專利名稱：紫杉醇基因組重排菌株hdfs4-26及紫杉醇高產菌株的選育方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種紫杉醇基因組重排菌株及紫杉醇工程菌株的選育方法。
技術背景惡性腫瘤嚴重地威脅著人類的健康，而且癌癥是目前人類疾病中僅次于心 腦血管疾患的第二大死因。紫杉醇是從紅豆杉屬植物中提取出來的具有多種抗腫瘤療效的二萜生物 堿類藥物(分子式如圖l所示)。由于紅豆杉(又名紫杉)是珍稀樹種，生長 速度緩慢，并且其生物學特性對生態(tài)環(huán)境要求較高，天然更新能力差，所以 種群數量極為有限，屬瀕危保護植物，資源十分有限，因此國內外學者都在 積極地研究開發(fā)紫杉醇的新藥源。微生物發(fā)酵生產是降低成本、大量獲取紫杉醇的最理想方法。1993年美 國蒙塔那州立大學化學家Andrea Stierle和植物病理學家Gary Strobel在蒙塔那 西北部國家冰川公園的短葉紅豆杉中分離到一株內生真菌roxom^^ ""&e"""e，在Stierle等的工作一經發(fā)表，美國細胞克隆公司就出價100萬美 元支持蒙塔那州立大學的這項研究。但是目前可用于紫杉醇微生物發(fā)酵的菌 株的紫杉醇產量仍然較低(菌株HD，.23系菌株NCEU-1的孢子經UV和NTG 復合誘變后獲得的高產紫杉醇的突變株，其杉醇產量為356.80pg/L，菌株 UV4(M9和UL5Q-6系菌株NCEU-1的原生質體分別經紫外線和紫外線與氯化鋰 復合誘變后獲得的高產紫杉醇的突變株，紫杉醇產量分別為376.38|ig/L和 392.63pg/L)，難以滿足市場的需求。發(fā)明內容本發(fā)明的目的是為了解決目前可用于紫杉醇微生物發(fā)酵的菌株的紫杉醇 產量仍然較低的問題，而提供的紫杉醇基因組重排菌株HDFS4-26及紫杉醇高 產菌株的選育方法。本發(fā)明紫杉醇基因組重排菌株HDFS4-26為樹狀多節(jié)孢(A^/"fepon、m W/w/orme)屬于多節(jié)孢屬(iVo^fe/ on'ww)，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC),保藏地址是武漢大學，保藏日期為2008年2月28日，保藏號為 CCTCC M 208026;紫杉醇基因組重排菌株HDFS4-26菌落培養(yǎng)初期為白色， 后期為深灰褐色，背面為黑色；紫杉醇基因組重排菌株HDFS4-26菌絲部分內 生，部分表生，有隔，多分支，菌絲為深褐色向頂性逐漸變淺，直徑為2.24 5.86,，未見到菌核產生；分生孢子梗單生，多數呈樹狀分支，褐色向頂性 變淡，長37 162|im;產孢細胞柱狀，單生或輪狀排列，6.37-22.63^im x2.51 3.86pm，合軸式產孢；分生孢子單生，橢圓形或卵圓形，平滑或具小 疣，無隔膜，5.07 7.89^imx2.45 3.79^im，分生孢子在產孢細胞的產孢點位置 呈頭狀排列。本發(fā)明紫杉醇高產菌株按以下方法選育 一、原生質體制備；二、原生質 體的滅活；三、原生質體的融合；四、原生質體再生；五、基因組重排、篩 選，即得到紫杉醇高產菌株；其中用于原生質體制備的菌株為紫杉醇產生菌 HD,、 UV職9禾口UL脅本發(fā)明紫杉醇高產菌株的選育方法中步驟一原生質體制備取活化的紫杉 醇產生菌HD跡23、 UV職9和UL則放入PDA液體培養(yǎng)基中在28士0.5"C的條 件下靜置培養(yǎng)3天，菌懸液在4000g條件下離心10min收集菌絲體，再用旋 渦混合器將菌絲體振蕩均勻，然后用滲透壓穩(wěn)定劑洗滌2次，之后按每250mg 菌絲體加入lmL酶裂解液的比例加入酶裂解液，再置于30。C環(huán)境中溫浴7h， 然后用3層無菌鏡頭紙過濾，濾液4000g在4000g條件下離心10min，原生質 沉淀再用滲透壓穩(wěn)定劑洗滌2次得到純化的原生質體，之后將原生質體懸浮 于滲透壓穩(wěn)定劑中。步驟二原生質體的滅活將純化后的HD1Q()-23原生質體懸液移入無菌試管中，50。C恒溫水浴5min 進行熱滅活；將純化后的UV4(M9的原生質體懸液移入直徑為6cm的無菌平皿中，置于 已預熱穩(wěn)定的30W紫外燈下，平皿與紫外燈垂直距離為30cm，照射100s進 行紫外線滅活；向純化后的UL5o-6的原生質體懸液中加入終濃度為0.6%LiCl，然后立即置 于已預熱穩(wěn)定的30W紫外燈下，平皿與紫外燈垂直距離為30cm，照射70s進行紫外線+氯化鋰復合滅活。步驟三原生質體的融合從滅活原生質體懸液中各取lmL懸液進行兩兩 混合，混合液在3000r/min的條件下離心10min，去除離心上清液后將原生質 體懸浮于0.2mL滲透壓穩(wěn)定劑中，再加入1.8mL、溫度為30°C、質量濃度為 35%的PEG融合劑，在3(TC條件下水浴保溫90s，再加入5mL、溫度為4°C 的滲透壓穩(wěn)定劑終止融合，然后離心洗滌去除融合劑，經過融合的原生質體 再重新懸浮于滲透壓穩(wěn)定劑中；其中融合劑中添加有濃度為O.Olmol/L的 CaCl2。步驟四原生質體再生采用雙層平板培養(yǎng)法將步驟三經過融合的原生質體懸液倍比稀釋，稀釋液各吸取0.5mL與4.5mL PDA再生半固體培養(yǎng)基混勻， 然后傾注于PDA再生固體培養(yǎng)基平板上，放入28。C的環(huán)境中培養(yǎng)3 5天。步驟五基因組重排收集步驟四培養(yǎng)的全部再生菌落為Fl代融合菌，然 后用Fl代雜合菌絲體制備原生質體，并分別采用步驟二中的熱滅活、紫外線 滅活和紫外線+氯化鋰復合滅活法對Fl原生質體進行滅活，然后按步驟三和 四進行融合和再生，即得到F2代融合菌；重復操作直到得到F4代融合菌， 再將F4代融合菌用濃度為135pg/mL的制霉菌素PDA培養(yǎng)基進行抗藥性篩 選，然后將具有抗藥性的融合菌進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，提取、純化代謝產物， 進行分析，得到紫杉醇高產菌株。紫杉醇基因組重排菌株HDFS4-26就是采用本發(fā)明紫杉醇高產菌株的選育 方法選育出來的。采用與背景技術中相同的發(fā)酵方法和發(fā)酵條件進行發(fā)酵， 紫杉醇基因組重排菌株HDFS4-26的紫杉醇產量為516.37jxg/L，比菌株 NCEU-1紫杉醇產量提高了 64.41%，比親本菌株紫杉醇產量提高了 31.52% 44.72%。紫杉醇基因組重排菌株HDFS4-26連續(xù)傳代6次后其紫杉醇 產量仍然保持紫杉醇產量高于500pg/L，說明紫杉醇基因組重排菌株 HDFS4-26的高紫杉醇產量遺傳性狀穩(wěn)定。'本發(fā)明紫杉醇高產菌株按以下方法選育簡單，效果好，為提供高產紫杉醇 的工業(yè)生產菌株奠定了基礎。本發(fā)明紫杉醇基因組重排菌株HDFS4-26為樹狀多節(jié)孢(iVo山fcpoW畫 ^/vz/orwe)屬于多節(jié)孢屬(A^/w/z'^oWw附)，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武漢大學，保藏日期為2008年2月28日，保藏號為 CCTCCM 208026。


圖1是紫杉醇分子式，圖2是菌株HDFS4-26的分生孢子梗的顯微鏡觀察 圖，圖3是菌株HDFS4-26的分生孢子的顯微鏡觀察圖，圖4是菌株HDFS4-26 的分生孢子頭排列的方式和分生孢子梗上的疣的顯微鏡觀察圖，圖5為紫杉 醇標準品HPLC圖譜，圖6是菌株HDFS4-26發(fā)酵提取物HPLC圖譜，圖7 是紫杉醇基因組重排菌株HDFS4-26發(fā)酵提取純化物質圖譜。
具體實施方式
具體實施方式
一本實施方式紫杉醇基因組重排菌株HDFS4-26為樹狀多 節(jié)孢(^ ^//5^0〃'"附^/vz》m^)屬于多節(jié)孢屬(7Vo^^:s77W7'ww),保藏于中國典型 培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏日期為2008年2月28日，保藏號為CCTCC M 208026;紫杉醇基因組重排菌株HDFS4-26菌落培養(yǎng)初期為白色，后期為 深灰褐色，背面為黑色；紫杉醇基因組重排菌株HDFS4-26菌絲部分內生，部 分表生，有隔，多分支，菌絲為深褐色向頂性逐漸變淺，直徑為2.24 5.86|im， 未見到菌核產生；分生孢子梗單生，多數呈樹狀分支，褐色向頂性變淡，長 37 162pm;產孢細胞柱狀，單生或輪狀排列，6.37 22.63pmx2.51 3.86^im， 合軸式產孢；分生孢子單生，橢圓形或卵圓形，平滑或具小疣，無隔膜， 5.07 7.89nmx2.45 3.79pm，分生孢子在產孢細胞的產孢點位置呈頭狀排列。本實施方式紫杉醇基因組重排菌株HDFS4-26的分生孢子梗如圖2所示， 分生孢子如圖3所示，分生孢子頭排列的方式和分生孢子梗上的疣如圖4所 示。本實施方式紫杉醇基因組重排菌株HDFS4-26采用以下方法活化將4°C 保存的紫杉醇基因組重排菌株HDFS4-26接種于PDA斜面培養(yǎng)基上，在28°C 的條件下活化2 3天(重復操作一次)，將斜面活化兩次的菌株HDFS4-26 轉接于裝有SOmLPDA液體培養(yǎng)基的三角瓶中，放入28。C、 120r/min的搖床 中繼續(xù)活化培養(yǎng)2天。將經過活化的紫杉醇基因組重排菌株HDFS4-26懸液按3。/。 (v/v)的比例 接入改良的S-7培養(yǎng)基中(改良的S-7培養(yǎng)基是在1993年Strobel原S-7培養(yǎng)基基礎上將苯丙氨酸、酪氨酸、亞油酸增至終濃度1.5 5.0mg/L制成)，在 25°C、 150r/min的條件下發(fā)酵，發(fā)酵時間為12天。發(fā)酵后紫杉醇按一下步驟提取將培養(yǎng)不同時間的菌體發(fā)酵液抽濾，濾液 和固體均回收；用等體積的乙酸乙酯分兩次對濾液進行萃取，分液漏斗靜止 lh分層；上層有機相中溶有紫杉醇，下層水相棄掉；同時研磨抽濾后剩余的 菌體，并加入乙酸乙酯震蕩萃取30min過濾，將濾液與發(fā)酵液萃取后的有機 相混合；用旋轉蒸發(fā)儀除去溶劑乙酸乙酯，待剩余溶液為原液體積的1/10時， 將剩余溶液倒入平皿中，在50。C條件下干燥；再用少量的乙腈反復沖洗平皿 表面的微量的紫杉醇，定溶，4'C保存。
具體實施方式
二本實施方式與具體實施方式
一的不同點是紫杉醇基因 組重排菌株HDFS4-26在25 28t:、 PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天，菌落平展，菌 落直徑為4.1 5.8cm。其它與實施方式一相同。
具體實施方式
三本實施方式紫杉醇高產菌株按以下方法選育 一、原生 質體制備；二、原生質體的滅活；三、原生質體的融合；四、原生質體再生； 五、基因組重排、篩選，即得到紫杉醇高產菌株；其中用于原生質體制備的菌株為紫杉醇產生菌HDK)o-23、 UV4(M9和UL50-6。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
三的不同點是步驟一原生 質體制備取活化的紫杉醇產生菌HD1Q。.23、 UV4(M9和UL5。.6放入PDA液體培養(yǎng)基中在28士0.5。C的條件下靜置培養(yǎng)3天，菌懸液在4000g條件下離心 10min收集菌絲體，再用旋渦混合器將菌絲體振蕩均勻，然后用滲透壓穩(wěn)定劑 洗滌2次，之后按每250mg菌絲體加入lmL酶裂解液的比例加入酶裂解液， 再置于3(TC環(huán)境中溫浴7h，然后用3層無菌鏡頭紙過濾，濾液4000g在4000g 條件下離心10min，原生質沉淀再用滲透壓穩(wěn)定劑洗滌2次得到純化的原生質 體，之后將原生質體懸浮于滲透壓穩(wěn)定劑中。其它步驟及參數與實施方式三 相同。本實施方式中的穩(wěn)定劑為濃度為0.7mol/L的NaCl溶液。 本實施方式中的酶裂解液為纖維素酶、蝸牛酶和溶菌酶的復合酶系，酶裂解液的pH值為5.5 6.0，酶裂解液中纖維素酶的濃度為30mg/mL，蝸牛酶的濃度為20mg/mL，溶菌酶的濃度為10mg/mL。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
四的不同點是原生質體懸浮于滲透壓穩(wěn)定劑中，原生質體的濃度為1.0xl07cfU/mL。其它步驟及參數與實施方式四相同。
具體實施方式
六本實施方式與具體實施方式
三的不同點是步驟二原生 質體的滅活將純化后的HD1()Q.23原生質體懸液移入無菌試管中，50。C恒溫水浴5min 進行熱滅活；將純化后的UV4(M9的原生質體懸液移入直徑為6cm的無菌平皿中，置于 已預熱穩(wěn)定的30W紫外燈下，平皿與紫外燈垂直距離為30cm，照射100s進 行紫外線滅活；向純化后的ULso-6的原生質體懸液中加入終濃度為0.6%LiCl，然后立即置 于已預熱穩(wěn)定的30W紫外燈下，平皿與紫外燈垂直距離為30cm，照射70s 進行紫外線+氯化鋰復合滅活。其它步驟及參數與實施方式三相同。
具體實施方式
七本實施方式與具體實施方式
三的不同點是步驟三原生 質體的融合從滅活原生質體懸液中各取lmL懸液進行兩兩混合，混合液在 3000r/min的條件下離心10min，去除離心上清液后將原生質體懸浮于0.2mL 滲透壓穩(wěn)定劑中，再加入1.8mL、溫度為3(TC、質量濃度為35%的PEG融合 劑，在3(TC條件下水浴保溫90s，再加入5mL、溫度為4'C的滲透壓穩(wěn)定劑終 止融合，然后離心洗滌去除融合劑，經過融合的原生質體再重新懸浮于滲透 壓穩(wěn)定劑中；其中融合劑中添加有濃度為0.01mol/L的CaCl2。其它步驟及參 數與實施方式三相同。
具體實施方式
八本實施方式與具體實施方式
三的不同點是步驟四原生質體再生采用雙層平板培養(yǎng)法將步驟三經過融合的原生質體懸液倍比稀釋，稀釋液各吸取0.5mL與4.5mL PDA再生半固體培養(yǎng)基混勻，然后傾注于PDA 再生固體培養(yǎng)基平板上，放入28。C的環(huán)境中培養(yǎng)3 5天。其它步驟及參數與 實施方式三相同。
具體實施方式
九本實施方式與具體實施方式
三的不同點是步驟五基因 組重排收集步驟四培養(yǎng)的全部再生菌落為Fl代融合菌，然后用F1代雜合菌絲體制備原生質體，并分別采用步驟二中的熱滅活、紫外線滅活和紫外線+氯化鋰復合滅活法對F1原生質體進行滅活，然后按步驟三和四進行融合和再 生，即得到F2代融合菌；重復操作直到得到F4代融合菌，再將F4代融合菌 用濃度為135pg/mL的制霉菌素PDA培養(yǎng)基進行抗藥性篩選，然后將具有抗 藥性的融合菌進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，提取、純化代謝產物，進行分析，得到紫 杉醇高產菌株。其它步驟及參數與實施方式三相同。
具體實施方式
十本實施方式與具體實施方式
九的不同點是采用薄層層析(TLC)、高效液相色譜(HPLC)和質譜(MS)法進行分析。其它步驟及 參數與實施方式九相同。
具體實施方式
十一本實施方式采用具體實施方式
三方法選育得到紫杉醇 基因組重排菌株HDFS4-26。利用本實施方式選育得到的高產紫杉醇基因組重排菌株HDFS4-26進行發(fā) 酵培養(yǎng)和紫杉醇提取、純化，然后分別采用高效液相色譜(HPLC)和質譜(MS) 法進行分析，分析結果分別如圖6和圖7所示(圖5為紫杉醇標準品HPLC 的圖譜，圖5、圖6和圖7中箭頭表示為紫杉醇峰)。
權利要求
1、紫杉醇基因組重排菌株HDFS4-26，其特征在于紫杉醇基因組重排菌株HDFS4-26為樹狀多節(jié)孢(Nodulisporium sylviforme)屬于多節(jié)孢屬(Nodulisporium)，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2008年2月28日，保藏號為CCTCC M 208026；紫杉醇基因組重排菌株HDFS4-26菌落培養(yǎng)初期為白色，后期為深灰褐色，背面為黑色；紫杉醇基因組重排菌株HDFS4-26菌絲部分內生，部分表生，有隔，多分支，菌絲為深褐色向頂性逐漸變淺，直徑為2.24～5.86μm，未見到菌核產生；分生孢子梗單生，多數呈樹狀分支，褐色向頂性變淡，長37～162μm；產孢細胞柱狀，單生或輪狀排列，6.37～22.63μm×2.51～3.86μm，合軸式產孢；分生孢子單生，橢圓形或卵圓形，平滑或具小疣，無隔膜，5.07～7.89μm×2.45～3.79μm，分生孢子在產孢細胞的產孢點位置呈頭狀排列。
2、 根據權利要求1所述的紫杉醇基因組重排菌株HDFS4-26，其特征在 于紫杉醇基因組重排菌株HDFS4-26在25 28°C 、 PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天， 菌落平展，菌落直徑為4.1 5.8cm。
3、 紫杉醇高產菌株的選育方法，其特征在于紫杉醇高產菌株按以下方法 選育 一、原生質體制備；二、原生質體的滅活；三、原生質體的融合；四、 原生質體再生；五、基因組重排、篩選，即得到紫杉醇高產菌株；其中用于原生質體制備的菌株為紫杉醇產生菌HD1G().23、 UV4(M9和UL50.6。
4、 根據權利要求3所述的紫杉醇高產菌株的選育方法，其特征在于步驟一原生質體制備取活化的紫杉醇產生菌HD跡23、 UV4(M9和UL則放入PDA液體培養(yǎng)基中在28±0.5"的條件下靜置培養(yǎng)3天，菌懸液在4000g條件下離 心10min收集菌絲體，再用旋渦混合器將菌絲體振蕩均勻，然后用滲透壓穩(wěn) 定劑洗滌2次，之后按每250mg菌絲體加入lmL酶裂解液的比例加入酶裂解 液，再置于30。C環(huán)境中溫浴7h，然后用3層無菌鏡頭紙過濾，濾液4000g在 4000g條件下離心10min，原生質沉淀再用滲透壓穩(wěn)定劑洗滌2次得到純化的 原生質體，之后將原生質體懸浮于滲透壓穩(wěn)定劑中。
5、 根據權利要求4所述的紫杉醇高產菌株的選育方法，其特征在于原生 質體懸浮于滲透壓穩(wěn)定劑中，原生質體的濃度為1.0xl07cfU/mL。
6、 根據權利要求3所述的紫杉醇高產菌株的選育方法，其特征在于步驟二原生質體的滅活-將純化后的1^1()()_23原生質體懸液移入無菌試管中，50。C恒溫水浴5min 進行熱滅活；將純化后的UV4(M9的原生質體懸液移入直徑為6cm的無菌平皿中，置于 已預熱穩(wěn)定的30W紫外燈下，平皿與紫外燈垂直距離為30cm，照射100s進 行紫外線滅活；向純化后的UL5o—6的原生質體懸液中加入終濃度為0.6%LiCl，然后立即 置于已預熱穩(wěn)定的30W紫外燈下，平皿與紫外燈垂直距離為30cm，照射70s 進行紫外線+氯化鋰復合滅活。
7、 根據權利要求3所述的紫杉醇高產菌株的選育方法，其特征在于步驟 三原生質體的融合從滅活原生質體懸液中各取lmL懸液進行兩兩混合，混 合液在3000r/min的條件下離心10min，去除離心上清液后將原生質體懸浮于 0.2mL滲透壓穩(wěn)定劑中，再加入1.8mL、溫度為30°C、質量濃度為35%的PEG 融合劑，在3(TC條件下水浴保溫90s，再加入5mL、溫度為4"C的滲透壓穩(wěn)定 劑終止融合，然后離心洗滌去除融合劑，經過融合的原生質體再重新懸浮于 滲透壓穩(wěn)定劑中；其中融合劑中添加有濃度為0.01mol/L的CaCl2。
8、 根據權利要求3所述的紫杉醇高產菌株的選育方法，其特征在于步驟 四原生質體再生采用雙層平板培養(yǎng)法將步驟三經過融合的原生質體懸液倍 比稀釋，稀釋液各吸取0.5mL與4.5mLPDA再生半固體培養(yǎng)基混勻，然后傾 注于PDA再生固體培養(yǎng)基平板上，放入28°C的環(huán)境中培養(yǎng)3 5天。
9、 根據權利要求3所述的紫杉醇高產菌株的選育方法，其特征在于步驟 五基因組重排收集步驟四培養(yǎng)的全部再生菌落為Fl代融合菌，然后用Fl 代雜合菌絲體制備原生質體，并分別采用步驟二中的熱滅活、紫外線滅活和 紫外線+氯化鋰復合滅活法對Fl原生質體進行滅活，然后按步驟三和四進行 融合和再生，即得到F2代融合菌；重復操作直到得到F4代融合菌，再將F4 代融合菌用濃度為135jig/mL的制霉菌素PDA培養(yǎng)基進行抗藥性篩選，然后 將具有抗藥性的融合菌進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，提取、純化代謝產物，進行分析， 得到紫杉醇高產菌株。
10、 根據權利要求9所述的紫杉醇高產菌株的選育方法，其特征在于采 用薄層層析、高效液相色譜和質譜法進行分析。
全文摘要
紫杉醇基因組重排菌株HDFS4-26及紫杉醇高產菌株的選育方法，它涉及一種紫杉醇基因組重排菌株及紫杉醇工程菌株的選育方法。它解決了目前可用于紫杉醇微生物發(fā)酵的菌株的紫杉醇產量仍然較低的問題。紫杉醇基因組重排菌株HDFS4-26為樹狀多節(jié)孢屬于多節(jié)孢屬，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2008年2月28日，保藏號為CCTCC M 208026。紫杉醇高產菌株按以下方法選育一、原生質體制備；二、原生質體的滅活；三、原生質體的融合；四、原生質體再生；五、基因組重排、篩選，即得到紫杉醇高產菌株。菌株HDFS4-26的紫杉醇產量為516.37μg/L。本發(fā)明紫杉醇高產菌株按以下方法選育簡單，效果好，為提供高產紫杉醇的工業(yè)生產菌株奠定了基礎。
文檔編號C12R1/645GK101280281SQ200810064048
公開日2008年10月8日 申請日期2008年2月29日 優(yōu)先權日2008年2月29日
發(fā)明者軍 劉, 周東坡, 平文祥, 張麗娜, 燕 林, 凱 趙 申請人:黑龍江大學