。 [0023] 2、實驗步驟及結(jié)果 2.1預擴增 (1) 引物稀釋 將primerl_primel8分別稀釋后混勾形成Primer Mix(表1)，其中primerl_primerl6引 物的終濃度為〇.1以]?4411^^171411^^18引物的終濃度為2以]\1。配置如下體系：
(2) 將上述試劑混勻后，98°C預變性10min，然后迅速置于冰上20min; (3) 再加入如下體系：
將上述混合物混勻后，30-35°C擴增過夜，65°C加熱10-20min使酶失活。鋪1%的膠檢測 (圖1A)。結(jié)果顯示使用phi29DNA聚合酶對lOOOpg的DNA模板擴增效果良好。
[0024] 2.2 PCR產(chǎn)物純化 (1)柱平衡步驟：向吸附柱CB1中加入500yL的平衡液BL，12，000 rpm (~13，400 X g) 離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中； (2 )估計PCR反應液的體積，向其中加入5倍體積的結(jié)合液1?，充分混勻(無需去除石蠟 油或礦物油）； (3) 將上一步所得溶液加入一個吸附柱CB1中（吸附柱放入收集管中），室溫放置2 min， 12,000 rpm(~13,400Xg)離心30s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB1放入收集管中； (4) 向吸附柱CB1中加入600yL漂洗液PW(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），12， 000 rpm (~13,400Xg)離心30s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB1放入收集管中； (5) 重復操作步驟(4); (6) 12，000 rpm(~13，400 X g)離心2 min，盡量除去漂洗液，將吸附柱置于室溫放置數(shù) 分鐘，徹底地晾干，以防止殘留的漂洗液影響下一步的實驗； (7) 取出吸附柱CB1，放入一個干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加20-50yL洗 脫緩沖液EB，室溫放置2 min，12，OOOrpm(~13，400Xg)離心2 min，收集DNA溶液。
[0025] 2.3 57? 基因突變檢測 (1)配置如下PCR反應體系，分別擴增5 基因的第11號和15號外顯子；
其中針對11號外顯子突變的引物如SEQ ID NO: 19- SEQ ID N0:20所示;針對15號外顯 子突變的引物如SEQ ID NO:21- SEQ ID NO:22所示。
[0026] (2)反應條件：①94°C，5min預變性；②94°C，30s變性；③55°C，30s退火；④72°C， 35s延伸；循環(huán)②至④35次;⑤72 °C，5min; (3)PCR反應結(jié)束后，鋪1%的膠檢測（圖1B)，結(jié)果顯示第二輪PCR對B 基因的第11 和15號外顯子均出現(xiàn)特異性擴增;然后送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序檢 測，測序結(jié)果如圖4所示，基因第11號外顯子發(fā)生錯義突變c.1391G>T p. G464V，第 15外顯子未檢測到突變。
[0027] 實施例2:500pg的DNA模板中5 F基因突變檢測 1、實驗材料 phi29 DNA聚合酶，lOXreaction buffer，dNTP (10nM)，100XBSA，1000pg的 DNA模 板，去離子水，primerl-p;rimel8 (即Primer Mix)，2XPfu Mix，primerl9-p;rimer22，PCR 儀，超薄產(chǎn)物純化試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司DP203)，1%的瓊脂糖凝膠，電泳儀。 [0028] 2、實驗步驟 2.1預擴增 (1) 引物稀釋。將primer 1-prime 18分別稀釋后混勾形成Primer Mix(表1)，其中 primer 1-primer 16引物的終濃度為0 · ΙμΜ，primer 17-primer 18引物的終濃度為2μΜ。配置如 下體系：
(2) 將上述試劑混勻后，98°C預變性lOmin，然后迅速置于冰上20min。
[0029] (3)再加入如下體系：
將上述混合物混勻后，30-35 °C擴增過夜，65 °C加熱15min使酶失活。鋪1%的膠檢測（圖 2A)。結(jié)果顯示使用phi29DNA聚合酶對500pg的DNA模板擴增效果良好。
[0030] 2.2 PCR產(chǎn)物純化 (1)柱平衡步驟：向吸附柱CB1中加入500 yL的平衡液BL，12,000 rpm (~13,400Xg) 離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
[0031] (2)估計PCR反應液的體積，向其中加入5倍體積的結(jié)合液1?，充分混勻(無需去除 石蠟油或礦物油）。
[0032] (3)將上一步所得溶液加入一個吸附柱CB1中（吸附柱放入收集管中），室溫放置2 min，12,000 rpm(~13,400 Xg)離心30 sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB1放入收集 管中。
[0033] (4)向吸附柱CB1中加入600 yL漂洗液PW(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇）， 12,000 rpm (~13,400Xg)離心30 sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB1放入收集管 中。
[0034] (5)重復操作步驟4。
[0035] (6)12,000 rpm(~13,400Xg)離心2 min，盡量除去漂洗液。將吸附柱置于室溫放 置數(shù)分鐘，徹底地晾干，以防止殘留的漂洗液影響下一步的實驗。
[0036] (7)取出吸附柱CB1，放入一個干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加20-50 yL洗脫緩沖液EB，室溫放置2 min。12，OOOrpm(~13，400 X g)離心2 min，收集DNA溶液。
[0037] 2.3 5 7? 基因突變檢測 (1)配置如下PCR反應體系，分別擴增5 基因的第11和15號外顯子，
其中針對11號外顯子突變的引物如SEQ ID NO: 19- SEQ ID N0:20所示;針對15號外顯 子突變的引物如SEQ ID NO:21- SEQ ID NO:22所示。
[0038] (2)反應條件：①94°C，5min預變性；②94°C，30s變性；③55°C，30s退火；④72°C， 35s延伸；循環(huán)②至④35次;⑤72 °C，5min; (3)PCR反應結(jié)束后，鋪1%的膠檢測（圖2B)，結(jié)果顯示第二輪PCR對F基因的第11 和15號外顯子均出現(xiàn)特異性擴增;然后送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序檢 測；測序結(jié)果如圖5所示，5 基因第11號外顯子發(fā)生錯義突變c.1391G>T p. G464V，第 15外顯子未檢測到突變。
[0039] 實施例3:100pg的DNA模板中5 F基因突變檢測 1、實驗材料 phi29 DNA聚合酶，lOXreaction buffer，dNTP (10nM)，100XBSA，1000pg的 DNA模 板，去離子水，primerl-p;rimel8 (即Primer Mix)，2XPfu Mix，primerl9-p;rimer22，PCR 儀，超薄產(chǎn)物純化試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司DP203)，1%的瓊脂糖凝膠，電泳儀。 [0040] 2、實驗步驟 2.1預擴增 (1) 引物稀釋。將primer 1-prime 18分別稀釋后混勾形成Primer Mix(表1)，其中 口1'；[11161'1-口1'；[11161'16引物的終濃度為0.]^]\1，口1'；[11161'17-口1'；[11161'18引物的終濃度為24]\1。
[0041 ] 配置如下體系：
(2) 將上述試劑混勻后，98°C預變性10min，然后迅速置于冰上20min。
[0042] (3)再加入如下體系：
將上述混合物混勻后，30-35 °C擴增過夜，65 °C加熱20min使酶失活。鋪1%的膠檢測（圖 3A)。結(jié)果顯示使用phi29DNA聚合酶對100pg的DNA模板擴增效果良好。
[0043] 2.2 PCR產(chǎn)物純化 (1)柱平衡步驟：向吸附柱CB1中加入500 yL的平衡液BL，12,000 rpm (~13,400Xg) 離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
[0044] (2 )估計PCR反應液的體積，向其中加入5倍體積的結(jié)合液1?，充分混勻(無需去除 石蠟油或礦物油）。
[0045] (3)將上一步所得溶液加入一個吸附柱CB1中（吸附柱放入收集管中），室溫放置2 min，12，000 rpm(~13，400 X g)離心30-60 sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB1放入收 集管中。
[0046] (4)向吸附柱CB1中加入600 yL漂洗液PW(使用前請先檢查是否已加入無水乙 醇），12,000 rpm (~13,400Xg)離心30-60 sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB1放入 收集管中。
[0047] (5)重復操作步驟4。
[0048] (6)12,000 rpm(~13,400Xg)離心2 min，盡量除去漂洗液。將吸附柱置于室溫放 置數(shù)分鐘，徹底地晾干，以防止殘留的漂洗液影響下一步的實驗。
[0049] (7)取出吸附柱CB1，放入一個干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加20-50 μL洗脫緩沖液EB，室溫放置2 min。12，OOOrpm(~13，400Xg)離心2 min，收集DNA溶液。
[0050] 2.3 5 F基因突變檢測 (1)配置如下PCR反應體系，分別擴增5 F基因的第11和15號外顯子，
其中針對11號外顯子突變的引物如SEQ ID NO: 19- SEQ ID N0:20所示;針對15號外顯 子突變的引物如SEQ ID NO:21- SEQ ID NO:22所示。
[0051 ] (2)反應條件：①94°C，5min預變性；②94°C，30s變性；③55°C，30s退火；④72°C， 35s延伸；循環(huán)②至④35次;⑤72 °C，5min; (3)PCR反應結(jié)束后，鋪1%的膠檢測（圖3B)，結(jié)果顯示第二輪PCR對5 F基因的第11 和15號外顯子均出現(xiàn)特異性擴增;然后送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序檢 測；測序結(jié)果如圖6所示，基因第11號外顯子發(fā)生錯義突變c.1391G>T p. G464V，第 15外顯子未檢測到突變。
[0052]以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領域的技 術人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修 改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權項】
1. 用于檢測微量組織中基因突變的引物組合，其特征在于:包括如SEQ ID NO :1-SEQ ID NO: 18所示的預擴增引物組、如SEQ ID NO: 19- SEQ ID NO:20所示的用于檢測11號 外顯子突變的引物組、如SEQ ID NO:21- SEQ ID NO:22所示的用于檢測15號外顯子突變的 引物組。2. 權利要求1所述的引物組合在制備檢測基因突變的檢測試劑中的應用。3. 權利要求1所述的引物組合在制備檢測基因突變的檢測試劑盒中的應用。
【文檔編號】C12Q1/68GK105969877SQ201610423410
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年6月15日
【發(fā)明人】盛苗苗, 羅瑛, 唐文如, 李珊珊, 王芳, 趙月光, 張繼虹, 賈舒婷, 吳曉明, 劉靜, 周若宇, 旦菊花
【申請人】昆明理工大學