專利名稱：油基和水基佐劑混合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有抗原物質(zhì)和佐劑的疫苗、制備所說疫苗的方法和佐劑組合物。
水產(chǎn)養(yǎng)殖中的許多疾病是由條件病原菌，即在魚或蝦在虛弱或應(yīng)激狀態(tài)下能使之致病的細(xì)菌所致。這是實(shí)際養(yǎng)殖條件下常常存在的情形。
對(duì)商業(yè)性水產(chǎn)養(yǎng)殖具有威脅性的細(xì)菌如紅色耶爾森低菌-腸道石鱸病的致病原;鰻弧菌-古黃型弧菌病的致病原;殺鮭弧菌-引起冷水弧菌病;殺鮭氣單胞菌-引起癤瘍病，Salmoniarum腎細(xì)菌-細(xì)菌性腎病的致病原。
疫苗和抗菌素的應(yīng)用是兩種保護(hù)養(yǎng)殖魚不致病的可行性方法。但在水產(chǎn)養(yǎng)殖中必須大大減少抗菌素的應(yīng)用以避免環(huán)境公害和產(chǎn)生抗菌素抗性的危險(xiǎn)。
已經(jīng)有人報(bào)道應(yīng)用(實(shí)驗(yàn)性)一疫菌抵抗某些魚的細(xì)菌性病原菌(Holm,K.O.etal,J.FishDiseases11,389-396,1987;RΦrstad,G.etal,ConferenceonDiseasesinAsianAquaculture，Nov.1990Indonesia)。
然而，有必要進(jìn)一步提高抗某些上述病原菌疫苗的效力。而且，目前仍無抗鮭科魚的癤瘍病和細(xì)菌性腎病這類商業(yè)上重要的疾病和抗病毒性疾病的有效疫苗。例如，殺鮭氣單胞菌代表了對(duì)商業(yè)水產(chǎn)生養(yǎng)殖的威脅。用死細(xì)菌針對(duì)上述病原菌接種反產(chǎn)生微弱的保護(hù)作用，這可能是由于滅活菌抗原的不良免疫性之故。
因此，應(yīng)用這滅活的疫苗迫切需要增強(qiáng)抗原的免疫原性，例如，借助于佐劑來達(dá)到上述目的。
目前，在挪威已有數(shù)種油性佐劑疫苗商售，其中有兩種是三個(gè)疫苗(Apoject3-Fural,ApothekernesLaboratoriumA.S.;Biojec1900,BiomedInc)。這些三價(jià)疫苗包括滅活的完整細(xì)菌，用于防止鮭的弧菌病、冷水弧菌病和癤瘍病。
這些疫苗的不足之處在于其相對(duì)弱的抗癤瘍病效力和不良的物理特性，尤其是乳劑的粘滯度或穩(wěn)定性。
抗所說疾病更進(jìn)一步的疫苗含有一種水基佐劑，即不含油，可從商業(yè)途徑得自NorBioA/S(NorvaxTrippel)。所說疫苗中的水基佐劑是啤酒酵母的β-1，3和β-1，6連接的葡聚糖(MacroGard,可從KSBiotechMackzymal,TromsΦ,Norway購買)。
酵母和絲狀真菌的葡聚糖代表了一組水基佐劑(DiLuzio,N.R.,SpringerSeminarsinImmunopathology8,387-400，1985)。這些葡聚糖是真菌細(xì)胞壁普遍具有的最重要結(jié)構(gòu)成分之一(Rosenberger,R.F.,TheCellWall.In:TheFilamentousFungi,Vol.2,eds.:smith＆Berry328-334，1976)。
特別是，已經(jīng)證實(shí)啤酒酵母細(xì)胞壁的β-1，3和β-1，6連接的葡聚糖和其它的真菌β-葡聚糖能增強(qiáng)魚類對(duì)細(xì)菌感染的抵抗力(RΦrstad,G.etal.,Fish＆ShellfishImmunology3,179-190,1993;Yano,T.etal.,J.FishDiseases14，577-582，1991)。
本發(fā)明提供了含有抗原物質(zhì)和佐劑的疫苗，其特征在于所說的佐劑是油包水乳劑與免疫刺激性葡聚糖的結(jié)合物。
現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)知道，油包水乳劑(W/O)的佐劑效果部分在于其緩釋作用，即存在于被分散水相中的抗原物質(zhì)從連續(xù)的油相中緩慢地釋出，因?yàn)橛拖嘀鸩狡粕ⅲ嗽诮臃N后馬上產(chǎn)生對(duì)免疫系統(tǒng)較理想的刺激作用。
與此相反，為啟動(dòng)免疫應(yīng)答可直接應(yīng)用水基免疫刺激性葡聚糖。可以預(yù)料，將水基免疫刺激性葡聚糖摻入被分散的油包水乳劑的水相將導(dǎo)致該佐劑成分退出免疫系統(tǒng)。
令人感到意外地是，已發(fā)現(xiàn)包含上述佐劑組合物的疫苗能在接種后很短的時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)高度的保護(hù)性免疫應(yīng)答。
術(shù)語免疫刺激性葡聚糖意指由D葡萄糖型的重現(xiàn)單糖單位構(gòu)成的一種多糖，其葡聚糖與抗原結(jié)合施用時(shí)能夠增加在動(dòng)物中誘發(fā)的抗抗原物質(zhì)的免疫應(yīng)答，超過了未加用葡聚糖時(shí)所觀察到的免疫應(yīng)答。
本文優(yōu)選β-葡聚糖，尤其是得自真菌細(xì)胞壁的β-葡聚糖用作佐劑成分。已知這些葡聚糖以非特異性和特異性方式成為免疫系統(tǒng)的強(qiáng)力刺激劑(Czop,J.K.etal.,JImmunol.135,3388-3393,1985;Ross,G.D.etal.,Complement4,61-74,1987;Diluzio,1985，出處同上)。這類β-葡聚糖的例子有分別來自群交裂褶菌、葡聚糖小核菌和香菇的Schizofiran、scleroglucan和香菇糖(Yanoetal，NipponSuisanGakkaishi55,1815-1819，1989)。
特別優(yōu)選的β-葡聚糖是得自啤酒酵母細(xì)胞壁的葡聚糖，尤其是β-1，3-1，6連接的葡聚糖(DiLuzioetal.，Int.J.Cancer24,773-779,1979;RΦrstad,G.etal.，1993,出處同上)，例如，M-葡聚糖(MacroGard佐劑，得自KSBiotecMackzymal,TromsΦ，Norway)。
根據(jù)本發(fā)明，疫苗中葡聚糖的含量取決于所選用的葡聚糖的類型和疫苗中所用的油包水乳劑及特異性抗原，但選優(yōu)的是在每劑疫苗含大約1～1000ug范圍的葡聚糖，特別是每劑約50～600ug。最優(yōu)選的是每劑用300ug。
用于本發(fā)明中的油包水乳劑中的各個(gè)成分都是常規(guī)的，并為本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知。
油性成分包括如Bayol(R)和Drakeol(R)一類的礦物油，但是可以代謝的、非毒性油類，優(yōu)選地是含有6-30個(gè)碳原子，包括但不限于烷烴、烯烴、炔烴及其相應(yīng)的酸和醇;醚及其酯;以及它們的混合物。所說的油可以是菜油、魚油、動(dòng)物油或經(jīng)合成制備的油，它們能被將施予佐劑的機(jī)體所代謝，并且對(duì)施用對(duì)象無毒。所說的對(duì)象是動(dòng)物，典型地是哺乳動(dòng)物、鳥類或魚類。
任何可代謝的油類，特別是動(dòng)物、魚、蔬菜來源的可代謝油類可用于本發(fā)明。
菜油的來源包括堅(jiān)果類、種子和谷類。最常用的花生油、豆油、椰子油和橄欖油是堅(jiān)果油的例證。種子油包括紅花油、棉籽油、葵花籽油、芝麻油等。玉米油在谷類中是最容易得到的，但也可以使用其它谷類植物的油，如小麥、燕麥、黑麥、大米、埃塞俄比亞畫眉草，黑小麥等等。
大多數(shù)的魚都含有易于被回收的可代謝油。例如，鱈魚肝油、鯊魚旰油和鯨油(如鯨蠟)是數(shù)種可用于本發(fā)明的魚油的例子。大量支鏈油是以5碳異戊二烯單位經(jīng)生物化學(xué)途徑合成的，并通常被稱為類萜烯化合物。鯊魚肝油含有稱為角鯊烯，2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯的支鏈，不飽和的類萜烯化合物。角鯊烯的飽和類似物角鯊?fù)橐彩莾?yōu)選的油。包括角鯊烯和角鯊?fù)樵趦?nèi)的魚油易于由商業(yè)來源或可從本領(lǐng)域已知的方法得到。
本發(fā)明疫苗配方的油性成分含量為40-90%(W/W)，特別是含60-80%(W/W)，最優(yōu)選的用量為70%(W/W)。
正如已經(jīng)熟知的，油包水乳劑的配方包括適當(dāng)?shù)剡x擇乳化劑，這要求同時(shí)考慮到油和水相的相對(duì)比例及其確切的性質(zhì)。乳化劑的比例是允許改變的，但最好是對(duì)其類型進(jìn)行選擇，并以各種濃度加以應(yīng)用以使最終的親疏平衡(HLB)數(shù)小于6。
用于舉證說明實(shí)施本發(fā)明思想的乳化劑例子包括Span80，Span85,Arlacel85和Arlacel83。
特別適于制備摻入到本發(fā)明疫苗中的油包水型乳劑的，是曾在PCT專利中請(qǐng)WO91/00107中被描述過的油性乳化劑組合物，包括可代謝的油和一種二縮甘露醇一油酸族的乳化劑。
在本發(fā)明的疫苗中，佐劑組合物與抗原混合?？乖辉~指任何物質(zhì)，包括完整的病毒或細(xì)菌(活的或天活的)、其分離部分或其提取物，或是亞單位(如用重組技術(shù)生產(chǎn)的)例如，一種純化的蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-多糖、蛋白質(zhì)-脂多糖、脂多糖等，當(dāng)它對(duì)于動(dòng)物的血液呈外源性時(shí)，便刺激免疫系統(tǒng)形成特異性調(diào)節(jié)物，如B細(xì)胞、T細(xì)胞或巨噬細(xì)胞。
抗原可用本領(lǐng)域已知的方法生產(chǎn)、或是購自商業(yè)來源。
本發(fā)明疫苗的配方中將應(yīng)用有效量的抗原，即所用抗原的量能引起接種動(dòng)物的，產(chǎn)生特異性的和足夠的免疫應(yīng)答，以使得在隨后暴露于所說免疫的病原過程中能產(chǎn)生保護(hù)作用。所需要的抗原有效量取決于經(jīng)免疫而尋求預(yù)防的病原類型和所用抗原類型。確定所說的抗原用量是在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的范圍的。
抗原可以是例如病毒、細(xì)菌或寄生蟲。如果需要的話，這些病原體可通過化學(xué)或物理手段致死。在本說明書中，致死意味著滅活，例如，通過遺傳物質(zhì)和/或其它致命性成分的改變使得對(duì)之有免疫力的病原體不再能復(fù)制而滅活。殺死病原體的適宜化學(xué)劑例如甲醛、戊二醛、β-丙醇酸內(nèi)酯、吖丙啶及衍生物，或者是能與屬于所說病原體的反應(yīng)性種類發(fā)生雙功能或多功能性反應(yīng)的其它化合物。殺死病原體的物理劑例如UV輻射、γ-輻射、“熱休克”和X-輻射。
本發(fā)明的疫苗可用于使鳥類、哺乳動(dòng)物和魚對(duì)病原體引起疾病有免疫力，所說的病原體包括但不限于鰻弧菌、殺鮭弧菌、殺鮭氣單胞菌、Salmoninarum腎細(xì)菌、紅色耶爾森氏菌和經(jīng)遺傳學(xué)上修飾的魚病原體、傳染性支氣管炎病毒，新城疫病毒、傳染性粘液囊病毒、偽狂犬病病毒、胸膜肺炎放線桿菌和大腸桿菌。
特別地，本發(fā)明的疫苗適于使魚類是具有抗一種或多種病原體的免疫力，所說的病原體如殺鮭氣單胞菌，殺鮭弧菌，鰻弧菌和紅色耶爾森氏菌。
上述疫苗乳劑可用本領(lǐng)域已知的方法生產(chǎn)，為此特別可參見Herbert等人的描述(Herbert,W.J.，inHandbookofExperimentallmmunologyVol.3,ed.∶D.M.Weir，3thedition，1979;PharmaceuticalDosageFormsVol.1，eds:Lieberman，H.A.，Rieger，M.M.andBanker，G.S.,199-284，1988)。
例如，將含有乳化劑的油相和進(jìn)一步含有葡聚糖的抗原水相在借助如SilversonL2R攪拌器或UltraTurraxT25進(jìn)行攪拌的條件下緩慢混合。另外，可以首先將油、乳化劑和水基葡聚糖乳化，然后再與抗原水相混合。
實(shí)施例1制備疫苗將一種含有Macrogard葡聚糖作佐劑并進(jìn)一步含有經(jīng)福爾馬林滅活的鰻弧菌01、鰻弧菌02、殺鮭弧菌和殺鮭氣單胞菌salm，變種的完整菌細(xì)胞疫苗Norvax Trippel(購自NorBio A/S Bergen，Norway)與一種含有油性成分和來自二縮甘露醇一油酸族的乳化劑的油性組合物Montanide(R)ISA 715(購自Seppic Pharma Division，Paris，F(xiàn)rance)以30/70(W/W)的比例混合，并用Ultra Turrax乳化。
接種試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)條件魚的大小15-20g(大西洋鮭-SalmosalarL)罐的體積150升(0.6×0.6m)水溫11℃禁食情況在處理前2天禁食。在接種操作后12小時(shí)開始進(jìn)食。接種或免疫性試驗(yàn)前的麻醉過程
于每升水中應(yīng)用1ml30%氯丁醇。魚被麻醉后盡快接種。將魚放入水中使之恢復(fù)原狀。
細(xì)菌的重新分離通過血瓊脂平皿上的平皿培養(yǎng)法重新從腎中分離殺鮭氣單胞菌salm。變種，于15-18℃培養(yǎng)3天。用顯微鏡檢查形成的菌落，根據(jù)形態(tài)學(xué)鑒定細(xì)菌。
疫苗含上述佐劑混合物的NorvaxTrippel。
含有油基佐劑和與NorvaxTrippel相同抗原的Apoject3-Fural(ApothekernesLaboratoriumA/S)。
含油基佐劑和與NorvaxTrippel相同抗原的Biojec1900(BiomedInc.)。
接種方法給40條魚經(jīng)腹膜內(nèi)注射0.2ml經(jīng)ISA715乳化的NorvaxTrippel。40只于脂鰭(fatfin)系有標(biāo)記的魚注射0.2ml-1.2%NaCl作為對(duì)照。對(duì)于Apoject3-fural和Biojec1900也用同樣的方法接種。
免疫學(xué)試驗(yàn)方法在接種后11、22和27周進(jìn)行免疫學(xué)試驗(yàn)。接種組和對(duì)照組在相同的罐中進(jìn)行感染。用下述群居的方法經(jīng)注射殺鮭氣單胞菌salm.變種來進(jìn)行免疫學(xué)試驗(yàn)給5條魚中的每一條都經(jīng)腹膜內(nèi)注射0.1ml 2×104細(xì)菌，然后將這些魚放入每個(gè)裝有接種魚和對(duì)照魚的罐中。該共居的魚通常在5-8天內(nèi)死亡。在35天期間內(nèi)對(duì)上述魚進(jìn)行觀察，記錄死亡數(shù)。中止免疫性試驗(yàn)，5天后不再發(fā)生死亡計(jì)算存活相對(duì)百分?jǐn)?shù)RPS。
相對(duì)百分存活率(RPS)的計(jì)算%RPS=100%(1- (%死亡的接種魚)/(%死亡的對(duì)照魚)結(jié)果如果對(duì)于殺鮭氣單胞菌salm，變種的RPS至少為60%，則表明疫苗有足夠的保護(hù)力。第一次免疫性試驗(yàn)后NorvaxTrippelISA715,Apoject3-fural和Biojec1900的死亡率圖分別示于圖1-3中。計(jì)算出的RPS值分別為83.5%、62.2%和54.3%。在圖4中，這些RPS值以線圖表示，并增加了22和27周免疫性試驗(yàn)后的RPS值。在所有的情況下，NorvaxTrippelISA715都產(chǎn)生了最高的存活率。
實(shí)施例2疫苗的制備制備了4種試驗(yàn)性疫苗，它們由下列抗原、葡聚糖和油的不同組合組成(1)抗原(2)抗原+葡聚糖(3)抗原+油(4)抗原+葡聚糖/油所用的抗原同實(shí)施例1。所用的葡聚糖是自酵母真菌啤酒酵母(BiotechMakzymal)的細(xì)胞壁中提取的b-1，-3葡聚糖，所用的油是MontanideISA715(Seppic)。用如實(shí)施例1描述的方法制備疫苗。
飼養(yǎng)條件在第一階段，剪去實(shí)驗(yàn)用魚(未成熟的大西洋鮭魚(Salmo salar L.)]的鰭，置于分隔的室內(nèi)罐中(0.6m3)。為了復(fù)制一個(gè)自然的生殖周期在小鮭魚入海期間(5-7月)，上述魚逐漸適應(yīng)了海水條件。在10月，所有組的魚都移至一個(gè)大的室外罐中(20m3)。將魚貼上標(biāo)簽以區(qū)別不同的實(shí)驗(yàn)組。給魚過量地喂以商售干燥的魚料。魚食由自動(dòng)進(jìn)料器分發(fā)。將魚保持在季節(jié)性變化的水溫和光照條件下。
接種方法參見實(shí)施例1，用標(biāo)準(zhǔn)條件進(jìn)行接種。
免疫學(xué)試驗(yàn)方法將各接種組的30條魚于接種后的18周和31周進(jìn)行免疫學(xué)試驗(yàn)。向每個(gè)實(shí)驗(yàn)組加入等量的對(duì)照魚，在4個(gè)不同的罐中進(jìn)行免疫學(xué)試驗(yàn)，每個(gè)罐中喂養(yǎng)一個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組。
經(jīng)過在同一空間共居而用殺鮭氣單胞菌salm.變種感染魚。在用接觸病原體所進(jìn)行免疫學(xué)試驗(yàn)后的30-45天期間內(nèi)每天記錄魚的死亡數(shù)。在不發(fā)生死亡的5天后中止免疫學(xué)試驗(yàn)，并計(jì)算RPS。
免疫學(xué)試驗(yàn)方法接種后0、4、8、18、31、54和61周收集血樣。在由尾靜脈放血之前，魚禁食并被麻醉。血樣于4℃凝固12-24小時(shí)，以1000g離心5分鐘，收集血清部分，分成等份貯于-80℃。
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的操作過程，借助ELISA技術(shù)檢測(cè)針對(duì)殺鮭氣單胞菌salm。變種抗原的特異性抗體的存在。簡(jiǎn)言之，用碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液稀釋抗原至終濃度為3.108細(xì)菌/ml，并用于包被96孔免疫平板(Nunc Maxi Sorb)。與鮭血清(經(jīng)1∶50-1∶51400倍稀釋(于15℃溫育18小時(shí)，與兔抗鮭Ig(φ451，1∶6000)于20℃溫育1小時(shí)，與羊抗兔Ig(Bio-Rad,1∶3000)于20℃溫育小時(shí)。最后加入鄰-苯二胺二氫氯化物(Sigma)作底物。用分光光度計(jì)法于492nm檢測(cè)抗體的結(jié)合情況。
結(jié)果生長(zhǎng)及死亡魚在室內(nèi)罐中喂養(yǎng)時(shí)的生長(zhǎng)情況在所有的實(shí)驗(yàn)組中都相似(參見圖5)。在移至室外罐中后，觀察到了生長(zhǎng)速度的差別，這可能是緣于對(duì)各組不相同的操作處理。所有的接種組都加上標(biāo)簽，而對(duì)照組則不用標(biāo)簽。
在試驗(yàn)過程中，所有實(shí)驗(yàn)組中的全部死亡數(shù)一律都低。
抗體對(duì)殺鮭氣單胞菌的反應(yīng)用ELISA分析來自接種組和對(duì)照組的血清樣品。接種后的不同時(shí)間取自不同實(shí)驗(yàn)的血清樣品中的抗體滴度曲線示于圖6和圖7中。在頭18周中，1∶400的稀釋度最適合區(qū)別抗體滴度值，而在18-61周期間，用油基疫苗接種的組的抗體水平出現(xiàn)如此高的反應(yīng)，以致相比而言此時(shí)選擇的稀釋度是1∶3200。
保護(hù)作用免疫學(xué)試驗(yàn)的結(jié)果示于表1中。在第二個(gè)試驗(yàn)中，魚的重量約為200g。對(duì)于這一體重的魚而言，發(fā)現(xiàn)共居喂養(yǎng)的免疫學(xué)試驗(yàn)?zāi)Ｐ筒⒎强尚?。盡管將共居喂養(yǎng)的魚數(shù)翻倍，但對(duì)照組的死亡數(shù)仍低。為了計(jì)算存活的相對(duì)百分?jǐn)?shù)，對(duì)照組的死亡率最小需達(dá)到60%。
由上述實(shí)驗(yàn)可得出一個(gè)結(jié)論，雙佐劑疫苗的特征在于迅速地觸發(fā)抗體反應(yīng)，該反應(yīng)在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間保持在高水平上。在實(shí)驗(yàn)過程中，單一的油性疫苗絕不可能達(dá)到與雙佐劑疫苗絕不可能達(dá)到與雙佐劑疫苗相同的抗體滴度水平。在生長(zhǎng)速度方面未觀察到差別。
對(duì)感染的保護(hù)作用似與抗體滴度相關(guān)。


圖1-3表示用NorvaxTrippelISA715(1)、Apoject3-fural(2)和Biojec1900(3)接種11周后的免疫學(xué)試驗(yàn)。接種的魚用---·---表示，對(duì)照的魚用------表示。
圖4表示存活11、22和27周后的存活相對(duì)百分?jǐn)?shù)。
圖5表示不同實(shí)驗(yàn)組中的平均重量。
圖6表示用ELISA以1∶400測(cè)試各實(shí)驗(yàn)組的各個(gè)免疫血清。
圖7表示用ELISA以1∶3200測(cè)試各實(shí)驗(yàn)組的各個(gè)免疫血清。
表Ⅰ接種后兩個(gè)不同時(shí)間間隔的兩個(gè)免疫學(xué)試驗(yàn)中不同實(shí)驗(yàn)組的累計(jì)死亡數(shù)和估算的RPS。用共居喂養(yǎng)完成用接觸傳染性病原體進(jìn)行的免疫學(xué)試驗(yàn)。

權(quán)利要求
1.含有抗原物質(zhì)和佐劑的疫苗，其特征在于所說的佐劑是油包水乳劑與免疫刺激性葡聚糖的組合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的疫苗，其特征在于所說的葡聚糖是β-葡聚糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的疫苗，其特征在于，所說的葡聚糖是來自啤酒酵母細(xì)胞壁的β-1，3-和β-1，6-連接的葡聚糖。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3的疫苗，其特征在于所說的油是動(dòng)物油，植物油或合成油。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4的疫苗，其特征在于乳劑中水與油的比例是約30/70(W/W)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5的疫苗，其特征在于所說的抗原物質(zhì)衍生于魚的病原體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的疫苗，其特征在于魚的病原體選自鰻弧菌、殺鮭氣單胞菌、salmoninarum腎細(xì)胞和紅色耶爾森氏菌。
8.含油包水乳劑和免疫刺激性葡聚糖的佐劑組合物。
9.制備含有抗原物質(zhì)和佐劑的疫苗的方法，其特征在于在乳化劑存在的條件下用油乳化抗原物質(zhì)和免疫刺激性葡聚糖，如此得到油包水乳劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有抗原物質(zhì)和兩種佐劑混合物的疫苗，其中的一種佐劑為油基，而另一種佐劑為水基。
文檔編號(hào)A61K9/107GK1108575SQ9411615
公開日1995年9月20日 申請(qǐng)日期1994年7月25日 優(yōu)先權(quán)日1993年7月26日
發(fā)明者P·M·阿耀德, A·H·諾蘭德, D·H·納普考戈 申請(qǐng)人:阿克佐諾貝爾公司