專利名稱：稻蝗屬特異性分子標(biāo)記dna序列及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及昆蟲DNA序列，具體涉及稻蝗屬物種DNA分子標(biāo)記序列及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
稻蝗屬昆蟲是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的重要害蟲，喜食水稻，對(duì)水稻生產(chǎn)為害極大，該屬物種 的準(zhǔn)確鑒定是對(duì)其有效防治的前提。稻蝗屬物種鑒定一直依賴于形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)手段，由 于該屬物種形態(tài)性狀存在多態(tài)性，在實(shí)際應(yīng)用中很難獲得穩(wěn)定、統(tǒng)一的鑒定標(biāo)準(zhǔn)；細(xì)胞學(xué)方 法由于制樣程序和技術(shù)的要求較高，也難以得到該屬物種特異性細(xì)胞學(xué)標(biāo)記，因此，目前稻 蝗屬物種分類仍存在一定爭議。同時(shí)，稻蝗屬與斑腿蝗科內(nèi)其它屬的分類鑒定也存在一定 的問題，例如，稻蝗屬與偽稻蝗屬、擬稻蝗屬、秈蝗屬、芋蝗屬等形態(tài)上比較相似，難以準(zhǔn)確 區(qū)分，導(dǎo)致分類困難。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是從稻蝗屬基因組中克隆出稻蝗屬物種特異性DNA分子遺傳學(xué)標(biāo) 記，并用于稻蝗屬物種鑒別。 本發(fā)明通過大量篩選RAPD分子標(biāo)記，獲得一條667bp稻蝗屬物種共有的DNA條 帶，經(jīng)對(duì)其克隆、測序和同源比較，設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得550bp稻蝗屬物種特異性 DNA條帶，該條帶可作為分子遺傳學(xué)標(biāo)記，用于稻蝗屬物種鑒別。
本發(fā)明獲得的稻蝗屬物種特異性分子標(biāo)記DNA核苷酸序列為cgcgtecttccgactteagtttetcatccctcacateatcaccatctgca60tgtegtgacactgtccatcagagcttctgtcctgctgtteactgteagtgatttegtgcc120acacattctggtg皿gttcacgttgcgttctttteccgtt180tC3g3CggC3tttcgcttttgtgctt卿gtggcactctgctggtegatc240acttgactttgttecttgtgtetcacgttecttttctgtcatettecctt300tttttegagacgattcttettgttegttttcttcaaaggttcgtetgctttcatcaagcc360ategteagtgtcatgte^agctgttcttgccgttgtttgtttcctcategteattgtet420gtgate皿ctgtgtg皿tecctcagagtgcatgctttgte3c皿3gcteatecactgcac■gtctggacgtccacgteaggagtcgtggactectteatectgateg^agteateteteg540ggtettcaattegattcacacg皿c皿皿ctggttetttt皿g皿ctegaC3g3gtgg皿600ggtegtggatagcgactgagtctgcaaccgtctecagactc皿gtetecatcgctttgaa660gtecgcg667 本發(fā)明在對(duì)稻蝗屬物種遺傳分化的研究中，發(fā)現(xiàn)隨機(jī)引物S823 5' -CGC GTA CTT C-3'可在稻蝗屬不同物種擴(kuò)增出一條667bp的穩(wěn)定條帶；根據(jù)DNA序列設(shè)計(jì)了一對(duì)可特異 擴(kuò)增稻蝗屬物種的引物 上游引物TGTCCATCAGAGCTTCTGTCCTGCTG
下游引物TGCAGACTCAGTCGCTATCCACTACC
用該引物擴(kuò)增蝗總科各物種基因組DNA樣本，有550bp擴(kuò)增條帶的，為稻蝗屬物種 樣本。 本發(fā)明克服了常規(guī)形態(tài)性狀及細(xì)胞學(xué)鑒定方法的不足，提供了對(duì)稻蝗屬物種快 速、準(zhǔn)確鑒定的分子標(biāo)記方法，為物種準(zhǔn)確分類和害蟲有效防治提供了方法和依據(jù)。


圖1用設(shè)計(jì)的引物對(duì)蝗總科11個(gè)物種DNA樣本進(jìn)行PCR檢測的電泳圖。1_12泳道 依次為中華稻蝗(Oxya chinensis)、日本稻蝗(Oxya j即onica)、山稻蝗(Oxya卿visa)、 小稻蝗(Oxya intricate)、短翅稻蝗(Oxya brachyptera)、無齒稻蝗(Oxya adentata)、 稻蟲皇屬待定禾中、赤月5偽稻蟲皇(Pseudoxya diminuta)、隆客頁網(wǎng)翅蟲皇(Arcyptera coreana Shiraki)、寬翅曲背蝗(Pararcyptera microptera meridionalis (Iko皿))、亞洲l小車蝗 (Oedaleus decorus asiaticusBei Bienko)、空白對(duì)照。Marker :200bp ladder
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1稻蝗屬物種DNA分子標(biāo)記序列獲得及應(yīng)用
1、采用飽和NaCl法提取蝗蟲基因組DNA 取中華稻蝗、日本稻蝗、山稻蝗、小稻蝗、短翅稻蝗、無齒稻蝗、稻蝗屬待定種、赤脛 偽稻蝗、隆額網(wǎng)翅蝗、寬翅曲背蝗、亞洲小車蝗后足股節(jié)肌肉，冷凍蝗蟲標(biāo)本用無菌三蒸水 沖洗2 3次；100X乙醇固定標(biāo)本用無菌三蒸水浸泡48h以上，棄水；對(duì)干標(biāo)本，用500 iil 浸泡液(10mmol/L Tris-HCl， 200,1/L EDTA，50,1/L NaCl pH 8.0)浸泡48h以上，棄 去浸泡液；剪碎材料；加400 ii 1消化液(STE (pH8. 0) ， 1 % SDS， 200 ii g/ml Proteinase K) 于55。C消化8 12h以上，加300 ii 1飽和NaCl，渦旋30s， 10， 000r/min離心30min，轉(zhuǎn)移上 清，等體積異丙醇沉淀DNA，TE(pH 8.0)溶解后，于_201:保存?zhèn)溆谩?2、采用RAPD-PCR技術(shù)擴(kuò)增蝗蟲基因組DNA，進(jìn)行稻蝗屬特異性分子標(biāo)記的篩選
本實(shí)驗(yàn)共對(duì)78條隨機(jī)引物進(jìn)行篩選，引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限 公合成實(shí)驗(yàn)中共篩選出28條引物，其中IO條用于本實(shí)驗(yàn)中所有供試蝗蟲組織DNA的擴(kuò)增。 所篩選引物S823的序列為5' -CGC GTA CTT C-3' PCR反應(yīng)體系為25ii l，其中模板DNA 20 50ng， 10Xbuffer 2. 5 ii 1， Mg2+2 2. 5mmol/L， TaqDNA聚合酶1U， dNTP 0. 2mmol/L(10X緩沖液、Taq DNA聚合酶、Mg2+、 dNTP 均為華美生物工程公司提供)，引物0. 4 ii mol/L。反應(yīng)條件94。C預(yù)變性lmin 45s ;94。C變 性30s，37。C復(fù)性lmin 30s，72。C延伸2min ;45個(gè)循環(huán)后，72。C延伸10min。
擴(kuò)增產(chǎn)物用含有EB(0.5yg/ml)的1.2%瓊脂糖凝膠分離，電泳緩沖液為 0. 5 X TBE，取樣品DNA 10 yl力n入2 yl上樣緩沖液，混勻后點(diǎn)入膠孔。標(biāo)準(zhǔn)分子量為200bp DNA Ladder(為華美生物工程公司提供)，100V恒壓電泳1. 5h，凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照。
3、應(yīng)用DNA膠回收試劑盒，選擇回收稻蝗屬共有DNA條帶 在紫外燈下將所需的目的片段從膠上切下，置于干凈的EP管中。94t:溶化膠塊， 取1. 5 iU為模板，用引物S823進(jìn)行PCR。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳后，切下目的條帶，用上海華 舜生物工程有限公司的產(chǎn)品小量膠回收試劑盒按照其步驟回收PCR產(chǎn)物。
4、應(yīng)用DNA重組技術(shù)回收克隆DNA條帶
將回收產(chǎn)物插入pGEM-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行克隆，酶切驗(yàn)證后送往北京奧科 生物公司測序，進(jìn)一步對(duì)序列在NCBI上做Blast分析。 (1)在0. 5ml低DNA結(jié)合力的離心管中按照T載體說明將回收DNA條帶與T載體 連接，具體連接步驟如下10iil反應(yīng)體系中含有5ii1 T4 DNA連接酶2X快速連接緩沖液， lii 1PGEM-T Easy vector (50ng) ， 3 ii 1 PCR產(chǎn)物，lii 1 T4 DNA連接酶(3Weiss/ii 1)。用移 液器吹打連接反應(yīng)液使之混勻，4t:孵育過夜，待用。
(2)轉(zhuǎn)化反應(yīng)和細(xì)菌培養(yǎng) 1)從-7(TC冰箱中取出50iU感受態(tài)細(xì)胞DH5a ，冰水解凍，輕撣管壁以混勻細(xì) 胞； 2)短暫離心連接反應(yīng)管(4，000g，30s)，取一半體積的連接反應(yīng)物于解凍后的感
受態(tài)細(xì)胞中，輕撣混勻，冰水浴30min ; 3)取出離心管，于42t:水浴50-90s ; 4)冰水浴2min ; 5)離心管中加入950 ii 1 SOC液體培養(yǎng)基； 6)37t:，溫和地振搖1. 5h(150轉(zhuǎn)/分)，使細(xì)菌復(fù)蘇，并使質(zhì)粒編碼的抗性基因表 達(dá)； 7) 1， OOOg，常溫10min離心，倒去絕大部分上清液(留存150 iU左右)，重新溫 和地懸浮細(xì)菌，涂于預(yù)先處理好的平板培養(yǎng)基上(提前半小時(shí)涂lOOiU 100mM IPTG和 20 ii 150 ii g/ml X-gal于平板培養(yǎng)基中)。待吸收后倒置放入37。C烘箱中，16h左右觀察藍(lán)、 白菌落，可置4t:短期保存待用； 8)取經(jīng)滅菌的試管若干，加入約4ml左右的液體LB培養(yǎng)基(含0.1%氨芐抗生 素)； 9)用滅菌牙簽小心挑取白色菌落，丟于試管中；
10) 37°C ， 250轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)過夜，至溶液混濁。
(3)質(zhì)粒回收 經(jīng)藍(lán)白斑和氨芐篩選，重組質(zhì)粒擴(kuò)大培養(yǎng)，采用上海華舜生物工程有限公司的產(chǎn)
品小量質(zhì)?？焖俪樘峒兓噭┖邪凑掌洳襟E回收質(zhì)粒；具體步驟如下 1)從試管中向1. 5ml EP管中倒入菌液，9000g離心1分鐘，棄去上清液。 2)在細(xì)菌沉淀中加入250 yl Pl液(細(xì)菌懸浮液)，震蕩至徹底懸浮。注一定要
使細(xì)菌徹底懸浮，否則將影響得率與質(zhì)量。 3)加入250 iU P2液(堿裂解液)，立即溫和顛倒離心管5-10次以混勻，室溫靜 置0-4分鐘。注若同時(shí)抽提多個(gè)樣品，加一管，混勻一管，計(jì)時(shí)從第一管開始。待徹底澄清 后即可加入P3液(中和液)，決不要超過5分鐘。 4)加入350 ill P3液(中和液)，立即溫和顛倒離心管5-10次以混勻。注若同 時(shí)抽提多個(gè)樣品，加一管，混勻一管。 5) 12000g 13000g離心20分鐘，將上清液小心移入吸附柱，9000g離心15S，倒 掉收集管中液體，將吸附柱放入收集管中。注量多可以分次上柱；決不要把沉淀移入吸附 柱，否則將出現(xiàn)蛋白質(zhì)污染。 6)在吸附柱中加入500iU Bl液(清洗液)，離心15S，倒掉收集管中液體，將吸附
5柱放入收集管中。 7)在吸附柱中加入250 SW液(清洗液)，靜置1分鐘，離心15S，倒掉收集管中 液體，將吸附柱放入收集管中。 8)在吸附柱中加入500iU Wl液(洗滌液)，離心15S，倒掉收集管中液體，將吸附 柱放入收集管中。注若事溫低于2(TC，離心前先靜置1分鐘。 9)在吸附柱中加入500 Wl液(清洗液)，靜置1分鐘，離心15S，倒掉收集管中 液體，將吸附柱放入收集管中。 10)離心1分鐘，棄收集管，將吸附柱放入干凈的EP管中，在吸附膜中央加入 50ulTl (2mM Tris)液(洗脫液)，靜置5分鐘，離心1分鐘(9000g)。棄吸附柱。將質(zhì)粒回 收產(chǎn)物貯存于-2(TC [OO59] (4)酶切檢測 將第(3)步獲得的質(zhì)粒，用EcoR I進(jìn)行酶切鑒定，10ul的酶切體系中含有l(wèi)ul 10Xbuffer，5ul PCR產(chǎn)物，0. 208ul EcoR I (12U/ul)和3. 792ul無菌水。37。C溫浴120min， 取5ul電泳檢測。 [OO61] (5)目的片段測序 將含有目的片段的菌液約1. 5ml送往北京奧科生物公司進(jìn)行測序。
5、序列分析對(duì)所獲得的中華稻蝗(Oxya chinensis)、日本稻蝗(0. j即onica)、短翅稻蝗 (0. brachyptera) S823擴(kuò)增的序列比對(duì)分析，序列同源度達(dá)到94% -97%，再NCBI網(wǎng)站 Blast搜索，確定為新發(fā)現(xiàn)的DNA序列。
6、 DNA序列標(biāo)記用于稻蝗屬物種的鑒定 根據(jù)新發(fā)現(xiàn)的DNA序列設(shè)計(jì)引物，先對(duì)3條DNA序列同源分析，基于同源區(qū)域核苷 酸序列設(shè)計(jì)引物。引物G+C > 50%，長度為26bp，退火溫度為65t:，保證了擴(kuò)增的特異性。 以飽和NaCl法提取蝗蟲基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 PCR擴(kuò)增體系為25 iil，包括17. 9 iil的滅菌水，2. 5 iil的buffer, 1. 7 iU的 Mg2+(25mM) ， 0. 5 ii 1 dNTP (10mM)，上游引物和下游引物(10mM)各1 ii 1， 0. 2 ii 1 Taq DNA聚 合酶(5U/iU， Promega)。循環(huán)條件為94。C預(yù)變性30s，94。C變性30s，60。C復(fù)性45s，72。C 延伸60s，30個(gè)循環(huán)后，72t:延伸10min。然后瓊脂糖凝膠電泳分離檢測。根據(jù)所選取的蝗 蟲樣本有無550bp的擴(kuò)增條帶，確定DNA序列為稻蝗屬物種共有的特異分子標(biāo)記。
本發(fā)明DNA分子標(biāo)記是利用10個(gè)隨機(jī)引物擴(kuò)增7個(gè)稻蝗屬物種和1個(gè)偽稻蝗屬物 種35個(gè)種群共305個(gè)標(biāo)本基因組DNA，分析稻蝗屬物種遺傳多樣性及分化?；厥盏净葘? 個(gè)物種共有的DNA序列，加以克隆鑒定得到。與共有序列相關(guān)的隨機(jī)引物是S823 5' -CGC GTA CTTC-3' 對(duì)克隆和鑒定的DNA序列，檢索美國NCBI基因數(shù)據(jù)庫，確定為新發(fā)現(xiàn)的DNA序列。 經(jīng)序列同源比對(duì)，在同源區(qū)域設(shè)計(jì)特異引物。對(duì)7個(gè)稻蝗屬物種和4個(gè)非稻蝗屬物種樣本 DNA進(jìn)行擴(kuò)增。 引物序列及擴(kuò)增結(jié)果如下 上游引物序列TGTCCATCAGAGCTTCTGTCCTGCTG 下游引物序列TGCAGACTCAGTCGCTATCCACTACC
6
用這對(duì)引物和PCR技術(shù)對(duì)各種稻蝗和其它蝗蟲樣本基因組DNA的擴(kuò)增結(jié)果為所 有稻蝗屬物種的樣本均有一個(gè)550bp的條帶，其它蝗蟲樣本無該特異擴(kuò)增條帶(見圖1)。 因此，該DNA序列可做為稻蝗屬分子遺傳標(biāo)記，用于稻蝗屬與其它蝗蟲物種的鑒別。
SEQUENCE LISTING
〈110〉山西大學(xué) 〈120〉稻蝗屬特異性分子標(biāo)記DNA序列及其應(yīng)用
〈210>1
〈211>667
〈212>DNA 〈213〉稻蝗屬特異性分子標(biāo)記DNA序列
〈220〉
〈400〉 1cgcgtecttccgactteagtttetcatccctcacateatcaccatctgca60tgtegtgacactgtccatcagagcttctgtcctgctgtteactgteagtgatttegtgcc120acacattctggtg皿gttcacgttgcgttctttteccgtt180tC3g3CggC3tttcgcttttgtgctt卿gtggcactctgctggtegatc240acttgactttgttecttgtgtetcacgttecttttctgtcatettecctt300tttttegagacgattcttettgttegttttcttcaaaggttcgtetgctttcatcaagcc360ategteagtgtcatgte^agctgttcttgccgttgtttgtttcctcategteattgtet420gtgate皿ctgtgtg皿tecctcagagtgcatgctttgte3c皿3gcteatecactgcac■gtctggacgtccacgteaggagtcgtggactectteatectgateg^agteateteteg 540ggtettcaattegattcacacg皿c皿皿ctggttetttt皿g皿ctegaC3g3gtgg皿600ggtegtggatagcgactgagtctgcaaccgtctecagactc皿gtetecatcgctttgaa660gtecgcg66權(quán)利要求
一種稻蝗屬特異性分子標(biāo)記DNA序列及其應(yīng)用，其特征在于該分子標(biāo)記DNA序列的核苷酸序列為cgcgtacttc cgacttaagt ttatcatccc tgaaataaaa tcacataatc accatctgca 60tgtagtgaca ctgtccatca gagcttctgt cctgctgtta actgtaagtg atttagtgcc120acacattctg cagtgtgaaa gtgaagttca cacttggaaa cgttgcgttc ttttaccgtt180tcagacggca tttcgctttt gtgcttagag tggcactctg ctggtagatc aaaataaatt240acttgacttt gttacttgtg actatcaata tatcacgtta cttttctgtc atattacctt300tttttagaga cgattcttat tgttagtttt cttcaaaggt tcgtatgctt tcatcaagcc360atagtaagtg tcatgtaaaa gctgttcttg ccgttgtttg tttcctcata gtaattgtat420gtgataaact gtgtgaatac ctcagagtgc atgctttgta acaaagctaa tacactgcac480gtctggacgt ccacgtaagg agtcgtggac tacttaatac tgatagaaag taatatatag540ggtattcaat tagattcaca cgaacaaaac tggttatttt aagaactaga cagagtggaa600ggtagtggat agcgactgag tctgcaaccg tctacagact caagtataca tcgctttgaa660gtacgcg 667
2.如權(quán)利要求1所述的特異性分子標(biāo)記DNA序列的應(yīng)用，其特征在于該特異性分子標(biāo) 記DNA序列用于稻蝗屬物種鑒別的方法為根據(jù)該DNA序列設(shè)計(jì)一對(duì)可特異擴(kuò)增稻蝗屬物 種的引物上游引物TGTCCATCAGAGCTTCTGTCCTGCTG下游引物TGCAGACTCAGTCGCTATCCACTACC用該引物擴(kuò)增蝗總科各物種基因組DNA樣本，有550bp擴(kuò)增條帶的，為稻蝗屬物種樣本。
全文摘要
本發(fā)明通過大量篩選RAPD分子標(biāo)記，獲得一條667bp稻蝗屬物種共有的DNA條帶，經(jīng)對(duì)其克隆、測序和同源比較，設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得550bp稻蝗屬物種特異性DNA條帶，該條帶可作為分子遺傳學(xué)標(biāo)記，用于稻蝗屬物種鑒別。本發(fā)明克服了常規(guī)形態(tài)性狀及細(xì)胞學(xué)鑒定方法的不足，提供了對(duì)稻蝗屬物種快速、準(zhǔn)確鑒定的分子標(biāo)記方法，為物種準(zhǔn)確分類和害蟲有效防治提供依據(jù)。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101724703SQ20091026393
公開日2010年6月9日 申請(qǐng)日期2009年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月25日
發(fā)明者張建珍, 李大琪, 楊美玲, 馬恩波 申請(qǐng)人:山西大學(xué)