溫和氣單胞菌的lamp檢測引物組及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種溫和氣單胞菌LAMP檢測引物組及檢測試劑盒。包括一對外引物AS-F3和AS-B3，一對內引物AS-FIP和AS-BIP，以及一對環(huán)引物AS-LF和AS-LB，所述試劑盒包括檢測引物組、BstDNA聚合酶、LAMP反應液、封閉液礦物油、陽性對照和陰性對照。還公開了利用上述溫和氣單胞菌的LAMP檢測試劑盒檢測溫和氣單胞菌的方法；本發(fā)明的試劑盒操作簡便快速，適合現(xiàn)場檢測；特異性強；檢測靈敏度高，可達到320fg/mL；準確率高、可靠，具有廣泛的應用前景。
【專利說明】溫和氣單胞菌的LAMP檢測引物組及試劑盒
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于溫和氣單胞菌檢測【技術領域】，具體涉及一種溫和氣單胞菌的LAMP檢測引物組及試劑盒。
【背景技術】
[0002]溫和氣單胞菌(Aeromonas sobria,AS)隸屬于弧菌科,氣單胞菌屬，為革蘭氏陰性桿菌。廣泛分布于淡水、污水、土壤以及人的食物鏈，是水產養(yǎng)殖中危害較大的致病菌之一，此病常暴發(fā)流行，死亡率高，能引起出血性敗血癥，主要危害中華鱉、巴西龜、羅非魚、鯉魚、黃鱔、鰻鱺、泥鰍、蟹。同時也可以通過被污染的水產品、畜禽肉類和水源等途徑感染人，弓丨發(fā)患者出現(xiàn)急性腹瀉，也可能引起腦膜炎、膿毒性關節(jié)炎和敗血癥。不僅給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失，同時給人類健康帶來危害，是一種重要的人-畜-魚共患病的病原體。國內外學者普遍認為，早發(fā)現(xiàn)疾病并采取諸多措施阻止細菌傳播，是綜合預防有效的方法。因此，建立靈敏、準確、快捷、方便的溫和氣單胞菌檢測方法是減少溫和氣單胞菌發(fā)生和危害的重要途徑。[0003]目前溫和氣單胞菌的檢測方法主要有生化檢驗法和分子生物學方法等。由于氣單胞菌的生化性狀上極為相似，在常規(guī)診斷上需通過生化檢驗排除其它種，檢驗方法步驟繁瑣、需要鑒定的生化反應數(shù)目多，耗時長，且易造成結果不準確，特別是鑒定到種的水平，尤為困難，其特異性和靈敏度低，遠不能滿足日?？焖贆z測工作的需要。PCR技術自問世以來，憑借靈敏、特異、快速等優(yōu)點，被普遍應用于水產養(yǎng)殖病原的檢測中。但PCR技術對實驗人員和環(huán)境的要求高，儀器設備復雜、操作步驟多。與一般PCR技術相比，熒光PCR檢測技術簡化了操作步驟，而且可消除擴增產物引起的交叉污染，減少假陽性的發(fā)生。但實時熒光PCR的儀器設備昂貴，使用成本較高，無法滿足現(xiàn)場檢測需要。目前檢測方法正向更特異、更快速、更便捷、定量化、費用低廉化的方向發(fā)展。因此，建立檢測溫和氣單胞菌快速準確的方法，對促進中國水產養(yǎng)殖、水產品安全及口岸檢疫有重要作用。
[0004]環(huán)介導等溫擴增(loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)是NOTOMI 等建立的一種新的核酸擴增技術，其特點是針對靶基因的6 (或8)個區(qū)域設計4 (或6)種特異引物，利用鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase),在60~65°C的恒溫條件下,歷時幾十分鐘，即可完成核酸擴增反應，不需要模板的熱變性、長時間溫度循環(huán)、電泳等過程，基因的擴增及產物檢測可一步完成。LAMP反應中可形成明顯的白色焦磷酸鎂沉淀，可通過對濁度的觀察或加入熒光染料，直接通過顏色變化來判定反應結果。該技術具有高特異性、高效性、快速、簡便、易檢測等特點，適合基層推廣檢測，符合疾病檢測的快速、準確的診斷需要，已廣泛應用于細菌、病毒、寄生蟲等病原體的檢測研究，并取得了較理想的效果。但是迄今為止，市場上還未見用于檢測溫和氣單胞菌的LAMP檢測引物及試劑盒問世。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種溫和氣單胞菌的LAMP檢測引物組，該引物組特異性強，靈敏度高。
[0006]本發(fā)明的目的還在于提供一種溫和氣單胞菌的LAMP檢測試劑盒，該試劑盒靈敏度高，快速，簡便，成本低。
[0007]本發(fā)明的第一個目的是通過如下技術方案來實現(xiàn)的:一種溫和氣單胞菌的LAMP檢測引物組，包括一對外引物AS-F3和AS-B3，一對內引物AS-FIP和AS-BIP，以及一對環(huán)引物AS-LF和AS-LB，其中AS-F3的核苷酸序列如SEQ ID N0.1中所示，AS-B3的核苷酸序列如SEQ ID N0.2中所示，AS-FIP的核苷酸序列如SEQ ID N0.3中所示，AS-BIP的核苷酸序列如SEQ ID N0.4中所示，AS-LF的核苷酸序列如SEQ ID N0.5中所示，AS-LB的核苷酸序列如SEQ ID N0.6中所示。
[0008]各引物具體的核苷酸序列分別如下所示:
[0009]AS-F3:CGGACGAATGGACTCGAA (SEQ ID NO:1)。
[0010]AS-B3:AAGCTCTGGCAGAGGCTC (SEQ ID NO:2)。
[0011]AS-FIP:AACGCAGGAGTGGCACGATTTGACAGCGATGGCATC (SEQ ID NO:3)。
[0012]AS-BIP:GAAGACGAGGAAGAGGATCTGCAATTCGTCTTCCTGATAGACAG (SEQ ID NO:4)。
[0013]AS-LF:AGCGAGTTCCGGCTCTTC (SEQ ID NO:5)。
[0014]AS-LB:CACTTCGCAAGCCTGCTG (SEQ ID NO:6)。
[0015]本發(fā)明還提供一種溫和氣單胞菌的LAMP檢測試劑盒，包括上述三對檢測引物組。
[0016]本發(fā)明的第二個目的是通過如下技術方案來實現(xiàn)的:一種溫和氣單胞菌的LAMP檢測試劑盒，包括上述三對檢測引物組、BstDNA聚合酶、LAMP反應液、封閉液礦物油、陽性對照和陰性對照。
[0017]作為本發(fā)明的一種較佳的實施方式，本發(fā)明所述的檢測引物組中內引物、環(huán)引物和外引物的摩爾比為8:4:1。
[0018]本發(fā)明所述的LAMP反應液優(yōu)選含IOmM dNTP、10 X ThermoPol反應緩沖液和150mMMgSO4水溶液，作為一種較佳的實施方案，其中IOmM dNTP、10XThermoPol反應緩沖液和150mM MgSO4水溶液的體積比為8:5:2。
[0019]本發(fā)明所述的陽性對照優(yōu)選為含有溫和氣單胞菌ZipA序列(Genbank登錄號為JN830311.1)的重組質粒，所述的陰性對照為無菌去離子水。
[0020]作為本發(fā)明的更進一步改進:本發(fā)明所述試劑盒還包括顯色劑SYBR Green I。
[0021]本發(fā)明利用上述溫和氣單胞菌的LAMP檢測試劑盒檢測溫和氣單胞菌的方法，可以含以下步驟:
[0022](I)提取待檢樣品DNA,用DNA提取試劑盒提取待檢樣品細囷的DNA,犾得待檢樣品的DNA提取液；
[0023](2)恒溫基因擴增LAMP反應:選取LAMP檢測引物組、BstDNA聚合酶、LAMP反應液和封閉液礦物油，置于反應容器中，并設置陽性對照和陰性對照，調節(jié)反應溫度為63~65 V，反應時間65min，反應結束后80°C保持5min ；
[0024](3)結果判斷:通過觀察反應容器內白色沉淀的產生來判斷擴增結果，如有沉淀，則表不待檢樣品中存在溫和氣單胞圃，如無沉淀，則表不待檢樣品中不存在溫和氣單胞圃；或在LAMP反應產物中加入6XBuffer以及瓊脂凝膠進行電泳，電泳結束后將凝膠采用EB中染色后在凝膠成像系統(tǒng)下觀察，觀察梯形條帶，如發(fā)現(xiàn)有階梯狀的擴增條帶，則待檢樣品中存在溫和氣單胞菌，如無階梯狀的擴增條帶，則待檢樣品中不存在溫和氣單胞菌。
[0025] 在該檢測溫和氣單胞菌的方法中:
[0026]本發(fā)明步驟(2 )中所述LAMP檢測引物組中內引物、環(huán)引物和外引物的摩爾比優(yōu)選為 8:4:1。
[0027]本發(fā)明步驟(2)中所述LAMP反應液含IOmM dNTPUOXThermoPol反應緩沖液和150mM MgSOyjC溶液，其中 IOmM dNTP、10XThermoPol 反應緩沖液和 150mM MgSOyK溶液的體積比優(yōu)選為8:5:2。
[0028]作為該檢測方法的一種優(yōu)選的實施方案，其中步驟(2)的恒溫基因擴增LAMP反應中，LAMP反應體系可以為25 μ L，25 μ L的LAMP反應體系具體包括:8U Bst DNA聚合酶，AS-FIP1.6 μ M，AS-BIP1.6 μ Μ, AS-LF0.8 μ M, AS-LB0.8 μ Μ, AS-F30.2 μ Μ, AS-B30.2 μ Μ,2 μ L待檢樣品的DNA提取液，無菌去離子水補足至25 μ L，并加入兩滴礦物油，振蕩離心，以及陽性對照和陰性對照。
[0029]本發(fā)明利用上述溫和氣單胞菌的LAMP檢測試劑盒檢測溫和氣單胞菌的方法，還可以含以下步驟:
[0030](I)提取待檢樣品DNA,用DNA提取試劑盒提取待檢樣品細囷的DNA,犾得待檢樣品的DNA提取液；
[0031 ] (2)恒溫基因擴增LAMP反應:取LAMP檢測引物組、BstDNA聚合酶、LAMP反應液和封閉液礦物油，置于反應容器中，并設置陽性對照和陰性對照，調節(jié)反應溫度為63~65°C，反應時間65min，反應結束后80°C保持5min，其中顯色劑SYBR Green I在LAMP反應前加入反應容器中或待LAMP反應結束后加入反應容器中；
[0032](3)結果判斷:通過觀察反應容器內顏色的變化來判斷擴增結果，如顯色橙色，則表不待檢樣品中不存在溫和氣單胞囷，如顯不綠色，則表不待檢樣品中存在溫和氣單胞囷。
[0033]在該檢測溫和氣單胞菌的方法中:
[0034]步驟(2)中所述LAMP檢測引物組中內引物、環(huán)引物和外引物的摩爾比優(yōu)選為8:4:1。
[0035]步驟(2)中所述LAMP反應液含IOmM dNTP、10XThermoPol反應緩沖液和150mMMgSOyjC溶液，其中IOmM dNTP、10XThermoPol反應緩沖液和150mM MgSOyK溶液的體積比優(yōu)選為8:5:2。
[0036]作為該檢測方法的一種優(yōu)選的實施方案，其中步驟(2)的恒溫基因擴增LAMP反應中，LAMP反應體系可以為25 μ L，25 μ L的LAMP反應體系具體包括:8U Bst DNA聚合酶，AS-FIP1.6 μ M，AS-BIP1.6 μ Μ, AS-LF0.8 μ M, AS-LB0.8 μ Μ, AS-F30.2 μ Μ, AS-B30.2 μ Μ,2 μ L待檢樣品的DNA提取液，無菌去離子水補足至25 μ L，并加入兩滴礦物油，振蕩離心，顯色劑10 X SYBR Green I，以及陽性對照和陰性對照。
[0037]實際上，本發(fā)明中對于恒溫基因擴增LAMP反應的反應產物，結果判斷可采用如下三種方法之一:
[0038]①通過觀察反應管內沉淀的產生來判斷擴增結果，有沉淀為存在溫和氣單胞菌，無沉淀為不存在溫和氣單胞菌，也可采用實時濁度儀(LA-320C)檢測。
[0039]②在試劑盒中含有顯色劑的情況下，于反應管內蓋加10XSYBR Green I I μ L，小心蓋上蓋子，于溫度為63~65°C，反應時間65min，反應結束后80°C保持5min，在1000轉/分鐘下離心8秒，觀察反應結果，或在反應結束后將反應管冷卻，打開蓋加入加10 X SYBRGreen I I μ L,蓋好蓋子,在1000/分鐘下離心8秒后觀察反應結果。通過觀察反應管內顏色的變化來判斷擴增結果，橙色為不存在溫和氣單胞菌，綠色為存在溫和氣單胞菌。
[0040]③電泳檢測:取5 μ L LAMP產物與I μ L6 X Buffer混合，加至2%的瓊脂凝膠進行電泳，凝膠置于EB中染色后在凝膠成像系統(tǒng)下觀察，觀察梯形條帶，以判斷是否有擴增。
[0041]本發(fā)明的有益效果是:
[0042]I)快速高效:整個擴增只用65min即可完成，擴增產量可達IO9~101°個拷貝；
[0043]2)操作簡便:不需要復雜的儀器，不需要特殊試劑，不需要預先進行雙鏈DNA的變性等繁瑣步驟，只需要一部恒定溫度儀就能反應和檢測；
[0044]3)高特異性:本發(fā)明根據(jù)溫和氣單胞菌的細胞分裂蛋白基因(zipA基因，Genbank登錄號為JN830311.1)設計了六條特異性引物，應用上述六條引物，能特異性識別靶序列8個位點，保證了核酸擴增高度特異性；
[0045]4)高靈敏度:本發(fā)明的最低檢出限達320fg/mL，是普通PCR的100倍； [0046]5)鑒定簡便:本發(fā)明可肉眼觀察白色沉淀或者通過加入SYBR Green I觀察顏色變化來判斷是否有特異性擴增與否，無需電泳等其它方法判斷是否擴增，省時簡便，適合現(xiàn)場檢測。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0047]圖1為實施例3中LAMP檢測方法對溫和氣單胞菌的特異性試驗圖，其中A、B、C = LAMP特異性實時濁度儀圖；D: LAMP特異性的核酸染料法圖，A圖中1:陰性對照，2:溫和氣單胞菌，3:嗜水氣單胞菌,4:維氏氣單胞菌,5:豚鼠氣單胞菌,6:大腸桿菌,7:遲鈍愛德華氏菌，8:無乳鏈球菌；B圖中1:陰性對照，2:溫和氣單胞菌，3:海豚鏈球菌，4:金黃色葡萄球菌，5:霍亂弧菌，6:蠟樣芽胞桿菌，7:志賀氏菌，8:肺炎克雷伯桿菌；C圖中1:陰性對照，2:溫和氣單胞菌，3:綠膿桿菌，4:弗氏檸檬酸胞桿菌，5:摩氏摩根菌，D圖中1:陰性對照，2:溫和氣單胞菌，3:嗜水氣單胞菌，4:維氏氣單菌5、維氏氣單菌，6:大腸桿菌，7:遲鈍愛德華氏菌，8:無乳鏈球菌，9:海豚鏈球菌，10:金黃色葡萄球菌，11:霍亂弧菌，12:蠟樣芽胞桿菌13:志賀氏菌14:肺炎克雷伯桿菌15:綠膿桿菌16:弗氏檸檬酸桿菌17:摩氏摩根菌，D圖中2為綠色；
[0048]圖2為實施例4中LAMP檢測方法對溫和氣單胞菌的靈敏度試驗圖，其中A和B LAMP靈敏度實時濁度儀圖；C:LAMP靈敏度的凝膠電泳圖；D:PCR靈敏度的凝膠電泳圖，A 圖中，1:陰性對照 2:10°3:10、:10-25:10、:10-47:10-5，8:10-6，B 圖中1:10_72:10_83:10_94:10_1CI，C 圖和 D 圖中(M:Markerl:陰性對照，2:10°，3:10—1，4:10_2，5:10-3，6: 1θΛ 7:10-5，8:10-6，9:10-7，10:10-8，11:10-9，12:10-10。
【具體實施方式】
[0049]以下結合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限于此。
[0050]實施例1溫和氣單胞菌LAMP檢測引物組和檢測試劑盒的建立
[0051]溫和氣單胞菌的LAMP檢測試劑盒，包括LAMP引物組、LAMP反應液、礦物油、BstDNA聚合酶、陽性對照和陰性對照，產品使用說明書，該試劑盒中還可以含有顯色劑SYBRGreen I 。
[0052]I) LAMP引物設計:根據(jù)從美國基因數(shù)據(jù)庫檢索獲得溫和氣單胞菌(AS) zipA基因序列(Genbank登錄號為JN830311.1)為靶基因，選取保守序列，利用在線設計軟件PrimerExplorer version4 (http: //primerexplorer.1p/e)設計用于檢測溫和氣單胞菌的特異性引物，其序列見下表1:
[0053]表1引物序列表
[0054]
【權利要求】
1.一種溫和氣單胞菌的LAMP檢測引物組，其特征是:包括一對外引物AS-F3和AS-B3，一對內引物AS-FIP和AS-BIP，以及一對環(huán)引物AS-LF和AS-LB，其中AS-F3的核苷酸序列如SEQ ID N0.1中所示，AS-B3的核苷酸序列如SEQ ID N0.2中所示，AS-FIP的核苷酸序列如SEQ ID N0.3中所示，AS-BIP的核苷酸序列如SEQ ID N0.4中所示，AS-LF的核苷酸序列如SEQ ID N0.5中所示，AS-LB的核苷酸序列如SEQ ID N0.6中所示。
2.一種溫和氣單胞菌的LAMP檢測試劑盒，其特征是:所述試劑盒包括權利要求1中所述的檢測引物組、BstDNA聚合酶、LAMP反應液、封閉液礦物油、陽性對照和陰性對照。
3.根據(jù)權利要求2所述的溫和氣單胞菌的LAMP檢測試劑盒，其特征是:所述的檢測引物組中內引物、環(huán)引物和外引物的摩爾比為8:4:1。
4.根據(jù)權利要求2所述的溫和氣單胞菌的LAMP檢測試劑盒，其特征是:所述的LAMP反應液含IOmM dNTPUOXThermoPol反應緩沖液和150mM MgSOyK溶液。
5.根據(jù)權利要求4所述的溫和氣單胞菌的LAMP檢測試劑盒，其特征是:所述的IOmMdNTP、10XThermoPol反應緩沖液和150mM MgSO4水溶液的體積比為8:5:2。
6.根據(jù)權利要求2所述的溫和氣單胞菌的LAMP檢測試劑盒，其特征是:所述的陽性對照為含有溫和氣單胞菌ZipA序列的重組質粒，所述的陰性對照為無菌去離子水。
7.根據(jù)權利要求2-6任一項所述的溫和氣單胞菌的LAMP檢測試劑盒，其特征是:所述試劑盒還包括顯色劑SY BR Green I。
【文檔編號】C12Q1/68GK103923977SQ201410081114
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年3月6日 優(yōu)先權日:2014年3月6日
【發(fā)明者】柯浩, 李嘉彬, 馬艷平, 劉振興, 郝樂, 馬江耀, 梁志凌 申請人:廣東省農業(yè)科學院動物衛(wèi)生研究所