一種試劑盒及其檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)療器械技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測孕期先兆子癇或子癇的試劑盒 及其檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 孕期早癇是一種病發(fā)原因復(fù)雜的綜合征，如果不及時治療，可發(fā)展為子癇，危及生 命。主要癥狀有高血壓、蛋白尿，水腫，驚厥，腎功能損傷等，已成為世界上孕婦致死率最高 的一種疾病，目前具體病因不明。有研究證明，胎盤產(chǎn)生的一種導(dǎo)致易感婦女母體血管內(nèi)皮 功能障礙的物質(zhì)可能是早癇病發(fā)的其中一個原因。血壓升高是該疾病最明顯的標(biāo)志，同時 造成對產(chǎn)婦內(nèi)皮，腎臟和肝臟的損害，并釋放血管收縮因子。
[0003] 早癇在全球孕婦中發(fā)病率為6-8 %，通常發(fā)病于妊娠二期晚期或妊娠三期，大部分 在孕期32周之后發(fā)?。?2周前發(fā)病被認(rèn)為是早期發(fā)?。?。極少數(shù)孕婦會在孕期20周發(fā)病。 初次懷孕的孕婦發(fā)病率最高，并且隨著妊娠次數(shù)的增加，該疾病發(fā)病率大幅度降低。早癇多 發(fā)于具有高血壓史，糖尿病史，肥胖癥史，自身免疫性疾病史如狼瘡，和多胎妊娠（雙胞胎 或多胞胎）的孕婦中，其發(fā)病過程因人而異，大多數(shù)病例可以在分娩前被確診。少數(shù)病例在 分娩后六周才被確診，稱為"產(chǎn)后早癇"。確診后除了剖腹產(chǎn)或引產(chǎn)手術(shù)，沒有其他治療方 式。早癇是最常見的的妊娠綜合癥，同時影響母親和胎兒，導(dǎo)致早產(chǎn)兒甚至對母嬰造成生命 危險。
[0004] 傳統(tǒng)上早癇的確診標(biāo)志是孕期高血壓（兩個獨立的至少相隔六小時的測量值，收 縮壓為140以上和/或舒張壓為90以上）和24小時尿液樣本中的蛋白含量高于300毫克 (蛋白尿）。比基線血壓（BP)高30毫米汞柱的收縮壓或高15毫米汞柱的舒張壓，不能達(dá) 到140/90的絕對標(biāo)準(zhǔn)，仍然被認(rèn)為是重要發(fā)病信號，但并不能就此確診。腫脹或水腫（尤 其是在手和臉）最初曾被認(rèn)為是診斷早癇的一個重要標(biāo)志，但目前的醫(yī)學(xué)實踐證明，只有 高血壓和蛋白尿可以作為診斷標(biāo)準(zhǔn)。
[0005] 雖然早癇是一種致命性疾病，但其早期發(fā)病通常無癥狀。而且一般情況下，早癇的 信號都不是特異性的，比如孕期驚厥，在懷孕過程中，其他原因比子癇更容易導(dǎo)致驚厥。因 此早癇的早期診斷一直是醫(yī)學(xué)界無法攻克的一個難題。
[0006] 在早癇病人的癥狀中，一種鈉鉀栗抑制因子-內(nèi)源性洋地黃樣因子（endogenous digitalis-like factor，EDLF)水平的升高，是早癇的重要標(biāo)志。這種因子能夠?qū)е卵獕?升高，存在于人體和動物組織及體液中，其化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性與植物洋地黃中提取的類 固醇強(qiáng)心劑相似，故名"洋地黃樣因子"。此因子能夠以與地高辛等強(qiáng)心劑類似的機(jī)制結(jié)合 到鈉鉀栗上，并抑制其活性。
[0007] 為了實現(xiàn)對妊娠早癇的早期診斷，達(dá)到早期治療的目的，需要以地高辛抗體作為 工具，開發(fā)一種可以特異性精確測量樣品中內(nèi)源性洋地黃樣因子的方法，并制成操作簡便 快捷的試劑盒。CN 103439492 B提供了一種試劑盒，包括：一抗地高辛抗體12微克/毫升、 二抗鼠抗羊1865父107摩爾/升、3!1標(biāo)記羊角拗苷甲為10(^/臟 〇1、濃度為20%聚乙二醇 6000水溶液、pH = 7. 4的磷酸緩沖液、3H閃爍液；含有或者不含有羊角拗苷甲。該試劑盒 具有操作簡單方便、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點，并且能夠穩(wěn)定可靠的早期診斷孕期子癇， 為之后的治療提供有利依托。然而，由于其活性成分為蛋白質(zhì)類的抗體，不能反復(fù)凍存，對 此試劑盒的保存和攜帶帶來了極大的障礙，嚴(yán)重影響其推廣和應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于提供一種凍存后復(fù)蘇效果極佳，可經(jīng)解凍復(fù)蘇后直接使用，且 操作簡單方便、靈敏度高、特異性強(qiáng)，能夠穩(wěn)定可靠的早期診斷孕期子癇的試劑盒及其檢測 方法。
[0009] 為達(dá)到以上目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0010] 本發(fā)明所述的早癇為先兆子癇。
[0011] 第一方面，本發(fā)明提供一種試劑盒，其包括以下組份：
[0012] -抗地高辛抗體、
[0013] 二抗鼠抗羊IgG、
[0014] 3H標(biāo)記羊角拗苷甲、
[0015] 三羥甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸二鈉的混合溶液、
[0016] 聚乙二醇6000水溶液、
[0017] 3!1閃爍液；和
[0018] 含有或不含有羊角拗苷甲。
[0019] 其中，不含有羊角拗苷甲的試劑盒，可以按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線 后，加入試劑盒說明書中，使用試劑盒人員可以按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算內(nèi)源性洋地黃因子的濃 度。本發(fā)明中的組分混合后，可以起到良好的凍存后復(fù)蘇效果，可經(jīng)解凍復(fù)蘇后直接使用， 而且可以反復(fù)凍存而不影響其使用。由于本發(fā)明的主要原料為抗體類物質(zhì)，屬于有活性的 蛋白質(zhì)；在一般條件下進(jìn)行反復(fù)凍存會使蛋白質(zhì)易于產(chǎn)生冰晶，聚集而失去活性，形成沉 淀；與現(xiàn)有技術(shù)不同的是，本發(fā)明特別添加了三羥甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸二鈉，由于 分子間氫鍵和共價鍵的作用，使反復(fù)凍融后蛋白的疏水氨基酸殘基不被暴露而包覆于溶液 分子的間隙內(nèi)部，因此不會聚合形成蛋白沉淀，不會產(chǎn)生變性的現(xiàn)象。另外，由于三羥甲基 氨基甲烷和乙二胺四乙酸二鈉形成的包覆層具有間隙，因此抗體可以與抗原接觸，不影響 其作用的發(fā)揮。
[0020] 優(yōu)選地，所述一抗地高辛抗體的濃度為5-15微克/毫升，例如可以是5微克/毫 升、6微克/毫升、7微克/毫升、8微克/毫升、9微克/毫升、10微克/毫升、11微克/暈 升、12微克/_升、13微克/毫升、14微克/毫升或15微克/毫升。
[0021] 優(yōu)選地，所述二抗鼠抗羊IgG的濃度為4-8X10 7摩爾/升，例如可以是4X10 7 摩爾/升、4.5X10 7摩爾/升、5X10 7摩爾/升、5.5X10 7摩爾/升、6X10 7摩爾/升、 6. 5X10 7摩爾/升、7X10 7摩爾/升、7. 5X10 7摩爾/升或X 10 7摩爾/升。
[0022] 優(yōu)選地，所述3H標(biāo)記羊角拗苷甲的濃度為7-17Ci/mmol，例如可以是7Ci/mmol、 8Ci/mmol、9Ci/mmol、1OCi/mmol、11Ci/mmol .12Ci/mmol、13Ci/mmol、14Ci/mmol、15Ci/ mmol、16Ci/mmol 或 17Ci/mmol〇
[0023] 優(yōu)選地，所述混合溶液中三羥甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸二鈉的質(zhì)量比為I : (0· 25-0. 75)，例如可以是 I :0· 25、1 :0· 3、1 :0· 35、1 :0· 4、1 :0· 45、1 :0· 5、1 :0· 55、1 :0· 6、 1 :0. 65、I :0.7或1 :0. 75。所述三羥甲基氨基甲烷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13-28%，例如可以是 13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27% 或 28%〇
[0024] 優(yōu)選地，所述聚乙二醇6000水溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15-30%，例如可以是15%、 16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29% 或 30%。 其中，所述一抗地高辛抗體的優(yōu)選濃度為12 μ g/mL，制備方法為取0. 12mg地高辛抗體，溶 于IOmL去離子水中，輕輕混合均勻，避免使用攪拌器。所述聚乙二醇6000水溶液的優(yōu)選濃 度為20%，制備方法為取20mg PEG6000,置于IOOmL去離子水中，用攪拌器充分?jǐn)嚢?，使?體溶解，充分混勻。所述作為參照的非放射性3H標(biāo)記羊角拗苷甲標(biāo)準(zhǔn)品的優(yōu)選濃度梯度分 別為 2nM，5nM，10nM，20nM，50nM，0· IM 及 0· 2M。
[0025] 本發(fā)明所述的nM為納摩爾/升；本發(fā)明所述的M為摩爾/升。
[0026] 本發(fā)明所述的試劑盒需要可以測量3H放射性的儀器設(shè)備進(jìn)行測量。（設(shè)備名為 scintillation counter。任何做放射性實驗的實驗室都有，操作過程為把樣品放進(jìn)去，運(yùn) 行操作軟件，直接出結(jié)果。）
[0027] 上述所述的試劑盒用于檢測人體血清，胎盤組織分泌液，以及冷凍胎盤組織中的 內(nèi)源性洋地黃樣因子的含量。
[0028] 上述所述的試劑盒用于檢測用于檢測檢孕期先兆子癇或子癇。
[0029] 試劑盒用于檢測孕期先兆子癇和子癇的方法為：
[0030] (1)采集胎盤，切成2cmX