專利名稱：一種鑒別牛羊肉真假的lamp檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及涉及利用LAMP技術(shù)鑒別牛羊肉的真假，屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
目前，國(guó)內(nèi)牛肉價(jià)格的飛速上漲和短缺導(dǎo)致國(guó)外的牛肉大量通過(guò)走私等途徑進(jìn)入中國(guó)，同時(shí)，國(guó)內(nèi)也出現(xiàn)了很多不和諧的現(xiàn)象，2011年4月份安徽首次曝光了利用牛肉膏等添加劑使豬肉變牛肉的事件，此后，在全國(guó)多個(gè)省市均發(fā)現(xiàn)了類似的產(chǎn)品。一時(shí)間，人們對(duì)牛肉等食品安全的關(guān)注成為了全社會(huì)的焦點(diǎn)。其實(shí)，牛肉市場(chǎng)面臨的豬肉變牛肉事件僅是冰山的一角。在社會(huì)上還大量存在著用雞肉、鴨肉等低價(jià)肉甚至是一些病死肉加工冒充牛肉的現(xiàn)象。面對(duì)目前牛羊肉市場(chǎng)存在的亂象，人們只能從色澤、氣味、彈性等多個(gè)方面進(jìn)行初步鑒別，但大多數(shù)消費(fèi)者都不可能掌握這種專業(yè)知識(shí)，很難對(duì)生牛肉進(jìn)行鑒別，對(duì)加工后的牛肉則更是難以鑒別。目前社會(huì)上缺乏牛羊肉的準(zhǔn)確鑒別技術(shù)。通過(guò)現(xiàn)代化的DNA鑒定技術(shù)，可以進(jìn)行鑒別。早在2008年新華每日電訊就報(bào)道過(guò)杭州一個(gè)市民買10元牛肉花2800 元進(jìn)行DNA鑒定的事件，2010年中新網(wǎng)報(bào)道了寧波一個(gè)消費(fèi)者花1800元通過(guò)DNA親子鑒定技術(shù)鑒別牛肉真假的事件，表明這種方法雖然能夠鑒別，但所需時(shí)間長(zhǎng)，費(fèi)用高。因此，迫切需要建立一種簡(jiǎn)單、廉價(jià)的牛羊肉鑒別方法，以維護(hù)牛羊肉市場(chǎng)的安全，保護(hù)廣大消費(fèi)者的身體健康。線粒體基因組具有種內(nèi)高度保守的特性，在肉制品和飼料的鑒別中越來(lái)越被受到重視。近年來(lái)，基于線粒體基因的鑒定方法不斷出現(xiàn)，包括PCR-RFLP、多重PCR、熒光定量 PCR等，這些方法都需要涉及到PCR、熒光定量PCR等昂貴儀器。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)國(guó)內(nèi)外已有方法在檢測(cè)技術(shù)上存在的缺點(diǎn)，在檢測(cè)技術(shù)上加以改進(jìn)。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)是由日本學(xué)者Notomi T等(2000)設(shè)計(jì)創(chuàng)立的，這種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)具有靈敏度高、反應(yīng)迅速，特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明利用LAMP技術(shù)和動(dòng)物線粒體DNA相結(jié)合對(duì)牛羊肉進(jìn)行鑒定，整個(gè)反應(yīng)可在恒溫狀態(tài)下在Ih之內(nèi)就可完成，而且可以通過(guò)肉眼觀察到反應(yīng)結(jié)果。本發(fā)明的技術(shù)方案是一種鑒別牛羊肉真假的LAMP檢測(cè)方法，(I)從GenBank中檢索獲得牛種屬特異性的保守序列，并進(jìn)行軟件比對(duì)分析，確定序列的準(zhǔn)確性；(2)根據(jù)步驟⑴的序列設(shè)計(jì)多組引物，每組引物包括一對(duì)外引物F3/ B3和一對(duì)內(nèi)引物FIP/BIP，引物設(shè)計(jì)通過(guò)登陸Eiken Chemical公司的在線軟件 PrimerExplore (http://www. primerexplorer. jp/e/)進(jìn)行；利用 LAMP 實(shí)時(shí)池度儀對(duì)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行特異性篩選，確定高度特異性的引物；(3)配置23 μ L LAMP反應(yīng)液，構(gòu)建成檢測(cè)體系；所述23 μ L LAMP反應(yīng)液含有 12. 5μ L 2X 等溫反應(yīng)緩沖液、I μ L 5μΜ Primer F3U μ L 5μΜ Primer Β3,2μ L20yMPrimer FIP、2yL 20 μ M Primer BIPU μ L Bst DNA 聚合酶、3· 5 μ L 水；其中2X 等溫反應(yīng)緩沖液含有40mM的三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽Tris-HCl (pH8. 8)、20mM的氯化鉀、16mM 的硫酸鎂、20mM的硫酸銨、20%的Tween20、l. 6M甜菜堿、2. 8mM dNTP。(4)按常規(guī)方法提取基因組DNA，取I μ L提取的基因組DNA和I μ L的熒光檢測(cè)試劑(Fluorescent Detection Reagent, FDR)加入 LAMP 反應(yīng)液中，使終反應(yīng)體積為 25 μ L, IOOOOrpm瞬時(shí)離心30秒混勻反應(yīng)液；(5)置60 V恒溫水浴中進(jìn)行LAMP擴(kuò)增；(6)根據(jù)反應(yīng)液顏色進(jìn)行陰陽(yáng)性判斷，若反應(yīng)液變成綠色，說(shuō)明待測(cè)樣品存在牛羊肉；若為桔黃色，則待測(cè)樣品不存在牛羊肉。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是提供了一種利用LAMP技術(shù)，準(zhǔn)確、廉價(jià)鑒別牛羊肉真假的標(biāo)準(zhǔn)方法。本方法具有眾多優(yōu)點(diǎn)，一是模板和引物制備簡(jiǎn)單，容易操作；二是具有高度的特異性，準(zhǔn)確性高達(dá)100%;三是具有高度的靈敏度，比普通PCR更為靈敏，僅需極少量的樣品即可(小于I克)；四是結(jié)果判定方便，通過(guò)肉眼觀察即可。但本方法暫時(shí)無(wú)法區(qū)分牛肉和羊肉。本發(fā)明可用于任何具備相應(yīng)儀器設(shè)備的部門進(jìn)行牛羊肉的真假鑒別，具有廣闊的市場(chǎng)前景和較大的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)效益。


圖I為5組LAMP引物進(jìn)行特異性篩選圖。圖I中引物自左向右順序依次為陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、引物I、引物2、引物3、引物4、引物5。圖2為各種畜禽DNA進(jìn)行LAMP檢測(cè)試驗(yàn)圖。圖2中自左向右DNA順序?yàn)殛?yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照，豬肉、牛肉、鴨肉、羊肉、兔肉；結(jié)果顯示第1、4、6管為綠色，其余的枯黃色。圖3為PCR檢測(cè)方法靈敏度示意圖，其中自左向右依次為以10-1、10-2.........
10-7稀釋度的Positive Control DNA(PC DNA)為模板的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的PCR檢測(cè)圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例II、儀器設(shè)備LAMP實(shí)時(shí)濁度儀LA-320C、普通水浴鍋。2、所用試劑除由生產(chǎn)廠家直接提供的以外，其它均為分析純，水為超純水。3、具體操作步驟(I)從GenBank中檢索獲得牛452bp 12s RNA序列，并進(jìn)行軟件比對(duì)分析，確定序列的準(zhǔn)確性。12S rRNA 序列如下GACCCAAACTGGGATTAGATACCCCACTATGCTTAGCCCTAAACACAG ATAATTACATAAACAAAATTATTCGCCAGAGTACTACTAGCAACAGCTTAAAACTCAAAGGACTTGGCGGTGCTTTA TATCCTTCTAGAGGAGCCTGTTCTATAATCGATAAACCCCGATAAACCTCACCAATTCTTGCTAATACAGTCTATAT ACCGCCATCTTCAGCAAACCCTAAAAAGGAAAAAAAGTAAGCGTAATTATGATACATAAAAACGTTAGGTCAAGGTG TAACCTATGAAATGGGAAGAAATGGGCTACATTCTCTACACCAAGAGAATCAAGCACGAAAGTTATTATGAAACCAA TAACCAAAGGAGGATTTAGCAGTAAACTAAGAATAGAGTGCTTAGTTGAATTAGGCCATGAAGCACGCACACACCGC CCGTCACCCTCCTCAAATA(SEQ NO. 5)(2)根據(jù)上述序列利用PrimerExplore軟件設(shè)計(jì)5組引物,進(jìn)行特異性篩選。引物I:
F3 CCTAAAAAGGAAAAAAAGTAAGCGB3 GCTTCATGGCCTAATTCAACFIP GAATGTAGCCCATTTCTTCCCATGATACATAAAAACGTTAGGTCAAGBIP TCTACACCAAGAGAATCAAGCACGGCACTCTATTCTTAGTTTACTGC引物2:F3 GCTTAAAACTCAAAGGACTTGGB3 AGCCCATTTCTTCCCATTFIP GCAAGAATTGGTGAGGTTTATCGGTATATCCTTCTAGAGGAGCCTBIP CGCCATCTTCAGCAAACCCTGTTACACCTTGACCTAACGT引物3:F3 AACAGCTTAAAACTCAAAGGAB3 AGCCCATTTCTTCCCATTFIP TGAGGTTTATCGGGGTTTATCGAGGCGGTGCTTTATATCCTTBIP CGCCATCTTCAGCAAACCCTGTTACACCTTGACCTAACGT引物4:F3 GCTTAGCCCTAAACACAGATB3 AGGGTTTGCTGAAGATGG FIP TAAAGCACCGCCAAGTCCTTTACATAAACAAAATTATTCGCCAGBIP TATCCTTCTAGAGGAGCCTGTTCGGTATATAGACTGTATTAGCAAGAA引物5:F3 CCCAAACTGGGATTAGATACCB3 CTGTATTAGCAAGAATTGGTGAFIP TGCTAGTAGTACTCTGGCGAATAATACTATGCTTAGCCCTAAACACBIP ACAGCTTAAAACTCAAAGGACTTGGGGTTTATCGGGGTTTATCGA(3)篩選LAMP弓丨物配置反應(yīng)液LAMP反應(yīng)液構(gòu)成為每23 μ L的LAMP反應(yīng)液中含有12. 5 μ L 2 X等溫反應(yīng)緩沖液、I. OuL 5 μ M Primer F3> I μ L 5 μ M Primer Β3>2 μ L 20 μ M Primer FIP>2 μ L20 μ M Primer BIPUuL Bst DNA聚合酶、3. 5 μ L水。其中2 X等溫反應(yīng)緩沖液由日本榮研化學(xué)株式會(huì)社提供，含有40mM的三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽(pH8. 8)、20mM的氯化鉀、16mM的硫酸鎂、20mM 硫酸銨、20% 的 Tween20、l. 6M 甜菜堿、2. 8mM dNTP。對(duì)⑵中所述的5對(duì)引物按照上面所述的體積加入LAMP反應(yīng)液中，同時(shí)加入I μ L 熒光檢測(cè)試劑和I μ L牛的基因組DNA，使得終反應(yīng)體積為25 μ L，樣品放置在LAMP濁度儀中進(jìn)行引物特異性的篩選。對(duì)濁度儀進(jìn)行一系列的參數(shù)設(shè)定之后，儀器每6秒檢測(cè)一次濁度，然后根據(jù)濁度來(lái)對(duì)引物進(jìn)行篩選(如圖I所示)。其中引物3反應(yīng)時(shí)間最短(大概在 40min左右)，其次是引物4 (大概在43min左右)和引物I (46min左右)，引物2和引物5 在60min內(nèi)未出(即顯陰性)。因此，確定引物3為最優(yōu)引物。(4)標(biāo)本的采集嚴(yán)格無(wú)菌采集各種畜禽DNA的新鮮肌肉組織，采用酚仿提取法提取組織樣的基因組DNA。(5)取I μ L提取的基因組DNA和I μ L的熒光檢測(cè)試劑(優(yōu)選為L(zhǎng)oopamp熒光檢測(cè)試劑)加入篩選得到的LAMP反應(yīng)液中，使終反應(yīng)體積為25 μ L，IOOOOrpm瞬時(shí)離心30秒混勻反應(yīng)液；同時(shí)設(shè)陰性、陽(yáng)性對(duì)照。(6)置60°C恒溫水浴中培養(yǎng)45分鐘進(jìn)行LAMP擴(kuò)增；(7)根據(jù)反應(yīng)液顏色進(jìn)行陰陽(yáng)性判斷，若反應(yīng)液變成綠色，說(shuō)明待測(cè)樣品存在牛羊肉，若為桔黃色，則待測(cè)樣品不存在牛羊肉。(8)靈敏度和特異性檢驗(yàn)采用豬肉、牛肉、羊肉、鴨肉、兔肉來(lái)檢測(cè)特異性，結(jié)果顯示，LAMP檢測(cè)體系的特異性測(cè)試良好(如圖2所示)。以ΙΟ'ΚΓ2.........1(Γ7 稀釋度的 Positive Control DNA (PC DNA)為模板分別進(jìn)
行LAMP和PCR比較兩種檢測(cè)方法的靈敏度，結(jié)果顯示，LAMP法的擴(kuò)增靈敏度比普通PCR法要高。普通PCR可以檢測(cè)到7個(gè)稀釋梯度中的第三個(gè)梯度(如圖3所示)，而LAMP法可以檢測(cè)到第四個(gè)梯度。實(shí)施例2從山東省內(nèi)屠宰廠生產(chǎn)線采集鮮牛肉樣品45個(gè)，鮮羊肉樣品32個(gè)，鮮雞肉樣品70 個(gè)，鮮鴨肉樣品50個(gè)，鮮兔肉樣品30個(gè)，應(yīng)用實(shí)施例I的方法進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果如下表I山東省內(nèi)屠宰廠生產(chǎn)線牛羊肉檢測(cè)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種鑒別牛羊肉真假的LAMP檢測(cè)方法，其特征是，(1)從GenBank中檢索獲得牛種屬特異性的保守序列，并進(jìn)行軟件比對(duì)分析，確定序列的準(zhǔn)確性；(2)根據(jù)步驟(I)的序列設(shè)計(jì)多組引物，每組引物包括一對(duì)外引物F3/B3和一對(duì)內(nèi)引物 FIP/BIP ;并利用LAMP實(shí)時(shí)濁度儀對(duì)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行特異性篩選，確定高度特異性的引物；(3)配置23μ L LAMP反應(yīng)液，構(gòu)建成檢測(cè)體系；所述23 μ L LAMP反應(yīng)液含有12. 5 μ L 2Χ 等溫反應(yīng)緩沖液、I μ L 5μΜ Primer F3U μ L 5μΜ Primer Β3,2μ L20yM Primer FIP、2yL 20 μ M Primer BIPUuL Bst DNA聚合酶、3· 5 μ L水；其中2Χ等溫反應(yīng)緩沖液含有40mM的pH8. 8的三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽、20mM的氯化鉀、16mM的硫酸鎂、20mM的硫酸銨、20% 的 Tween20、l. 6M 甜菜堿、2. 8mM dNTP ；(4)按常規(guī)方法提取基因組DNA，取Iμ L提取的基因組DNA和I μ L的熒光檢測(cè)試劑加入LAMP反應(yīng)液中，使終反應(yīng)體積為25 μ L，IOOOOrpm瞬時(shí)離心30秒混勻反應(yīng)液；(5)置60°C恒溫水浴中進(jìn)行LAMP擴(kuò)增；(6)根據(jù)反應(yīng)液顏色進(jìn)行陰陽(yáng)性判斷，若反應(yīng)液變成綠色，說(shuō)明待測(cè)樣品存在牛羊肉； 若為桔黃色，則待測(cè)樣品不存在牛羊肉。
2.如權(quán)利要求I所述的一種鑒別牛羊肉真假的LAMP檢測(cè)方法，其特征是，引物設(shè)計(jì)通過(guò)登陸Eiken Chemical公司的在線軟件PrimerExplore進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種鑒別牛羊肉真假的LAMP檢測(cè)方法，屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域。它從GenBank中檢索獲得牛種屬特異性的保守序列設(shè)計(jì)引物，并利用LAMP實(shí)時(shí)濁度儀對(duì)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行特異性篩選；然后配置LAMP反應(yīng)液，構(gòu)建成檢測(cè)體系；再取1μL提取的基因組DNA和1μL的熒光檢測(cè)試劑加入LAMP反應(yīng)液中進(jìn)行LAMP擴(kuò)增；根據(jù)反應(yīng)液顏色進(jìn)行陰陽(yáng)性判斷，若反應(yīng)液變成綠色，說(shuō)明待測(cè)樣品存在牛羊肉。該方法可方便、準(zhǔn)確的檢測(cè)出被檢肉產(chǎn)品是否存在牛羊肉。本方法的模板、引物制備簡(jiǎn)單，特異性和敏感度高，檢測(cè)結(jié)果可通過(guò)肉眼直接觀測(cè)，可滿足具備相應(yīng)設(shè)備的各檢測(cè)部門進(jìn)行檢測(cè)的需要，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102586436SQ20121003951
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月21日
發(fā)明者萬(wàn)發(fā)春, 劉曉牧, 劉桂芬, 宋恩亮, 成海建, 譚秀文 申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所