專利名稱：棉纖維特異性啟動(dòng)子GhTUA9的鑒定的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一個(gè)新的棉纖維特異性調(diào)控元件。具體是棉纖維特異表達(dá)的編碼微管 蛋白亞基a -tubulin的GhTUA9基因的啟動(dòng)子序列的克隆鑒定及其活性分析。
背景技術(shù)：
棉花是我國(guó)乃至全世界最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一。中國(guó)是世界上最大的棉花生產(chǎn)國(guó) 和消費(fèi)國(guó)，每年棉花產(chǎn)量和消費(fèi)量分別占世界總量的1/4和1/3。而且，我國(guó)近年來(lái)在棉花 產(chǎn)量和消費(fèi)量上都有較大的增幅。棉花是關(guān)系到國(guó)計(jì)民生的重要商品，我國(guó)有10多個(gè)省 市3000多萬(wàn)個(gè)農(nóng)戶、近2億農(nóng)民參與棉花生產(chǎn)。棉花是紡織工業(yè)的重要原材料，棉紡工業(yè) 是我國(guó)傳統(tǒng)支柱產(chǎn)業(yè)，也是典型的勞動(dòng)密集型產(chǎn)業(yè)，全國(guó)約有1600萬(wàn)人從事棉花的流通經(jīng) 營(yíng)、紡紗織布，每年產(chǎn)值達(dá)數(shù)千億人民幣。隨著紡織工業(yè)的發(fā)展，新的紡織技術(shù)越來(lái)越需要 纖維更長(zhǎng)、強(qiáng)度更高、纖維更細(xì)并且更整齊的棉纖維。我國(guó)棉花產(chǎn)量雖然居世界第一位，但 棉纖維品質(zhì)較差，不能用作一些高附加值高質(zhì)量紡織產(chǎn)品的生產(chǎn)原料。因此，我國(guó)每年需進(jìn) 口優(yōu)質(zhì)棉花100多萬(wàn)噸，造成國(guó)產(chǎn)原棉的大量積壓。棉纖維品質(zhì)問(wèn)題已成為制約我國(guó)棉花 產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要障礙之一。棉纖維是由胚珠表皮細(xì)胞經(jīng)分化、發(fā)育形成的單細(xì)胞纖維，其發(fā)育過(guò)程可分為四 個(gè)時(shí)期纖維發(fā)育的起始期、伸長(zhǎng)期、次生壁增厚期和成熟期，其中伸長(zhǎng)期與次生壁增厚期 具有相互重疊的時(shí)域。在這四個(gè)時(shí)期中，纖維細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)改變，伴隨著重要生理生化過(guò) 程，其間，有大量基因參與纖維發(fā)育過(guò)程的調(diào)控，最終決定棉纖維的品質(zhì)和產(chǎn)量。應(yīng)用遺傳 工程技術(shù)對(duì)棉纖維品質(zhì)進(jìn)行遺傳改良，將優(yōu)良的農(nóng)藝性狀，特別是纖維品質(zhì)相關(guān)的優(yōu)良性 狀引入棉花主栽品種，以提高棉花產(chǎn)量和品質(zhì)，降低生產(chǎn)成本，是目前世界各國(guó)普遍采用的 育種技術(shù)之一。因此，分離克隆棉纖維發(fā)育相關(guān)的重要功能基因及其特異性調(diào)控元件，具有 極其重要的應(yīng)用價(jià)值。為了使外源基因在目標(biāo)組織細(xì)胞(例如，棉纖維細(xì)胞)中得以充分表 達(dá)，需要組織特異性的高活性的調(diào)控元件(例如，纖維特異性的高活性的啟動(dòng)子)。在棉纖 維的品質(zhì)改良中，棉纖維特異性啟動(dòng)子是棉纖維品質(zhì)改良的遺傳操作中不可缺少的順式調(diào) 控元件，它決定目標(biāo)基因的纖維特異性表達(dá)調(diào)控以及表達(dá)強(qiáng)度調(diào)控。而且，外源目標(biāo)基因的 組織特異性表達(dá)也可避免外源基因?qū)Ψ悄康慕M織生長(zhǎng)發(fā)育的不利影響。應(yīng)用棉纖維特異表 達(dá)啟動(dòng)子，可在棉纖維發(fā)育的特定階段表達(dá)外源基因，加速對(duì)纖維品質(zhì)的重要指標(biāo)如強(qiáng)度、 細(xì)度、長(zhǎng)度等的改良，還可以給纖維增添新的品質(zhì)性狀抗皺、抗縮、色澤等。因此，高活性的 棉纖維特異性啟動(dòng)子的克隆鑒定對(duì)于應(yīng)用遺傳操作技術(shù)改良棉纖維品質(zhì)至關(guān)重要。微管蛋白細(xì)胞骨架不僅在細(xì)胞形態(tài)建成中提供重要的支撐作用，而且參與許多細(xì) 胞生理代謝過(guò)程，例如，細(xì)胞極性建成及細(xì)胞伸展的方向性都與微管蛋白有關(guān)。微管蛋白單 體主要由兩個(gè)不同蛋白亞基a-tubulin(TUA)和0-tubulin(TUB)組成，再由這些單體聚 合成微管蛋白纖絲。a-tubulin和0-tubulin都是由多基因家族編碼的，有許多同源異構(gòu) 體(isoforms)。在擬南芥中，有證據(jù)表明微管蛋白對(duì)于建立和維持表皮毛極性生長(zhǎng)有至關(guān) 重要的作用。微管蛋白通過(guò)控制高度組織化的纖維素微纖絲的排列方式而決定細(xì)胞的極性伸長(zhǎng)。研究表明，擬南芥和玉米TUA基因家族的成員都是組織特異性表達(dá)，其不同的基因在 不同組織中差異表達(dá)。在棉花中，研究證實(shí)TUB1基因及其啟動(dòng)子是棉纖維特異性的，其基 因產(chǎn)物在棉纖維中大量積累。這些資料證明植物TUA和TUB基因的調(diào)控元件(即啟動(dòng)子) 在控制這些基因表達(dá)的組織特異性和活性強(qiáng)度上具有決定性作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一個(gè)棉纖維特異性調(diào)控元件_GhTUA9啟動(dòng)子。分析揭示該 啟動(dòng)子表達(dá)活性，探索其對(duì)纖維發(fā)育調(diào)控的分子機(jī)制，進(jìn)而應(yīng)用該調(diào)控元件改良棉纖維品 質(zhì)，創(chuàng)造棉花優(yōu)良品種。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本申請(qǐng)發(fā)明人構(gòu)建了棉花纖維的cDNA文庫(kù)，從文庫(kù)中隨機(jī)挑 出10000多個(gè)cDNA克隆，經(jīng)測(cè)序和比較分析發(fā)現(xiàn)其中一些克隆含有微管蛋白基因(GhTUA/ TUB)的部分序列。用a-P32PP-dCTP標(biāo)記GhTUA cDNA 3，-末端片段(0. 5kb)，以此為探 針，篩選纖維cDNA文庫(kù)，得到100多個(gè)陽(yáng)性克隆。經(jīng)測(cè)序分析，獲得9個(gè)GhTUA基因，命 名為GhFLA5-GhFLA13。這些TUA基因編碼含449-451氨基酸的a-tubulin亞基，其中 a-tubulin9 (TUA9)含有450氨基酸。通過(guò)設(shè)計(jì)這些TUA基因特異性引物，本申請(qǐng)發(fā)明人對(duì) 這些基因的表達(dá)做了實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中有7個(gè)GhTUA基因在棉花纖 維中高量或者特異表達(dá)，包括本發(fā)明所研究的GhTUA9基因(見(jiàn)圖1)。Northern雜交分析 進(jìn)一步證實(shí)GhTUA9基因在棉纖維中特異表達(dá)，在開(kāi)花后5-10天的纖維細(xì)胞中表達(dá)量達(dá)到 峰值，表明該基因的表達(dá)受纖維發(fā)育調(diào)控(見(jiàn)圖2)。本申請(qǐng)發(fā)明人構(gòu)建了棉花基因組DNA文庫(kù)，以a -P32FP-dCTP標(biāo)記GhTUA9cDNA 片段(0.5kb)為探針，篩選棉花基因組DNA文庫(kù)，得到3個(gè)陽(yáng)性克隆。經(jīng)測(cè)序分析，獲得 GhTUA9基因全長(zhǎng)序列，包括2659bp 5，端上游啟動(dòng)子序列和2083bp基因編碼區(qū)及3，末 端序列。GhTUA9基因含有2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子(見(jiàn)圖3)。利用PlantCARE(http:// bioinformatics. psb. ugent. be/webtools/plantcare/html/)分析啟動(dòng)子中的順式作用兀 件時(shí)發(fā)現(xiàn)，除存在真核生物典型啟動(dòng)子所具有的CAAT框和TATA框外，該啟動(dòng)子還含有其他 一些順式作用元件，如干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點(diǎn)、光應(yīng)答元件、脫落酸應(yīng)答元件、赤霉素應(yīng) 答元件、熱脅迫應(yīng)答元件等調(diào)控元件，如表1。Box I1200TTTCAAA光應(yīng)答元件
Box-ffi1299TTGACC真菌引起子(fungal elicitor)應(yīng)答元件
CGTCA-motif1279CGTCAMeJA應(yīng)答元件
E2Fb1191TTTGCCGC
G-box1276TGACGTGG光應(yīng)答元件
GAG-motif139AGAGATG光應(yīng)答元件的一部分
121TCTGTTG
GARE-motif赤霉素應(yīng)答元件
1255AAACAGA
GATA-motif462GATAGGG光應(yīng)答元件的一部分
1130GGTTAA
GTl-motif光應(yīng)答元件
1145AATCCACA
HSE805AGAAAATTCG熱脅迫應(yīng)答元件
I-box462GATAGGG光應(yīng)答元件的一部分
380CAACTG
MBS1320TAACTG涉及干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點(diǎn)
1085TAACTG
02-site1276GATGACATGG涉及zein代謝調(diào)節(jié)的順式調(diào)控元件
175
Skn-l_motifGTCAT胚乳表達(dá)必需的順式調(diào)控元件
1280
1189GGGCGG
Spl光應(yīng)答元件
1355CC (G/A)CCC
TC-rich
618ATTTTCTTCA防衛(wèi)和逆境應(yīng)答元件
repeats
13CCATCTTTTT
TCA-element水楊酸應(yīng)答元件
532GAGAAGAATA
598
TCT-motifTCTTAC光應(yīng)答元件的一部分
689
TGA-box1275TGACGTGGC生長(zhǎng)素應(yīng)答元件的一部分
TGACG-motif1279TGACGMeJA應(yīng)答元件
ff box1299TTGACC
chs-CMAla542TTACTTAA光應(yīng)答元件的一部分
88
circadian 660 CAANNNNATC 生理節(jié)奏(生物鐘)控制元件265rbcS-CMA7a 441 GTCGATAAGG 光應(yīng)答元件的一部分本申請(qǐng)發(fā)明人還構(gòu)建了 GhTUA9啟動(dòng)子與GUS報(bào)告基因的融合表達(dá)載體，利用農(nóng)桿 菌介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移技術(shù)將之導(dǎo)入棉花，獲得轉(zhuǎn)基因植株。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的組織化學(xué)染色結(jié) 果顯示，GhTUA9啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS基因在棉花纖維細(xì)胞中特異表達(dá)(見(jiàn)圖4)，證實(shí)了該啟動(dòng) 子是棉纖維特異的，可用作基因工程改良棉纖維品質(zhì)的基因調(diào)控元件。GhTUA9mRNA在開(kāi)花后5_10天的棉纖維中大量積累，表明這些基因產(chǎn)物在纖維 細(xì)胞伸長(zhǎng)過(guò)程中可能起重要作用。為進(jìn)一步研究GhTUA9基因的功能，GhTUA9基因的編 碼序列(0RF)被重組到酵母表達(dá)載體PREP-5N質(zhì)粒中，隨后用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)細(xì)胞。在 pREP 質(zhì)粒中，GhTUA9 的表達(dá)受到 nmt_l 啟動(dòng)子 的調(diào)控。nmt-1啟動(dòng)子的活性受外源VBi的抑制，即當(dāng)培養(yǎng)基中缺乏VBi (誘導(dǎo)培養(yǎng)基)時(shí)， 啟動(dòng)下游基因的表達(dá)，而當(dāng)培養(yǎng)基中存在VBi時(shí)(非誘導(dǎo)培養(yǎng)基)，啟動(dòng)子下游基因不表達(dá)。 對(duì)包含pREP-GhTUA9質(zhì)粒的酵母在誘導(dǎo)或非誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時(shí)間后的細(xì)胞形態(tài)進(jìn) 行觀察分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。GhTUA9轉(zhuǎn)基因酵母在非誘導(dǎo)培養(yǎng)基中形態(tài)與對(duì)照類似 (圖5A)，而在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中細(xì)胞長(zhǎng)度顯著比在非誘導(dǎo)條件下長(zhǎng)得多(圖5B)。相反地，對(duì) 照酵母細(xì)胞(含PREP-5N空質(zhì)粒)無(wú)論在非誘導(dǎo)還是在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，形態(tài)基本沒(méi)有差異 (圖5C和5D)。從轉(zhuǎn)基因酵母中隨機(jī)選取6個(gè)細(xì)胞系進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)量其在非誘導(dǎo)和誘導(dǎo)條件 下的細(xì)胞長(zhǎng)度，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示GhTUA9轉(zhuǎn)基因酵母在誘導(dǎo)條件下與在非誘導(dǎo)條件下的 細(xì)胞長(zhǎng)度有顯著的差異，對(duì)照細(xì)胞在兩種條件下長(zhǎng)度沒(méi)有明顯的差異。與對(duì)照相比，GhTUA9 的表達(dá)可使酵母細(xì)胞伸長(zhǎng)1. 4 1. 7倍(圖6)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在酵母中表達(dá)GhTUA9 基因可以顯著改變細(xì)胞的形態(tài)，促使細(xì)胞縱向伸長(zhǎng)，暗示該基因在棉纖維細(xì)胞發(fā)育中有重 要作用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)1.提供了一個(gè)新的棉纖維特異表達(dá)的GhTUA9啟動(dòng)子序列，分析了其含有的順式 作用元件。該啟動(dòng)子調(diào)控GhTUA9基因在棉纖維發(fā)育過(guò)程中高水平表達(dá)。本發(fā)明為纖維品 質(zhì)改良提供了特異的調(diào)控元件。2.提供了一個(gè)新的棉纖維特異表達(dá)GhTUA9基因序列，由兩個(gè)外顯子和一個(gè)內(nèi)含 子組成。在酵母中過(guò)量表達(dá)GhTUA9基因能顯著促進(jìn)細(xì)胞縱向伸長(zhǎng)，說(shuō)明GhTUA9基因在棉 纖維細(xì)胞極性生長(zhǎng)中發(fā)揮重要作用。本發(fā)明通過(guò)以下附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步闡述，但不限制本發(fā)明的范圍。


圖1. GhTUA9基因在棉花各組織中表達(dá)的熒光定量RT-PCR分析圖中1-葉片；2-花瓣；3-胚珠；4-纖維；5-花藥；6-根；7-子葉；8-下胚軸。圖2. GhTUA9基因在棉花不同組織中表達(dá)的Northern雜交分析圖中1_根；2-下胚軸；3-子葉；4-葉片；5-花瓣；6-花藥；7_纖維；8_纖維； 9-纖維；10-胚珠；11-胚珠。圖3. GhTUA9基因結(jié)構(gòu)
黑色方框表示外顯子，線段表示5’ _和3’ _端非編碼區(qū)及內(nèi)含子。線段下的數(shù)字 指內(nèi)含子的大小，而線段上的氨基酸及數(shù)字指內(nèi)含子在基因中插入的位點(diǎn)。ATG，起始密碼 子；TGA和TAA，終止密碼子。圖4. GhTUA9啟動(dòng)子活性分析圖中A_開(kāi)花2天后的棉花胚珠，纖維細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)烈的⑶S活性(藍(lán)色)；B-胚珠 橫切，纖維細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)烈的GUS活性(紅色)。圖5.過(guò)量表達(dá)GhTUA9基因的裂殖酵母細(xì)胞形態(tài)分析圖中A和B為在非誘導(dǎo)A或誘導(dǎo)B培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的包含pREP_GhTUA9質(zhì)粒的酵母 細(xì)胞。C和D為在非誘導(dǎo)C或誘導(dǎo)D培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的包含PREP5N空質(zhì)粒的對(duì)照酵母細(xì)胞。圖6.轉(zhuǎn)GhTUA9基因的酵母細(xì)胞長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)分析圖中C1_C3為對(duì)照組；T1-T6為轉(zhuǎn)化細(xì)胞系。
具體實(shí)施例方式一個(gè)棉花新的GhTUA9啟動(dòng)子及其基因序列的分離、鑒定和表達(dá)活性分析。1. Gh GhTUA9cDNA 克隆棉纖維cDNA 文庫(kù)的構(gòu)建(按 Li XB 等，2002，Molecular characterization of the cottonGhTUBl gene that is preferentially expressed in fiber. Plant Physiol 130 666-674中的方法進(jìn)行)。從棉纖維cDNA文庫(kù)中隨機(jī)挑出4000個(gè)cDNA克隆，經(jīng)測(cè)序 和比較分析發(fā)現(xiàn)其中一些克隆含有微管蛋白基因(GhTUA)的部分序列。用a-P32PP-dCTP標(biāo) 記GhTUA9cDNA 3，-末端片段(0. 5kb)，以此為探針，篩選纖維cDNA文庫(kù)中2X 10P5 p克隆， 得到100多個(gè)陽(yáng)性克隆，經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)其中含有GhTUA9cDNA全長(zhǎng)序列。2.GhTUA9基因及啟動(dòng)子的分離克隆棉花基因組DNA 文庫(kù)構(gòu)建(按 Li XB 等，2002, Molecular characterization of the cottonGhTUBl gene that is preferentially expressed in fiber. Plant Physiol 130 666-674中的方法進(jìn)行)。以a -P32PP_dCTP標(biāo)記GhTUA9cDNA片段(0. 5kb)為探針，篩 選棉花基因組DNA文庫(kù)，得到3個(gè)陽(yáng)性克隆。經(jīng)測(cè)序分析，獲得GhTUA9基因全長(zhǎng)序列。3.實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(1)棉花組織總 RNA 的提取(按 Li XB, Cai L，Cheng NH，Liu Jff, 2002. Molecularcharacterization of the cotton GhTUBl gene that preferentially expressed in fiber. Plant Physiol. 130 :666_674 進(jìn)行)。(2)逆轉(zhuǎn)錄按M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega公司)的使用說(shuō)明書(shū)操作；(3)實(shí)時(shí)熒光定量PCR:按熒光定量PCR試劑盒(T0Y0B0)的使用說(shuō)明書(shū)操作。以 棉花持家基因GhUBIl作為內(nèi)參，根據(jù)公式Y(jié)= 10AetA5X100%計(jì)算基因表達(dá)的相對(duì)值。Ct 是指基因擴(kuò)增產(chǎn)物最初能被熒光檢測(cè)到的循環(huán)數(shù)，ACt是指目的基因與內(nèi)參基因GhUBIl 循環(huán)數(shù)的差值，即ACt = CtGhUBIl-CtGhTUA9。為了得到最佳的實(shí)驗(yàn)效果，PCR擴(kuò)增條件及 引物效率都以目的基因的cDNA為模扳進(jìn)行優(yōu)化。該實(shí)驗(yàn)中每個(gè)組織采集3次樣品，分別提 取RNA，每個(gè)樣品的RNA重復(fù)3次實(shí)時(shí)定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)，最后統(tǒng)計(jì)9次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算其平 均值和標(biāo)準(zhǔn)差。4. Northern 雜交分析 GhPRP5 的表達(dá)
(1)棉花組織總 RNA 的提取(按 Li XB，Cai L，Cheng NH，Liu Jff, 2002. Molecularcharacterization of the cotton GhTUB lgene that preferentially expressed in fiber. Plant Physiol. 130 :666_674 進(jìn)行)。(2) Northern 雜交(按 Li XB，Cai L, Cheng NH, Liu Jff, 2002. Molecular characterization ofthe cotton GhTUB lgene that preferentially expressed in fiber. Plant Physiol. 130 :666_674 進(jìn)行)。5.啟動(dòng)子的表達(dá)分析啟動(dòng)子的順式作用元件按照 plantCARE (http //bioinformatics. psb. ugent. be/ webtools/plantcare/html/)進(jìn)行，結(jié)果見(jiàn)表1。構(gòu)建GhTUA9啟動(dòng)子⑶S基因融合表達(dá) 載體，電擊法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，然后轉(zhuǎn)化棉花。棉花轉(zhuǎn)化及GUS活性的組織化學(xué)染色分 析均按照 Li XB, Cai L, Cheng NH, Liu Jff (Molecularcharacterization of the cotton GhTUB1 gene that preferentially expressed in fiber. Plant Physiol. 2002,130 666-674)介紹的方法進(jìn)行。6.酵母轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)及形態(tài)觀察根據(jù)分子克隆技術(shù)，在GhTUA9基因開(kāi)放閱讀框(0RF)兩端引物加上Not I和 BamH I酶切位點(diǎn)的回文序列，用于PCR擴(kuò)增基因0RF片段。用相應(yīng)的內(nèi)切酶酶切該目 的DNA片段后，重組到pREP-5N質(zhì)粒中。酵母轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)及形態(tài)觀察均按Li L等，2007， Molecularcharacterization of cotton GhTUA9 gene specifically expressed in fiber and involved in cellelongation. J Exp Bot，58 :3227_3238 中的方法進(jìn)行。本發(fā)明的一個(gè)棉纖維特異性調(diào)控元件GhTUA9基因上游啟動(dòng)子序列，包括5 ’ -端未 翻譯區(qū)如下
0097]ATAGCGCGCCGGTTGTGTACGGCAGCGTGACGTACACTGCAGCGCCTAGCGCCGCTCCTT600098]CGCGTCTTCTCTTCTCGCACGTCGCCGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGCTCCCT1200099]TTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTACGGCACTCGACCCCAAAAACTTGATTAGGGTGATGGT1800100]TCACGTAGTGGGCCATCGCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGT2400101]TCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAMCTGGAACMCACTCAACCCTATCTCGGTCTATT3000102]CTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAMAAATGAGCTGATTT3600103]AACAAAMTTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTMCGCTTACAATTTACGCGTTAAGAT4200104]ACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAMATGCTTTATTTGTG4800105]AMTTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCMTAAACAAGTTAACA5400106]ACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAM6000107]GCAAGTMAACCTCTACAAATGTGGTATGGCTGATTATGATCATGAACAGACTGTGAGGA6600108]CTGAGGGGCCTGAAATGAGCCTTGGGACTGTGAATCTAAAATACACAAACAATTAGAATC7200109]AGTAGTTTAACACATTATACACTTAAAMTTGGATCTCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCA7800110]ACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGG8400111]GATGTGCTGCMGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTA9000112]AAACGACGGCCAGTGMTTGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGGTACACTTACCT9600113]GGTACCCCACCCGGGTGGM AATCGATGGG CCCGCGGCCG CTTCTAGMG TACTCTCGAG10200114]MGCTTTTTG AATTCTTTAT TCTCTATTAT GTGTTGGCTA TTTTGGMGA ATCAGMTTA1080
20tacgtttgttaatgttacctttcgttttgattcagatctgtgttttatgcttcttcgttt180cagcgtttgtagcttagttatgttcagatctgtattttacctctgaatctaatgatgtat940ttgtttttatctatgcgtttatatggttttattggatttgttaagttttaaagctagatcsontgaggtttttaggtctctgttgttcgtgtttaatcagatctggttaatctttgtttgaat■ctttaaggtgtcggtttttcttgctccggatccggttaatctttgtttgtgtttttaaat420ttgtcggtttttcccatcaggtttaattggtattctgttttttagctttaaatccatgag480ggatgtatctgtttattgctgttaggctttgaaagctgagtttcttatgaacggttttgtB40ttctgttaacag OTTGATO;TCAGATGCCAAGTGACAAAACTGTCGGAGG AGGTGATGAT600GCTTTTAACACCTTTTTCAGTGAAACTGGTGCTGGGAAGCACGTCCCTCGTGCCGTCTTC660GTGGATCTTGAACCCACTGTTATTGATGAAGTGAGAACTGGTGCTTACCGCCAGCTCTTC720CACCCAGAACAACTCATCAGCGGCAAGGAAGACGCAGCTAACAACTTTGCCCGTGGTCAC780TACACCATTGGCAAGGAGATTGTCGACCTCTGTTTGGACCGCATCAGGAAACTTGCTGAT840AACTGCACTGGTCTTCAAGGATTCCTTGTTTTCAACGCTGTTGGTGGAGGTACCGGATCA900GGTCTTGGTTCTCTCCTTTTGGAGCGTTTGTCTGTCGATTATGGCAAGAAATCCAAGTTG960GGTTTCACTGTCTACCCATCTCCTCAGGTCTCCACTTCTGTTGTTGAGCCTTACAACAGT1020GTTCTCTCAACTCACTCCCTTTTGGAGCACACTGATGTGGCTGTTCTCCTTGACAATGAA1080GCTATCTACGACATTTGCAGGCGTTCTCTTGACATTGAGCGGCCCACCTACACCAATCTT1140AACCGTCTTGTCTCCCAGGTCATTTCCTCCTTGACTGCCTCACTGAGGTTTGATGGTGCC1200TTGAATATCGATGTGACTGAATTCCAAACCAACTTGGTTCCCTACCCAAGAATCCACTTC1260ATGCTTTCCTCGTATGCCCCAGTCATCTCTGCTGAGAAGGCTTACCACGAGCAGCTCTCA1320GTTGCTGAAATCACCAATAGTGCCTTTGAGCCCTCATCTATGATGGCTAAGTGCGATCCA1380CGCCATGGAAAGTACATGGCTTGCTGTTTGATGTACCGTGGTGATGTTGTTCCCAAGGAC1440GTCAATGCTGCAGTCGCCACCATTAAGACCAAGCGCACCATTCAGTTTGTCGATTGGTGT1500CCTACTGGATTCAAGTGCGGTATCAACTACCAACCACCCACTGTTGTCCCTGGTGGTGAT1560CTCGCCAAGGTCCAGAGAGCTGTTTGCATGATTTCTAACTCCACCAGTGTTGCTGAAGTC1620TTCTCTCGCATTGACCATAAGTTTGATCTTATGTACGCCAAACGTGCCTTCGTTCACTGG1680TATGTTGGTG AGGGTATGGA AGAAGGAGAA TTCTCAGAGG CTCGTGAGGA TCTTGCTGCA 1740 TTGGAGAAGG ATTATGAAGA AGTTGGTGCT GAGTCAGCTG AGGGTGATGA GGGTGAAGAT 1800CTTCCGTGTTATGCAAGCTTCTATTCTTTGAAGCTTGTTAAAGACTTGAAATGGTTTACT1Q90GTATGTTATGCTGTTTTATGTTTTATTTGTGTTTGGGTTGAAACTTGATATTTTTGTTGG1980GTGTATTTGAAAGTAAATTGTTAAGGGAACTTGTGAATGCTCAATCACTAGTGAATTCGC2040GGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTT 2083斜體下劃線標(biāo)記的序列為內(nèi)含子和3’末端核苷酸序列。
3.如權(quán)利要求1所述的棉纖維特異性調(diào)控元件GhTUA9基因上游啟動(dòng)子序列，包括 5’ -端未翻譯區(qū)，其特征是，所調(diào)控的GhTUA9基因編碼區(qū)翻譯的a-tubulin蛋白序列如 下MRECISIHIGQAGIQVGNACWELYCLEHGIQPDGQMPSDKTVGGGDDAFN50TFFSETGAGKHVPRAVFVDLEPTVIDEVRTGAYRQLFHPEQLISGKEDAA100NNFARGHYTIGKEIVDLCLDRIRKLADNCTGLQGFLVFNAVGGGTGSGLG150SLLLERLSVDYGKKSKLGFTVYPSPQVSTSVVEPYNSVLSTHSLLEHTDV200AVLLDNEAIYDICRRSLDIERPTYTNLNRLVSQVISSLTASLRFDGALNV250DVTEFQTNLVPYPRIHFMLSSYAPVISAEKAYHEQLSVAEITNSAFEPSS300MMAKCDPRHGKYMACCLMYRGDVVPKDVNAAVATIKTKRTIQFVDWCPTG350FKCGINYQPPTWPG ⑶ LAKVQRAVCMISNSTSVAEVFSRIDHKFDLMYA400KRAFVHWYVGEGMEEGEFSEAREDLAALEKDYEEVGAESAEGDEGEDDEY450
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一個(gè)棉纖維特異性啟動(dòng)子GhTUA9的鑒定。涉及一個(gè)新的棉纖維特異性啟動(dòng)子GhTUA9及其基因全序列，涉及一個(gè)棉纖維發(fā)育相關(guān)的重要調(diào)控元件。棉花微管蛋白亞基編碼基因TUA9全序列(包括5’端啟動(dòng)子和基因編碼區(qū)結(jié)構(gòu)以及3’端序列)為4742bp，該基因的啟動(dòng)子長(zhǎng)度為2659bp，基因編碼區(qū)內(nèi)含有1個(gè)內(nèi)含子。上述基因的mRNA在棉纖維細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中特異性大量積累，表明該啟動(dòng)子對(duì)其纖維特異性表達(dá)有重要調(diào)控作用。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS基因在棉纖維細(xì)胞中特異表達(dá)，證實(shí)它們是棉纖維特異性調(diào)控元件。該啟動(dòng)子有望作為基因順式調(diào)控元件，用于改良棉纖維品質(zhì)，提高棉花產(chǎn)量。
文檔編號(hào)C12N15/113GK101875935SQ20101002891
公開(kāi)日2010年11月3日 申請(qǐng)日期2010年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月5日
發(fā)明者李學(xué)寶, 李瓅, 李登弟, 王秀蘭, 黃耿青 申請(qǐng)人:華中師范大學(xué)