鑒定氣單胞菌屬的試劑盒和方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了鑒定氣單胞菌屬的試劑盒和方法，具體地，本發(fā)明提供了一種用于鑒定氣單胞菌屬的試劑盒，包括以下鑒定組分：(i)第一鑒別培養(yǎng)基或用于配制所述第一鑒別培養(yǎng)基的試劑，所述的第一鑒別培養(yǎng)基為克氏雙糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)基(KIA)；(ii)第二鑒別培養(yǎng)基或用于配制所述第二鑒別培養(yǎng)基的試劑，所述的第二鑒別培養(yǎng)基為AHM培養(yǎng)基；和(iii)第三鑒別培養(yǎng)基或用于配制所述第三鑒別培養(yǎng)基的試劑，所述的第三鑒別培養(yǎng)基為葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基。用本發(fā)明的試劑盒對氣單胞菌屬進行鑒定，不僅可顯著降低假陽性和假陰性結(jié)果，還可以提高菌株鑒定的敏感性和特異性。
【專利說明】
鑒定氣單胞菌屬的試劑盒和方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及細菌鑒定領(lǐng)域，具體地，涉及鑒定氣單胞菌屬的試劑盒和方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 氣單胞菌屬是一種重要的食源性、水源性病原體，在食物鏈和自然界廣泛存在，至 今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過30個種，可導致人類食源性疾病及腸道外感染，以及水棲、魚介(殼)類動物 患病死亡，造成比較沉重的人類疾病負擔及養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟損失。在我國，目前僅制定了嗜水氣 單胞菌的檢測方法(GB/T 18652-2002)，而對氣單胞菌屬的標準檢測鑒定方法尚未建立。部 分地區(qū)制定了方法不一的氣單胞菌初篩技術(shù)方法，但是存在對某些生化不典型菌株(如乳 糖陽性或甘露醇陰性等）的錯誤鑒定。國外專業(yè)實驗室通過基因測序的方法鑒定氣單胞菌， 但該技術(shù)需依賴分子診斷實驗室的儀器配置，這對大多數(shù)國內(nèi)基層實驗室來說存在軟件或 硬件不足?；谀壳叭蚴称钒踩蛧鴥?nèi)持續(xù)上升的食源性疾病防控形勢，眾多相關(guān)領(lǐng)域 的實驗室，包括臨床、公共衛(wèi)生、質(zhì)檢、出入境和動物獸醫(yī)等實驗室對各領(lǐng)域的篩檢樣品中 可疑氣單胞菌需要有更加專業(yè)的認識和鑒別能力，以及更加簡便、精確的鑒定方法，才能避 免錯誤的鑒定，從而在多源頭有效的控制氣單胞菌疫情的傳播和擴散。
[0003] 因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)一種改良的簡易鑒定氣單胞菌屬的方法，以滿足臨床、 公共衛(wèi)生和動物獸醫(yī)學實驗室在常規(guī)工作中用于快速鑒別氣單胞菌屬的需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種改良的簡易鑒定氣單胞菌屬的方法，以滿足臨床、公共 衛(wèi)生和動物獸醫(yī)學實驗室在常規(guī)工作中用于快速鑒別氣單胞菌屬的需求。
[0005] 本發(fā)明的另一目的是提供鑒定氣單胞菌屬的試劑盒。
[0006] 本發(fā)明第一方面提供了一種用于鑒定氣單胞菌屬的試劑盒，包括以下鑒定組分：
[0007] (i)第一鑒別培養(yǎng)基或用于配制所述第一鑒別培養(yǎng)基的試劑，所述的第一鑒別培 養(yǎng)基為克氏雙糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)基(KIA);
[0008] (ii)第二鑒別培養(yǎng)基或用于配制所述第二鑒別培養(yǎng)基的試劑，所述的第二鑒別培 養(yǎng)基為AHM培養(yǎng)基;和
[0009] (iii)第三鑒別培養(yǎng)基或用于配制所述第三鑒別培養(yǎng)基的試劑，所述的第三鑒別 培養(yǎng)基為葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0010] 在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還包括：
[0011] (iv)第四鑒別培養(yǎng)基或用于配制所述第四鑒別培養(yǎng)基的試劑，所述的第四鑒別培 養(yǎng)基為含低濃度氯化鈉的蛋白胨培養(yǎng)基，其中所述的低濃度指培養(yǎng)基中氯化鈉的濃度為0-lwt%，按第四鑒別培養(yǎng)基的總重量計;和
[0012] (V)第五鑒別培養(yǎng)基或用于配制所述第五鑒別培養(yǎng)基的試劑，所述的第五鑒別培 養(yǎng)基為含高濃度氯化鈉的蛋白胨培養(yǎng)基，其中所述的高濃度指培養(yǎng)基中氯化鈉的濃度為5-l〇wt%，按第五鑒別培養(yǎng)基的總重量計。
[0013] 在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還包括：
[0014] (iv)第四鑒別培養(yǎng)基或用于配制所述第四鑒別培養(yǎng)基的試劑，所述的第四鑒別培 養(yǎng)基為不含氯化鈉的蛋白胨培養(yǎng)基，即所述的培養(yǎng)基中氯化鈉的濃度為〇wt%，按第四鑒別 培養(yǎng)基的總重量計;和
[0015] (V)第五鑒別培養(yǎng)基或用于配制所述第五鑒別培養(yǎng)基的試劑，所述的第五鑒別培 養(yǎng)基為含高濃度氯化鈉的蛋白胨培養(yǎng)基，其中所述的高濃度指培養(yǎng)基中氯化鈉的濃度為 6wt%，按第五鑒別培養(yǎng)基的總重量計。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述克氏雙糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)基(KIA)包括:乳糖、葡萄糖、氯化 鈉、檸檬酸鐵銨、硫代硫酸鈉、瓊脂、酚紅、和蒸餾水。
[0017]在另一優(yōu)選例中，所述AHM培養(yǎng)基包括:蛋白胨、酵母浸膏、色氨酸、L-鳥氨酸、甘露 醇、肌醇、硫代硫酸鈉、檸檬酸鐵銨、瓊脂、溴甲酚紫、和蒸餾水。
[0018] 在另一優(yōu)選例中，所述葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基包括:牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、磷酸氫二 鈉、溴麝香草酚藍溶液、葡萄糖、和蒸餾水。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述第一鑒別培養(yǎng)基、第二鑒別培養(yǎng)基、第三鑒別培養(yǎng)基、第四 鑒別培養(yǎng)基、第五鑒別培養(yǎng)基為已經(jīng)配好的或未配好的。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，所述AHM培養(yǎng)基為半固體培養(yǎng)基。
[0021 ]在另一優(yōu)選例中，所述葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基。
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述蛋白胨培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒還包括標簽或說明書，所述標簽或說明書注明所述 試劑盒用于鑒定氣單胞菌屬。
[0024]在另一優(yōu)選例中，所述的標簽或說明書還記載了本發(fā)明第三方面中所述的鑒定氣 單胞菌屬的方法。
[0025] 本發(fā)明第二方面提供了一種培養(yǎng)基組合的用途，用于制備鑒定氣單胞菌屬的試劑 盒，其中所述的培養(yǎng)基組合包括：
[0026] (i)第一鑒別培養(yǎng)基，所述的第一鑒別培養(yǎng)基為克氏雙糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)基 (KIA);
[0027] (i i)第二鑒別培養(yǎng)基，所述的第二鑒別培養(yǎng)基為AHM培養(yǎng)基;和
[0028] (iii)第三鑒別培養(yǎng)基，所述的第三鑒別培養(yǎng)基為葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0029]本發(fā)明第三方面提供了一種非診斷性的鑒定氣單胞菌屬的方法，包括步驟：
[0030] (a)提供一待鑒定的微生物樣本；
[0031] (b)將所述的微生物接種于鑒別培養(yǎng)基，并觀察所述微生物樣本在各鑒別培養(yǎng)基 中的生長情況，
[0032]其中，所述的鑒別培養(yǎng)基包括：
[0033] (i)第一鑒別培養(yǎng)基，所述的第一鑒別培養(yǎng)基為克氏雙糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)基 (KIA);
[0034] (i i)第二鑒別培養(yǎng)基，所述的第二鑒別培養(yǎng)基為AHM培養(yǎng)基;和
[0035] (iii)第三鑒別培養(yǎng)基，所述的第三鑒別培養(yǎng)基為葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基；
[0036] (c)基于上一步驟中觀察到的生長情況確定所述微生物樣本的生化模式M，并將并 所述生化模式M與氣單胞菌屬評定標準進行比較，從而確定所述樣本是否屬于氣單胞菌屬。
[0037] 在另一優(yōu)選例中，所述的鑒別培養(yǎng)基還包括：
[0038] (iv)第四鑒別培養(yǎng)基，所述的第四鑒別培養(yǎng)基為含低濃度氯化鈉的蛋白胨培養(yǎng) 基，其中所述的低濃度指培養(yǎng)基中氯化鈉的濃度為〇-lwt%，按第四鑒別培養(yǎng)基的總重量 計;和
[0039] (v)第五鑒別培養(yǎng)基，所述的第五鑒別培養(yǎng)基為含高濃度氯化鈉的蛋白胨培養(yǎng)基， 其中所述的高濃度指培養(yǎng)基中氯化鈉的濃度為5-lOwt%，按第五鑒別培養(yǎng)基的總重量計。
[0040] 在另一優(yōu)選例中，所述的鑒別培養(yǎng)基還包括：
[0041] (iv)第四鑒別培養(yǎng)基，所述的第四鑒別培養(yǎng)基為不含氯化鈉的蛋白胨培養(yǎng)基，即 所述的低濃度指培養(yǎng)基中氯化鈉的濃度為〇wt%，按第四鑒別培養(yǎng)基的總重量計;和
[0042] (v)第五鑒別培養(yǎng)基，所述的第五鑒別培養(yǎng)基為含高濃度氯化鈉的蛋白胨培養(yǎng)基， 其中所述的高濃度指培養(yǎng)基中氯化鈉的濃度為6wt%，按第五鑒別培養(yǎng)基的總重量計。
[0043] 在另一優(yōu)選例中，所述的氣單胞菌屬評定標準包括以下4種生化模式：
[0044] 第一生化模式Ml:
[0045] 第一鑒別培養(yǎng)基中，斜面不產(chǎn)酸但底層產(chǎn)酸；
[0046] 第二鑒別培養(yǎng)基中，表層紫色、底層黃色、動力陽性、硫化氫陰性；
[0047]第三鑒別培養(yǎng)基中，產(chǎn)酸產(chǎn)氣；
[0048] 第四鑒別培養(yǎng)基中，溶液渾濁，細菌生長良好；
[0049] 第五鑒別培養(yǎng)基中，溶液澄清，細菌不生長；
[0050] 第二生化模式M2:
[0051 ]第一鑒別培養(yǎng)基中，斜面不產(chǎn)酸但底層產(chǎn)酸；
[0052]第二鑒別培養(yǎng)基中，不變色；
[0053]第三鑒別培養(yǎng)基中，產(chǎn)酸產(chǎn)氣；
[0054]第四鑒別培養(yǎng)基中，溶液渾濁，細菌生長良好；
[0055]第五鑒別培養(yǎng)基中，溶液澄清，細菌不生長；
[0056] 第三生化模式M3:
[0057]第一鑒別培養(yǎng)基中，斜面不產(chǎn)酸但底層產(chǎn)酸；
[0058]第二鑒別培養(yǎng)基中，表層紫色、底層黃色、動力陽性、硫化氫陰性；
[0059]第三鑒別培養(yǎng)基中，只產(chǎn)酸；
[0060]第四鑒別培養(yǎng)基中，溶液渾濁，細菌生長良好；
[0061]第五鑒別培養(yǎng)基中，溶液澄清，細菌不生長；
[0062] 第四生化模式M4:
[0063] 第一鑒別培養(yǎng)基中，斜面產(chǎn)酸且底層產(chǎn)酸；
[0064] 第二鑒別培養(yǎng)基中，表層紫色、底層黃色、動力陽性、硫化氫陰性；
[0065]第三鑒別培養(yǎng)基中，只產(chǎn)酸。
[0066] 第四鑒別培養(yǎng)基中，溶液渾濁，細菌生長良好；
[0067] 第五鑒別培養(yǎng)基中，溶液澄清，細菌不生長；
[0068] 在另一優(yōu)選例中，所述生化模式M符合上述Ml - M4中任何一種時，則評定所述微生 物樣本為氣單胞菌屬細菌。
[0069]在另一優(yōu)選例中，所述生化模式M符合上述Ml時，則評定所述微生物樣本為有嗜水 氣單胞菌/維隆氣單胞菌溫和變種。
[0070] 在另一優(yōu)選例中，所述生化模式M符合上述M2時，則評定所述微生物樣本為有維隆 氣單胞菌維隆變種。
[0071] 在另一優(yōu)選例中，所述生化模式M符合上述M3時，則評定所述微生物樣本為有豚鼠 氣單胞菌。
[0072] 在另一優(yōu)選例中，所述生化模式M符合上述M4時，則評定所述微生物樣本為有豚鼠 氣單胞菌乳糖陽性變種。
[0073] 在另一優(yōu)選例中，所述微生物樣本來源于臨床樣本、食品樣本、或外環(huán)境樣本。 [0074]應理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【具體實施方式】
[0075] 本發(fā)明人經(jīng)過長期廣泛而深入的研究，通過大量篩選和測試，首次意外地發(fā)現(xiàn)，用 含有第一鑒別培養(yǎng)基、第二鑒別培養(yǎng)基、第三鑒別培養(yǎng)基，以及任選的第四鑒別培養(yǎng)基和第 五鑒別培養(yǎng)基的試劑盒可有效鑒定氣單胞菌屬，顯著降低假陽性和假陰性的結(jié)果，并顯著 提高菌株鑒定的特異性(100% )和敏感性(100% )。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明人完成了本發(fā)明。
[0076] 試劑盒
[0077] 本發(fā)明提供了一種用于鑒定氣單胞菌屬的試劑盒，包括以下鑒定組分：
[0078] (i)第一鑒別培養(yǎng)基或用于配制所述第一鑒別培養(yǎng)基的試劑，所述的第一鑒別培 養(yǎng)基為克氏雙糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)基(KIA);
[0079] (ii)第二鑒別培養(yǎng)基或用于配制所述第二鑒別培養(yǎng)基的試劑，所述的第二鑒別培 養(yǎng)基為AHM培養(yǎng)基;和
[0080] (iii)第三鑒別培養(yǎng)基或用于配制所述第三鑒別培養(yǎng)基的試劑，所述的第三鑒別 培養(yǎng)基為葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0081 ]在一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還包括：
[0082] (iv)第四鑒別培養(yǎng)基或用于配制所述第四鑒別培養(yǎng)基的試劑，所述的第四鑒別培 養(yǎng)基為含低濃度氯化鈉的蛋白胨培養(yǎng)基，其中所述的低濃度指培養(yǎng)基中氯化鈉的濃度為〇-lwt%，按第四鑒別培養(yǎng)基的總重量計;和
[0083] (V)第五鑒別培養(yǎng)基或用于配制所述第五鑒別培養(yǎng)基的試劑，所述的第五鑒別培 養(yǎng)基為含高濃度氯化鈉的蛋白胨培養(yǎng)基，其中所述的高濃度指培養(yǎng)基中氯化鈉的濃度為5-l〇wt%，按第五鑒別培養(yǎng)基的總重量計。
[0084] 在本發(fā)明中，本發(fā)明的試劑盒中的各個鑒定組分之間的比例，以及各個鑒定組分 的含量不受特別限制。
[0085] 本發(fā)明的試劑盒中的各個鑒定組分可購買獲得，或用常規(guī)方法制備。
[0086]本發(fā)明的試劑盒可有效鑒定氣單胞菌屬，顯著降低假陽性和假陰性的結(jié)果，并顯 著提高菌株鑒定的特異性(100%)和敏感性(100%)。
[0087] 本發(fā)明的主要優(yōu)點包括：
[0088] (1)通過3個(優(yōu)選5個)生化反應管組合，可滿足臨床、公共衛(wèi)生、環(huán)境食品、畜牧動 物、獸醫(yī)實驗室在常規(guī)工作中氣單胞菌屬的鑒定的技術(shù)需要，省時、省力，易于操作，成本低 廉，具有很好的社會和經(jīng)濟效益。
[0089] (2)本發(fā)明的氣單胞菌屬鑒定方法可顯著降低假陽性和假陰性的結(jié)果，顯著提高 菌株鑒定的特異性(100%)和敏感性(100%)。
[0090] (3)本發(fā)明的鑒定方法使得氣單胞菌的鑒定方法更加標準化、規(guī)范化。
[0091 ] (4)本發(fā)明的方法更加簡便、且準確度高。
[0092]下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量 份數(shù)。
[0093]本發(fā)明所用的材料如無特別說明，均為市售產(chǎn)品。
[0094]實施例1對氣單胞菌屬的鑒定
[0095] 1.1準備5個生化反應管，管內(nèi)的鑒定組分分別如下所示：
[0096] (1)克氏雙糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)基(KIA):乳糖10.0g;葡萄糖1.0g;氯化鈉5.0g;梓檬 酸鐵銨0.5g;硫代硫酸鈉0.5g;瓊脂12.0g;酚紅0.025g;蒸餾水1000.0 mL，pH7.4。制法:將除 瓊脂和酚紅以外的各成分溶解于蒸餾水中，校正pH。加入瓊脂，加熱煮沸，以溶化瓊脂。加入 0.2 %酚紅水溶液12.5mL，搖勻。分裝試管，裝量宜多些，以便得到比較高的底層。121°C高壓 滅菌15min。放置高層斜面，置4°C冰箱保存?zhèn)溆?。使用方法：穿刺接種細菌培養(yǎng)物，經(jīng)36±1 °C培養(yǎng)24h，產(chǎn)酸顏色變黃色表示陽性反應，不變色者為陰性反應。
[0097] (2) AHM培養(yǎng)基：蛋白胨5.0g;酵母浸膏3.0g;蛋白胨9.0g ;色氨酸1 g; L-鳥氨酸 5.0g;甘露醇1.0g;肌醇10.0g;硫代硫酸鈉0.4g;檸檬酸鐵銨0.5g;瓊脂3.0g;溴甲酚紫 0.02g;蒸餾水1000.0mL，pH 6.7。制法:將除瓊脂和溴甲酚紫以外的各成分溶解于蒸餾水 中，校正pH。加入瓊脂，加熱煮沸，以溶化瓊脂。加入溴甲酚紫，搖勻。分裝小試管，每管4mL 121°C高壓滅菌，15min。置4°C冰箱保存?zhèn)溆?。使用方?穿刺接種細菌培養(yǎng)物，經(jīng)36 ± 1°C培 養(yǎng)24h，表層紫色、底層黃色、動力陽性、硫化氫陰性為陽性反應，不變色者為陰性反應。 [0098] (3) 0 %氯化鈉的蛋白胨水(培養(yǎng)基）：蛋白胨2.0g;蒸餾水100.0 mL，pH7.7。制法:配 制2 %的蛋白胨水，校正pH值，待溶解后分裝試管。121°C高壓滅菌，15min。置4 °C冰箱保存?zhèn)?用。使用方法:接種細菌培養(yǎng)物，經(jīng)36±1°C培養(yǎng)24h，溶液變渾濁表示陽性反應（即細菌生長 良好），溶液澄清者為陰性反應(即細菌不生長）。
[0099] (4) 6 %氯化鈉的蛋白胨水(培養(yǎng)基）：蛋白胨2.0g;氯化鈉6.0g;蒸餾水100.0 mL， pH7.7。制法:配制2 %的蛋白胨水，校正pH值，每瓶100.0 mL，加入氯化鈉6.0g，待溶解后分裝 試管。121°C高壓滅菌，15min。置4 °C冰箱保存?zhèn)溆?。使用方?接種細菌培養(yǎng)物，經(jīng)36 °C培養(yǎng) 24h，使用方法:接種細菌培養(yǎng)物，經(jīng)36 ± 1°C培養(yǎng)24h，溶液變渾濁表示陽性反應（即細菌生 長良好），溶液澄清者為陰性反應(即細菌不生長）。
[0100] (5)葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基:牛肉膏0.5g;蛋白胨l.Og;氯化鈉0.3g;磷酸氫二鈉0.2g; 〇 ? 2 %溴麝香草酚藍溶液1 ? 2mL;葡萄糖1 ? 0g;蒸餾水100 ? OmL，pH7 ? 6。制法:將牛肉膏、蛋白 胨、氯化鈉加溫溶于水中，校正PH，加入溴麝香草酚藍溶液后過濾，繼續(xù)加入葡萄糖，等完全 溶解后分裝于有一個倒置小管的試管中，每管3.〇 1111，于115°(：高壓滅菌，151^11。置4°(：冰箱 保存?zhèn)溆?。使用方?接種細菌培養(yǎng)物，經(jīng)36 ± 1°C培養(yǎng)24h，溶液顏色變黃表示產(chǎn)酸，小導管 內(nèi)出現(xiàn)氣泡表示產(chǎn)氣，不變色者為陰性反應。
[0101] 1.2鑒定方法
[0102]在選擇性或非選擇性培養(yǎng)基中分離得到可疑氣單胞菌，其單克隆菌株的新鮮培養(yǎng) 物經(jīng)氧化酶試驗鑒定為陽性的菌株，分別被接種于克氏雙糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)基(KIA)、AHM 培養(yǎng)基、0 %氯化鈉的蛋白胨水、6 %氯化鈉的蛋白胨水、葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，36 ± 1°C培養(yǎng) 24h后取出觀察結(jié)果，并依據(jù)生化結(jié)果報告，判斷是否為氣單胞菌。
[0103] 1.3鑒定結(jié)果
[0104] 表1
[0106] a:_/+:斜面不產(chǎn)酸、底層產(chǎn)酸;+/+:斜面產(chǎn)酸、底層產(chǎn)酸
[0107] b: + :產(chǎn)酸;03:產(chǎn)酸產(chǎn)氣
[0108] 結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明，該方法除了能夠快速準確鑒定典型生化的氣單胞菌 外，對于生化表型不典型的氣單胞菌同樣能夠達到甄別的效果，從而避免假陽性和假陰性 的發(fā)生。
[0109] 實施例2氣單胞菌屬鑒定的效果驗證
[0110] 對2012-2015年分離到的氣單胞菌陽性菌株進行比對驗證(其中臨床樣本分離株 254株，食品樣本分離株251株，外環(huán)境樣本分離株44株），結(jié)果如表2所不。結(jié)果顯不，用本發(fā) 明的方法鑒定的菌株敏感性為100.00%。
[0111] 表2氣單胞菌陽性菌株比對驗證結(jié)果
[0113] 發(fā)明人對河弧菌（ATCC3 3812)、弗尼氏弧菌（ATCC3 3 841 )、副溶血性弧菌 (ATCC33847)、創(chuàng)傷弧菌（ATCC27562)、類志賀鄰單胞菌（ATCC14029)、銅綠假單胞菌 (ATCC27853)等標準菌株菌株進行驗證，結(jié)果如表3所示。結(jié)果顯示，用本發(fā)明的方法鑒定的 菌株特異性為100. 〇〇 %。
[0114] 表3非氣單胞菌陽性菌株比對驗證結(jié)果
[0116] 因此，結(jié)果表明，本發(fā)明的方法具有顯著的菌株敏感性和特異性。
[0117] 在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨 引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范 圍。
【主權(quán)項】
1. 一種用于鑒定氣單胞菌屬的試劑盒，其特征在于，包括以下鑒定組分： (i) 第一鑒別培養(yǎng)基或用于配制所述第一鑒別培養(yǎng)基的試劑，所述的第一鑒別培養(yǎng)基 為克氏雙糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)基(KIA); (ii) 第二鑒別培養(yǎng)基或用于配制所述第二鑒別培養(yǎng)基的試劑，所述的第二鑒別培養(yǎng)基 為AHM培養(yǎng)基;和 (iii) 第三鑒別培養(yǎng)基或用于配制所述第三鑒別培養(yǎng)基的試劑，所述的第三鑒別培養(yǎng) 基為葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基。2. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還包括： (iv) 第四鑒別培養(yǎng)基或用于配制所述第四鑒別培養(yǎng)基的試劑，所述的第四鑒別培養(yǎng)基 為含低濃度氯化鈉的蛋白胨培養(yǎng)基，其中所述的低濃度指培養(yǎng)基中氯化鈉的濃度為〇-lwt%，按第四鑒別培養(yǎng)基的總重量計;和 (v) 第五鑒別培養(yǎng)基或用于配制所述第五鑒別培養(yǎng)基的試劑，所述的第五鑒別培養(yǎng)基 為含高濃度氯化鈉的蛋白胨培養(yǎng)基，其中所述的高濃度指培養(yǎng)基中氯化鈉的濃度為δ-?ΟΜ% ，按第五鑒別培養(yǎng)基的總重量計。3. -種培養(yǎng)基組合的用途，其特征在于，用于制備鑒定氣單胞菌屬的試劑盒，其中所述 的培養(yǎng)基組合包括： (i)第一鑒別培養(yǎng)基，所述的第一鑒別培養(yǎng)基為克氏雙糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)基(KIA); (i i)第二鑒別培養(yǎng)基，所述的第二鑒別培養(yǎng)基為AHM培養(yǎng)基;和 (i i i)第三鑒別培養(yǎng)基，所述的第三鑒別培養(yǎng)基為葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基。4. 一種非診斷性的鑒定氣單胞菌屬的方法，其特征在于，包括步驟： (a) 提供一待鑒定的微生物樣本； (b) 將所述的微生物接種于鑒別培養(yǎng)基，并觀察所述微生物樣本在各鑒別培養(yǎng)基中的 生長情況， 其中，所述的鑒別培養(yǎng)基包括： (i)第一鑒別培養(yǎng)基，所述的第一鑒別培養(yǎng)基為克氏雙糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)基(KIA); (i i)第二鑒別培養(yǎng)基，所述的第二鑒別培養(yǎng)基為AHM培養(yǎng)基;和 (i i i)第三鑒別培養(yǎng)基，所述的第三鑒別培養(yǎng)基為葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基； (c) 基于上一步驟中觀察到的生長情況確定所述微生物樣本的生化模式M，并將并所述 生化模式Μ與氣單胞菌屬評定標準進行比較，從而確定所述樣本是否屬于氣單胞菌屬。5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的鑒別培養(yǎng)基還包括： (iv) 第四鑒別培養(yǎng)基，所述的第四鑒別培養(yǎng)基為含低濃度氯化鈉的蛋白胨培養(yǎng)基，其 中所述的低濃度指培養(yǎng)基中氯化鈉的濃度為Ο-lwt%，按第四鑒別培養(yǎng)基的總重量計;和 (v) 第五鑒別培養(yǎng)基，所述的第五鑒別培養(yǎng)基為含高濃度氯化鈉的蛋白胨培養(yǎng)基，其中 所述的高濃度指培養(yǎng)基中氯化鈉的濃度為5-lOwt%，按第五鑒別培養(yǎng)基的總重量計。6. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的氣單胞菌屬評定標準包括以下4種生 化模式： 第一生化模式Ml: 第一鑒別培養(yǎng)基中，斜面不產(chǎn)酸但底層產(chǎn)酸； 第二鑒別培養(yǎng)基中，表層紫色、底層黃色、動力陽性、硫化氫陰性； 第三鑒別培養(yǎng)基中，產(chǎn)酸產(chǎn)氣； 第四鑒別培養(yǎng)基中，溶液渾濁，細菌生長良好； 第五鑒別培養(yǎng)基中，溶液澄清，細菌不生長； 第二生化模式M2: 第一鑒別培養(yǎng)基中，斜面不產(chǎn)酸但底層產(chǎn)酸； 第二鑒別培養(yǎng)基中，不變色； 第三鑒別培養(yǎng)基中，產(chǎn)酸產(chǎn)氣； 第四鑒別培養(yǎng)基中，溶液渾濁，細菌生長良好； 第五鑒別培養(yǎng)基中，溶液澄清，細菌不生長； 第三生化模式M3: 第一鑒別培養(yǎng)基中，斜面不產(chǎn)酸但底層產(chǎn)酸； 第二鑒別培養(yǎng)基中，表層紫色、底層黃色、動力陽性、硫化氫陰性； 第三鑒別培養(yǎng)基中，只產(chǎn)酸； 第四鑒別培養(yǎng)基中，溶液渾濁，細菌生長良好； 第五鑒別培養(yǎng)基中，溶液澄清，細菌不生長； 第四生化模式M4: 第一鑒別培養(yǎng)基中，斜面產(chǎn)酸且底層產(chǎn)酸； 第二鑒別培養(yǎng)基中，表層紫色、底層黃色、動力陽性、硫化氫陰性； 第三鑒別培養(yǎng)基中，只產(chǎn)酸； 第四鑒別培養(yǎng)基中，溶液渾濁，細菌生長良好； 第五鑒別培養(yǎng)基中，溶液澄清，細菌不生長。7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述生化模式Μ符合上述Ml時，則評定所述微 生物樣本為有嗜水氣單胞菌/維隆氣單胞菌溫和變種。8. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述生化模式Μ符合上述M2時，則評定所述微 生物樣本為有維隆氣單胞菌維隆變種。9. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述生化模式Μ符合上述M3時，則評定所述微 生物樣本為有豚鼠氣單胞菌。10. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述生化模式Μ符合上述Μ4時，則評定所述 微生物樣本為有豚鼠氣單胞菌乳糖陽性變種。
【文檔編號】C12Q1/04GK105821113SQ201610147284
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年3月15日
【發(fā)明人】王聞卿, 孫喬, 傅益飛, 郝莉鵬, 朱林英, 謝震宇, 趙冰, 蘇靖華
【申請人】上海市浦東新區(qū)疾病預防控制中心