專利名稱：一種快速鑒別牛羊肉的試劑盒與使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種快速鑒別牛羊肉的試劑盒和使用方法，屬于食品檢測(cè)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
改革開放以來(lái)，我國(guó)的肉牛產(chǎn)業(yè)得到了迅速的發(fā)展，經(jīng)過(guò)20多年的快速發(fā)展，從二十世紀(jì)九十年代開始，我國(guó)肉牛存欄數(shù)量躍居世界第一位，牛肉產(chǎn)肉躍居世界第三位。在這20多年里，我國(guó)的經(jīng)濟(jì)也取得了年均9%以上的高速發(fā)展，人們生活水平迅速提高，對(duì)牛肉的需求快速増加。正是由于肉牛產(chǎn)業(yè)的這種快速發(fā)展，才滿足了國(guó)內(nèi)對(duì)牛肉快速增長(zhǎng)的需求，牛肉價(jià)格也穩(wěn)步提高。1999年我國(guó)的肉牛數(shù)量到達(dá)了發(fā)展的頂峰，此后，由于受到農(nóng)村機(jī)械化的推廣和普及，與外出打エ等相比肉牛養(yǎng)殖的比較效益下降，肉牛的存欄數(shù)量開始呈逐年下降的趨勢(shì)，但牛肉產(chǎn)量仍保持小幅上升的趨勢(shì)。同期，我國(guó)的經(jīng)濟(jì)仍保持高速增加，人們生活越來(lái)越富裕，對(duì)牛肉的需求進(jìn)一歩快速增長(zhǎng)。此時(shí)，僅依靠國(guó)內(nèi)的肉牛產(chǎn)業(yè)已經(jīng)無(wú)法滿足對(duì)牛肉的需求，刺激牛肉價(jià)格進(jìn)一歩上漲，2011年普通牛肉達(dá)到了 40-45元/千克的歷史最高點(diǎn)，優(yōu)質(zhì)牛肉價(jià)格普遍在200元/千克以上，最高價(jià)格達(dá)到了 1000-2000元/ 千克。牛肉價(jià)格的飛速上漲和短缺導(dǎo)致國(guó)外的牛肉大量通過(guò)走私等途徑進(jìn)入中國(guó)，同吋，國(guó)內(nèi)也出現(xiàn)了很多不和諧的現(xiàn)象，2011年4月份安徽首次曝光了利用牛肉膏等添加劑使豬肉變牛肉的事件，此后，在全國(guó)多個(gè)省市均發(fā)現(xiàn)了類似的產(chǎn)品。一時(shí)間，人們對(duì)牛肉等食品安全的關(guān)注成為了全社會(huì)的焦點(diǎn)。其實(shí)，牛肉市場(chǎng)面臨的豬肉變牛肉事件僅是冰山的一角。在社會(huì)上還大量存在著用雞肉、鴨肉等低價(jià)肉甚至是ー些病死肉加工冒充牛肉的現(xiàn)象。目前社會(huì)上銷售的低價(jià)牛肉和牛肉片，幾乎都是非牛肉加工而成。因?yàn)槟壳盎钆５膬r(jià)格已經(jīng)達(dá)到18-20元/千克，而每千克活牛只能出0. 4-0. 5千克牛肉，因此，每千克牛肉至少要達(dá)到36元以上才有可能盈利。屠宰場(chǎng)和銷售商不可能賠錢賺吆喝。羊肉由于其價(jià)格高于普通牛肉，其市場(chǎng)面臨著與普通牛肉完全一祥的情況。面對(duì)牛羊肉市場(chǎng)存在的亂象，人們只能從色澤、氣味、弾性等多個(gè)方面進(jìn)行初步鑒別，但大多數(shù)消費(fèi)者都不可能掌握這種專業(yè)知識(shí)，很難對(duì)生牛肉進(jìn)行鑒別，對(duì)加工后的牛肉則更是難以鑒別。目前社會(huì)上缺乏牛羊肉的準(zhǔn)確鑒別技木。通過(guò)現(xiàn)代化的DNA鑒定技木， 可以進(jìn)行鑒別。早在2008年新華每日電訊就報(bào)道過(guò)杭州ー個(gè)市民買10元牛肉花觀00元進(jìn)行DNA鑒定的事件，2010年中新網(wǎng)報(bào)道了寧波ー個(gè)消費(fèi)者花1800元通過(guò)DNA親子鑒定技術(shù)鑒別牛肉真假的事件，表明這種方法雖然能夠鑒別，但所需時(shí)間長(zhǎng)，費(fèi)用高。因此，迫切需要建立一種簡(jiǎn)單、快速、廉價(jià)的牛羊肉鑒別技木，以維護(hù)牛羊肉市場(chǎng)的安全，保護(hù)廣大消費(fèi)者的身體健康。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)國(guó)內(nèi)外已有方法在檢測(cè)技術(shù)上存在著操作復(fù)雜、耗時(shí)、重復(fù)性低、檢測(cè)成本高等不足之處，在檢測(cè)技術(shù)上加以改迸。動(dòng)物線粒體DNA編碼序列具有高度保守性，對(duì)于物種的鑒定具有很高的可信度和準(zhǔn)確性。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)是由日本學(xué)者Notomi T等0000)設(shè)計(jì)創(chuàng)立的，這種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)具有靈敏度高、反應(yīng)迅速， 特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明利用LAMP技術(shù)和動(dòng)物線粒體DNA相結(jié)合對(duì)牛羊肉進(jìn)行鑒定，整個(gè)反應(yīng)可在恒溫狀態(tài)下經(jīng)過(guò)Ih就可完成，而且可以通過(guò)肉眼觀察到反應(yīng)結(jié)果。本發(fā)明的技術(shù)方案是一種快速鑒別牛羊肉的試劑盒，包含以下組分(1)反應(yīng)液每23yL的反應(yīng)液中含有12. 5yL 2X等溫反應(yīng)緩沖液、1 μ L5 μ M Primer F3U μ L 5μΜ Primer Β3>2μ L 20 μ M Primer FIP>2y L 20 μ M PrimerBIPU μ L Bst DNA聚合酶、3. 5μ L水，其中Prime μ F3(Forward Outer F3) :AACAGCTTAAAACTCAAAGGA(SEQ NO. 1)Primer B3 (Reverse Outer B3) :AGCCCATTTCTTCCCATT(SEQ NO. 2)Primer FIP (Forward Inner FIP) TGAGGTTTATCGGGGTTTATCGAGG CGGTGCTTTATATCCTT(SEQ NO. 3)Primer BIP (Reverse Inner BIP) CGCCATCTTCAGCAAACCCTGTTACA CCTTGACCTAACGT(SEQ NO. 4)2X等溫反應(yīng)緩沖液含有40mM的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽Tris-HCl (pH8. 8)、 20mM的氯化鉀、16mM的硫酸鎂、20mM的硫酸銨、20%的Tween20、l. 6M甜菜堿、2. 8mM dNTP。(2)染料每23 μ L的反應(yīng)液加入染料1 μ L，所述染料優(yōu)選為L(zhǎng)oopamp Fluorescent Detection Reagent (Loopamp 焚光檢測(cè)試齊[J )。其使用方法為按照常規(guī)方法提取待測(cè)樣品的DNA，取IyL DNA加入試劑盒中， IOOOOrpm瞬時(shí)離心30秒混勻，60°C下恒溫水浴培養(yǎng)45min，根據(jù)反應(yīng)液顏色進(jìn)行陰陽(yáng)性判斷，若反應(yīng)液變成緑色，則說(shuō)明待測(cè)樣品存在牛羊肉，若為桔黃色，則待測(cè)樣品中不存在牛羊肉。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)1、高特異性能準(zhǔn)確的鑒別出是否是牛羊肉，準(zhǔn)確率高達(dá)99%以上。2、高靈敏度僅需極微量樣品即可(所需模板達(dá)到10個(gè)拷貝或更少)。3、鑒定簡(jiǎn)便只要將檢測(cè)樣品的DNA加入試劑盒中放入60°C恒溫水浴一定時(shí)間后，通過(guò)肉眼觀察即可判定結(jié)果。4、快速高效整個(gè)過(guò)程1小時(shí)之內(nèi)就可完成。本發(fā)明的檢測(cè)體系可以在恒溫條件下，快速、方便、高效、高特異性、高靈敏地檢測(cè)到牛羊肉，不需要復(fù)雜的儀器，檢測(cè)成本大大低于現(xiàn)有技木，能滿足當(dāng)前畜禽肉類市場(chǎng)摻假檢測(cè)的迫切需要，可廣泛用于進(jìn)出口檢疫部門、食品衛(wèi)生檢測(cè)部門等的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，易于大范圍推廣應(yīng)用，具有廣闊的市場(chǎng)前景和較大的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)效益。


圖1為本試劑盒對(duì)各種畜禽DNA進(jìn)行檢測(cè)試驗(yàn)圖。圖2中自左向右DNA順序?yàn)?陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照，豬肉、牛肉、鴨肉、羊肉、兔肉；結(jié)果顯示 第1、4、6管為綠色，其余的枯黃色。圖2為PCR檢測(cè)方法靈敏度示意圖，其中自左向右依次為以10人1(Γ2.........1(Γ7稀釋度的Positive Control DNA(PC DNA)為模板的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的PCR
檢測(cè)圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 試劑盒的構(gòu)建(1)從GenBank中檢索獲得牛452bp 12s RNA序列，并進(jìn)行軟件比對(duì)分析，確定序列的準(zhǔn)確性。(2)根據(jù)上述序列利用I^rimerExplore軟件設(shè)計(jì)，并篩選出最佳引物Primer F3 :AACAGCTTAAAACTCAAAGGA(SEQ NO. 1)Primer B3 :AGCCCATTTCTTCCCATT(SEQ NO. 2)Primer FIP :TGAGGTTTATCGGGGTTTATCGAGGCGGTGCTTTATATC CTT(SEQ NO. 3)Primer BIP :CGCCATCTTCAGCAAACCCTGTTACACCTTGACCTAAC GT(SEQ NO. 4)(3)構(gòu)建試劑盒試劑盒構(gòu)成12. 5 μ L 2Χ等溫反應(yīng)緩沖液、1 μ L 5 μ M Primer F3、l μ L 5 μ MPrimer Β3>2μ L 20 μ M Primer FIP>2y L 20 μ M Primer BIPU μ L Bst DNA
1 μ L 染料(Loopamp Fluorescent Detection Reagent)、3· 5 μ L 其中2X 等溫反應(yīng)緩沖液由日本榮研化學(xué)株式會(huì)社提供，含有40mM的三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽(pH8. 8)、 20mM的氯化鉀、16mM的硫酸鎂、20mM硫酸銨、20%的Tween20、l. 6M甜菜堿、2. 8mM dNTP。(4)標(biāo)本的采集嚴(yán)格無(wú)菌采集各種畜禽DNA的新鮮肌肉組織，采用酚仿提取法提取組織樣的基因組DNA。(5)取1 μ L DNA加入步驟(3)的試劑盒中，IOOOOrpm瞬時(shí)離心30秒混勻，60°C下恒溫水浴培養(yǎng)45min，根據(jù)反應(yīng)液顏色進(jìn)行陰陽(yáng)性判斷，若反應(yīng)液變成緑色，則說(shuō)明待測(cè)樣品存在牛羊肉，若為桔黃色，則待測(cè)樣品中不存在牛羊肉。(6)靈敏度和特異性檢驗(yàn)采用豬肉、牛肉、羊肉、鴨肉、兔肉來(lái)檢測(cè)特異性，結(jié)果顯示，該試劑盒的特異性測(cè)試良好(如圖1所示)。以 10人10づ.........1(Γ7 稀釋度的 Positive Control DNA (PC DNA)為模板分別
進(jìn)行LAMP和PCR比較兩種檢測(cè)方法的靈敏度，結(jié)果顯示，LAMP法的擴(kuò)增靈敏度比普通PCR 法要高。普通PCR可以檢測(cè)到7個(gè)稀釋梯度中的第三個(gè)梯度(如圖2所示)，而LAMP法可以檢測(cè)到第四個(gè)梯度。實(shí)施例2 樣品檢測(cè)(1)從山東省內(nèi)屠宰廠生產(chǎn)線采集鮮牛肉樣品45個(gè)，鮮羊肉樣品32個(gè)，鮮雞肉樣品70個(gè)，鮮鴨肉樣品50個(gè)，鮮兔肉樣品30個(gè)，分別提取DNA，用試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果如表1 表1山東省內(nèi)屠宰廠生產(chǎn)線牛羊肉檢測(cè)結(jié)果
權(quán)利要求
1.ー種快速鑒別牛羊肉的試劑盒，其特征是，包含以下組分(1)反應(yīng)液每23 μ L的反應(yīng)液中含有12. 5 μ L2 X等溫反應(yīng)緩沖液、IyL 5μΜ Primer F3U μ L 5μΜ Primer Β3>2μ L 20 μ M Primer FIP>2y L 20 μ M Primer BIPU μ L Bst 3. 5μ L水，其中Primer F3 :AACAGCTTAAAACTCAAAGGAPrimer B3 :AGCCCATTTCTTCCCATTPrimer FIP :TGAGGTTTATCGGGGTTTATCGAGGCGGTGCTTTATATCCTTPrimer BIP :CGCCATCTTCAGCAAACCCTGTTACACCTTGACCTAACGT2 X等溫反應(yīng)緩沖液含有40mM的pH8. 8的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、20mM的氯化鉀、 16mM的硫酸鎂、20mM的硫酸銨、20%的Tween20、l. 6M甜菜堿、2. 8mM dNTP ；(2)染料每23 μ L的反應(yīng)液加入染料1 μし
2.如權(quán)利要求1所述的ー種快速鑒別牛羊肉的試劑盒，其特征是，所述染料為L(zhǎng)oopamp 熒光檢測(cè)試劑。
3.權(quán)利要求1或2所述的試劑盒的使用方法，其特征是，按照常規(guī)方法提取待測(cè)樣品的 DNA，取1 μ L DNA加入試劑盒中，IOOOOrpm瞬時(shí)離心30秒混勻，60°C下恒溫水浴培養(yǎng)45min， 根據(jù)反應(yīng)液顏色進(jìn)行陰陽(yáng)性判斷，若反應(yīng)液變成緑色，則說(shuō)明待測(cè)樣品存在牛羊肉，若為桔黃色，則待測(cè)樣品中不存在牛羊肉。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速鑒別牛羊肉的試劑盒與使用方法，屬于食品檢測(cè)領(lǐng)域。本發(fā)明試劑盒由1組具有高特異性的引物、2×等溫反應(yīng)緩沖液、Bst DNA聚合酶和染料共同組成。經(jīng)檢測(cè)驗(yàn)證，本發(fā)明試劑盒能快速、方便、高效、高特異性、高靈敏性的鑒別出牛羊肉與非牛羊肉。鑒別準(zhǔn)確率高達(dá)99％以上，檢測(cè)過(guò)程不需特殊的儀器，結(jié)果通過(guò)肉眼即能判定，整個(gè)檢測(cè)不超過(guò)1小時(shí)，單個(gè)樣品檢測(cè)成本不超過(guò)100元，規(guī)?；a(chǎn)后成本更低。本試劑盒廣泛適用于各檢測(cè)單位對(duì)牛羊肉的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)和專業(yè)判定，普通消費(fèi)者、專業(yè)檢測(cè)人員等均可輕松使用。本發(fā)明還包括牛羊肉快速鑒定試劑盒的構(gòu)建方法，利用該方法，可快速構(gòu)建特定的檢測(cè)試劑盒。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102534035SQ201210039640
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月21日
發(fā)明者萬(wàn)發(fā)春, 劉曉牧, 劉桂芬, 宋恩亮, 成海建, 譚秀文 申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所