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一種提高樣品檢測(cè)精度和準(zhǔn)確性的生物樣品采集方法、裝置、系統(tǒng)、生物樣品穩(wěn)定試劑及應(yīng)用

文檔序號(hào):8941626閱讀:649來源:國(guó)知局
一種提高樣品檢測(cè)精度和準(zhǔn)確性的生物樣品采集方法、裝置、系統(tǒng)、生物樣品穩(wěn)定試劑及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物樣品采集、運(yùn)輸、存儲(chǔ)、檢測(cè)技術(shù),具體涉及一種提高樣品檢測(cè)精 度和準(zhǔn)確性的生物樣品采集方法、裝置、系統(tǒng)、生物樣品穩(wěn)定試劑及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 在生化檢驗(yàn)和相關(guān)領(lǐng)域中,通常需要收集、存儲(chǔ)、并在相當(dāng)一段時(shí)間內(nèi)保存生物樣 品,比如動(dòng)物組織、血液、細(xì)胞、細(xì)胞組分、蛋白和核酸等,直到該樣品得到檢驗(yàn)。例如,在組 織學(xué)、細(xì)胞學(xué)、腫瘤學(xué)、遺傳學(xué)、病毒學(xué)、血液學(xué)、免疫學(xué)和蛋白質(zhì)的相關(guān)研究中,器官以及其 組成部分通常保存在防腐溶液中。樣品的好壞直接決定了生化檢驗(yàn)的結(jié)果的可信度。影響 檢驗(yàn)結(jié)果可重復(fù)性的最大因素是原始樣品的分析前變異。
[0003] 生物材料和樣品的完整性對(duì)其生化檢驗(yàn)的精確度及準(zhǔn)確性至關(guān)重要。本發(fā)明涉及 到的生物材料和樣品包括DNA、RNA、血液、尿液、排泄物、口腔標(biāo)本、細(xì)菌、古細(xì)菌、病毒、噬菌 體、植物、藻類、酵母菌、微生物、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物、復(fù)制的DNA、蛋白質(zhì)、酶、多肽、真核生 物、原核生物、細(xì)胞、組織、生殖細(xì)胞、干細(xì)胞以及疫苗。以上生物材料被大量應(yīng)用在諸多領(lǐng) 域,包括但不限于教學(xué)輔助和疾病的診斷與治療。
[0004] 這些樣品通常從適當(dāng)渠道取得并登記儲(chǔ)存以備未來的使用和分析。一般情況下樣 品需在要由冰、干冰或者其他冷凍設(shè)備創(chuàng)造的冷藏環(huán)境中運(yùn)輸和保存,其目的在于使樣品 保持完整、無菌并且穩(wěn)定。然而對(duì)于那些需要在不同國(guó)家甚至大洲運(yùn)輸?shù)臉悠穪碚f,由于運(yùn) 輸途中缺乏冷藏設(shè)備所必須的供電裝置,樣品無法實(shí)現(xiàn)足夠長(zhǎng)時(shí)間的低溫保存。
[0005] 在很多生化研究中,分離完整的RNA是必不可少的一步。例如反轉(zhuǎn)錄mRNAs的復(fù) 制,和當(dāng)下流行的雜交法分析mRNA的豐度。在我們對(duì)乳酸脫氫酶基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究 中,需要從不同哺乳動(dòng)物組織中的多個(gè)樣品提取大量的RNA,而這必不可少的一步卻是傳統(tǒng) 方法所無法很好完成的。基于異硫氰酸胍的方法對(duì)動(dòng)物組織效果不佳,因?yàn)榕c細(xì)胞不同的 是,用此方法處理過得組織含有大量碎片,并會(huì)與溶液中的RNA作用,導(dǎo)致在CSCl離心法分 離RNA的過程中,一部分RNA會(huì)吸附在離心管壁上,從而降低了分離的RNA的濃度。加入肝 素的緩沖溶液可以減少RNA的吸附,但其代價(jià)昂貴并且效果不穩(wěn)定。
[0006] 有文獻(xiàn)報(bào)道稱金精三羧酸(ATA)是一種有效的抑制劑,它可以抑制包括核糖核酸 酶在內(nèi)的許多與核酸結(jié)合的酶的活性。隨后有研究表明在一系列核糖核酸抑制劑中,ATA效 果最佳,即在25°C分離老鼠和蟾蜍肝臟細(xì)胞RNA的實(shí)驗(yàn)中,加入ATA的樣品中的RNA的濃度 和長(zhǎng)度都保持的最好。ATA抑制核糖核酸酶活性的原理是與RNA直接競(jìng)爭(zhēng)該酶上的活性中 心,從而降低RNA與核糖核酸酶結(jié)合的概率。
[0007] 然而,ATA也會(huì)與RNA或DNA結(jié)合,從而導(dǎo)致用該方法分離出的RNA或DNA中混有 相當(dāng)濃度的ATA,可能對(duì)生物樣品的檢驗(yàn)產(chǎn)生影響。
[0008] 通過有識(shí)別力的標(biāo)記物標(biāo)記特定的白細(xì)胞從而檢測(cè)其含量已經(jīng)成為一種常規(guī)的 檢測(cè)藥物是否有效的方法。該方法已經(jīng)應(yīng)用于包括HIV/AIDS在內(nèi)的多種疾病。實(shí)際上用 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+T細(xì)胞含量是當(dāng)下檢驗(yàn)病人接受抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療效果的黃金標(biāo)準(zhǔn)。 然而此方法的一個(gè)重要局限在于隨著樣品儲(chǔ)存和運(yùn)輸時(shí)間的延長(zhǎng),表型標(biāo)記物變得越來越 不穩(wěn)定。美國(guó)疾病控制預(yù)防中心出臺(tái)標(biāo)準(zhǔn),建議對(duì)CD4+T細(xì)胞的分析應(yīng)該在用含有K3EDTA 或者肝素的血液采集管收集樣品后的72小時(shí)內(nèi)完成。但是一般情況下,來自存放超過48小 時(shí)的樣品的檢驗(yàn)結(jié)果就被認(rèn)為不可信。因此延長(zhǎng)樣品在室溫下保存的壽命會(huì)減少臨床檢驗(yàn) 中的誤差,從而提高了流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)病人生理指標(biāo)的可重復(fù)性。另外,延長(zhǎng)血液樣品室溫 保存時(shí)間可能減少臨床上進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)的整體成本。運(yùn)輸?shù)某杀疽矔?huì)降低因?yàn)闃悠凡辉?需要隔夜送達(dá)。對(duì)檢驗(yàn)方來說,由于幾天的樣品可以集中處理,從而節(jié)省了儀器運(yùn)轉(zhuǎn)、維護(hù) 的成本,也節(jié)省了人力。最后提高樣品在室溫下的穩(wěn)定性減少了過期樣品的數(shù)量,從而節(jié)省 了樣品重新采集及處理費(fèi)用。延長(zhǎng)樣品保存時(shí)間最大的價(jià)值體現(xiàn)在欠發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)。住 在農(nóng)村地區(qū)的病人由于遠(yuǎn)離往往位于城市中的醫(yī)院或?qū)嶒?yàn)室,從而無法將血液樣品及時(shí)送 達(dá)。根據(jù)聯(lián)合國(guó)艾滋病規(guī)劃署2003年底的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù),世界范圍內(nèi)大概有四千萬人口感染了 HIV/AIDS,將近三分之二的感染人口住在撒哈拉以南非洲(聯(lián)合國(guó)艾滋病規(guī)劃署2004年數(shù) 據(jù))。最近的報(bào)告顯示資源匱乏的國(guó)家缺乏診斷和監(jiān)測(cè)艾滋病感染人群的手段,部分原因是 由于血液樣品在送達(dá)實(shí)驗(yàn)室之前就已經(jīng)變質(zhì)。為了克服樣品運(yùn)輸過程中變質(zhì)的問題,發(fā)展 流式細(xì)胞檢測(cè)分析法以外的其他方法成為了必須。其中最著名的是ELISA TRAx CD4檢測(cè) 試劑盒(T Cell Diagnostics, Cambridge, MA, USA)。當(dāng)樣品濃度高于200細(xì)胞每微升的時(shí) 候,該方法取得了與流式細(xì)胞術(shù)類似的檢驗(yàn)結(jié)果。但是當(dāng)細(xì)胞濃度低于200細(xì)胞每微升時(shí), 由于該方法無法給出準(zhǔn)確結(jié)果使得38%的病人無法得到診斷。值得一提的是TRAx檢測(cè)試 劑盒不久后就將停止生產(chǎn),使得重復(fù)已發(fā)表的實(shí)驗(yàn)結(jié)果困難重重。
[0009] 代謝抑制劑:以下所述代謝抑制劑的作用得到了檢測(cè):碘乙酸鈉、氟化鈉、氟代乙 酸鈉、丙二酸鈉、2, 4-二硝基苯、疊氮化鈉、烏本苷和環(huán)己酰亞胺。其用于檢測(cè)時(shí)的濃度均 為10 3M。能夠抑制糖酵解過程的碘乙酸鹽對(duì)細(xì)胞吞噬作用同樣有強(qiáng)烈抑制效果。這個(gè)現(xiàn)象 證實(shí)了糖酵解是細(xì)胞吞噬作用的主要能量來源。與此相反,氟化物雖然也能有效抑制糖酵 解過程,但是對(duì)細(xì)胞吞噬作用并沒有影響。其原因可能在于氟化物只能在體外非生理溫度 (〇°C )情況下阻礙無氧糖酵解過程。氟乙酸鹽和丙二酸鹽是兩種干擾克雷布斯循環(huán)(檸檬 酸循環(huán))的化合物,并不抑制細(xì)胞吞噬作用,但是眾所周知的是在巨噬細(xì)胞中克雷布斯循 環(huán)的活性受到了極大的抑制。2, 4-二硝基苯和疊氮化鈉,作為抑制氧化磷酸化過程的兩種 化合物,與細(xì)胞接觸三小時(shí)后即產(chǎn)生對(duì)細(xì)胞吞噬作用的抑制效果。烏本苷阻礙Na +和K +通 過細(xì)胞膜的運(yùn)輸,干擾了細(xì)胞膜的正常運(yùn)動(dòng),從而抑制了細(xì)胞吞噬作用。環(huán)己酰亞胺影響細(xì) 胞吞噬作用的機(jī)理還在進(jìn)一步調(diào)查當(dāng)中。這類化合物可以抑制蛋白質(zhì)的合成,很有可能是 通過對(duì)細(xì)胞膜再生的影響來調(diào)控細(xì)胞吞噬作用。
[0010] 固定劑:在組織學(xué)、病理學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域,固定是組織切片準(zhǔn)備的關(guān)鍵一步, 它可以保持生物組織不衰退,從而使組織不發(fā)生自溶和腐爛。組織的結(jié)構(gòu)是由細(xì)胞周圍大 分子的形狀和大小來決定的。細(xì)胞內(nèi)的大分子主要是蛋白和核酸。固定作用可以終止任何 進(jìn)行中的生化反應(yīng),也可以增強(qiáng)相關(guān)組織的機(jī)械強(qiáng)度和穩(wěn)定性。組織固定的廣泛意義在于 準(zhǔn)備染過色的組織薄切片時(shí)保持細(xì)胞和組織不受損壞。其作用機(jī)理為通過凝固的方式使蛋 白質(zhì)變性,或形成加成化合物,或二者兼有。能與兩種不同的大分子反應(yīng)并將它們結(jié)合在一 起的化合物通常能最有效的穩(wěn)定這些大分子的結(jié)構(gòu),這種現(xiàn)象被稱作交聯(lián)。固定組織有以 下幾種目的:第一,殺死該組織從而防止自我分解和腐敗。第二,保持生物樣品(組織或細(xì) 胞)的自然狀態(tài)從而取得可靠性高的檢驗(yàn)結(jié)果。一個(gè)好的固定劑需滿足以下幾個(gè)條件:第 一,使體內(nèi)固有的生物大分子失活一特別是可以消化或破壞樣品蛋白水解酶。第二,保護(hù)樣 品免收外界干擾。固定劑對(duì)組織樣本中存在或者固定后增殖的大多數(shù)常見微生物是有毒性 的(尤其是細(xì)菌)。
[0011]另外,許多固定劑可以通過化學(xué)作用改變被固定材料的性質(zhì),使得它對(duì)于機(jī)會(huì)性 微生物(opportunistic microorganisms)不具有誘惑性(消化不了或者存在毒性)。最 后,固定劑通??梢栽诜肿铀礁淖兗?xì)胞或組織來增強(qiáng)它們的機(jī)械強(qiáng)度和穩(wěn)定性。這種增 強(qiáng)的強(qiáng)度與剛度可以更好地保護(hù)樣本的形態(tài)(形態(tài)與結(jié)構(gòu))用于后期分析。
[0012] PCR聚合酶抑制劑:Taq聚合酶或多或少可以被生化實(shí)驗(yàn)或分子生物學(xué)試驗(yàn)中使 用的多種化學(xué)物質(zhì)抑制活性。這些化學(xué)物質(zhì)包括DMSO、EDTA、鹽酸胍鹽、尿素、瓊脂和瓊脂 糖。DNA分離流程中的某些化學(xué)物質(zhì)也具有抑制作用,>5mM的醋酸鈉、0. 005%甲基溴化銨、 0. 005%的鈉十二烷基硫酸鹽或者>20%的甲酰胺,在給定的濃度中這些化學(xué)物質(zhì)都屬于完 全抑制劑。其他重要的抑制因素包括RNA酶抑制劑金精三羧酸(ATA)和血液抗凝劑等,它在 低至0. 01ug/ml便具有抑制PCR擴(kuò)增的作用。植物類多糖如多聚糖、酸性粘多糖、茶多酚、 米淀粉、果膠、硫酸葡聚糖和β-葡聚糖等也具有一定的抑制性。最后,紫外照射聚苯乙烯 類塑料,這常用于如微量滴定盤的殺毒滅菌,可以釋放出水溶性Taq聚合酶抑制劑。
[0013] 防腐劑:防腐劑是一種添加到包括食物、藥品、顏料、生物樣品、木材和飲料等產(chǎn)品 中的物質(zhì),它可以阻止細(xì)菌生長(zhǎng)造成的腐敗變質(zhì)作用或者其他不良化學(xué)變化。通常來說防 腐可以通過兩種途徑來實(shí)現(xiàn):化學(xué)方法和物理方法。化學(xué)防腐需要添加化學(xué)物質(zhì)進(jìn)產(chǎn)品中。 物理防腐需要冷藏或者干燥。他們運(yùn)用于食物、化妝品和多種其他產(chǎn)品中。食物防腐添加劑 可以減少食物
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