專利名稱：：一種除錳功能菌的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種微生物。
背景技術：
：錳是地殼中含量豐富的金屬元素，普通水體中錳離子的濃度為0.1lmg/L，而厭氧地下水中溶解性的錳離子濃度可高達79mg/L。可溶性錳經(jīng)充氧曝氣能夠生成不溶性沉淀物(如Mn02或MnOOH)。Mn02是高度不可溶物質(zhì)(S—Mn02的溶解度kso僅為10'56)，呈深黑色，可導致供飲用的地下水出現(xiàn)明顯的色度；因此飲用水中的錳必須去除。我國規(guī)定飲用水中錳離子的最高濃度為0.1mg/L，而歐盟已將飲用水中錳離子的最高濃度確定為0.05mg/L。地下水中可溶性Mn(II)的去除通常伴隨著錳離子的氧化、沉淀以及不溶性氧化產(chǎn)物的過濾分離。錳離子發(fā)生的非生物氧化反應如下-"她Ol)]=^[她(u)〗+&[她(n)][Ma]表明Mn(II)的氧化伴隨著MnOx的自催化反應，這種自催化作用在飲用水錳處理工藝中較為重要。Mn(II)非生物氧化由氧作電子供體，通常在pH值大于9的條件下完成，低于9的pH條件下氧化反應速度極慢。絕大多數(shù)的飲用水pH在68之間，這種pH條件下Mn(II)不會發(fā)生氧化反應；因此飲用水中的猛不能通過簡單的曝氣和沉淀法去除。若加入化學藥劑(如KMn04和C102)雖然除錳效果較為理想，但增加了工藝運行費用、反應殘留物和生成的副產(chǎn)物，引起二次污染。生物氧化除錳具有良好的應用前景，但是目前生物氧化除錳主要利用自然選擇建立工程菌群，因此工程菌群生化能力弱、除錳效果差，而且水處理過濾速度慢、不能超過10m/h?，F(xiàn)有水處理除錳生物濾池的建立所需培養(yǎng)、馴化和啟動時間長；一旦工程菌群遭到破壞(中毒等原因?qū)е鹿こ叹劳?其恢復周期長，在此期間出水中錳含量劇增、出水質(zhì)量難以保證，致使該水處理設施不能正常運轉(zhuǎn)，嚴重的將威脅人民群眾的正常生活和生態(tài)環(huán)境。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是為了解決目前生物氧化除錳工程菌群靠自然選擇建立，生化能力弱、除錳效果差，過濾速度慢；水處理除錳生物濾池的建立所需培養(yǎng)、馴化、啟動時間長和工程菌群遭到破壞后恢復周期長的問題，而提供的一種除錳功能菌。除錳功能菌MB32(尸"wc/owowwsp.)屬于假單胞菌屬，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學院微生物研究所，保藏日期為2007年10月30日，保藏號為CGMCCNo.2238;除錳功能菌MB32(尸"Wowo"assp.)為革蘭氏陰性兼性厭氧菌，直或彎的短桿狀，長為13pm，寬為l~1.5^im，細胞兩端圓鈍；在培養(yǎng)基上形成乳白色菌落，不透明，邊緣不規(guī)則，四周微藍；除錳功能菌MB32(/^^/omo"ossp.)具有能源貝亡存顆粒，有芽胞和莢膜，N，N，N，,N，-四甲基對苯二胺(N,N，N，,N，-Tetramethyl-p-Phenylenedia，TMPD)染色為陽性。除錳功能菌MB32(尸化^/owcwassp.)能在pH值為5~8的環(huán)境中生長，具有脂肪酶和硝酸鹽還原性，不具有色氨酸酶、氧化酶、脫氨酶和淀粉酶。除錳功能菌MB32(尸sewc/omo朋ssp.)細菌體內(nèi)有類脂顆粒聚P-羥基丁酸(PHB)和異染顆粒聚合磷酸鹽(Poly-P)，PHB和Poly-P都屬于細菌細胞內(nèi)的能源貯存顆粒，因此除錳功能菌MB32(尸"wAmo"wsp.)可以更好的適應低溫、貧營養(yǎng)生長環(huán)境，具有惡劣環(huán)境適應能力強的優(yōu)點；而且除錳功能菌MB32(尸化^fomowwsp.)有脫氮除磷的功能。本發(fā)明除錳功能菌MB32通過16SrDNA基因序列比對分析與其最相近的種屬是假單胞菌屬的Aewfifomo"oyputida(Dbj:D84020)，同源性為99%，因]t匕豐皮命名為sp.。本發(fā)明除錳功能菌MB32(尸"i^omo"wsp.)具有去除水中Mn"的能力，M^+去除率高于92%。本發(fā)明除錳功能菌MB32(尸^w^w7o"wsp.)的生化能力強、除錳效果好，可以直接投入使用，不僅縮短了水處理除錳生物濾池的建立時間，也可加快過濾速度，并且縮短了工程菌群遭到破壞后的恢復周期，可以在短暫的34小時內(nèi)恢復水處理設施正常運行，保證了出水的質(zhì)量。i^ew^mo"ossp.屬于假單胞菌屬(尸^i^omo"os)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽區(qū)大屯路，圖5是除錳功能菌圖6是除錳功能菌圖7是除錳功能菌中國科學院微生物研究所，保藏日期為2007年10月30日，保藏號為CGMCCNo.2238。圖1是除錳功能菌MB32(戶wi^omo"wsp.)的原子力顯微鏡圖片；圖2是除錳功能菌MB32(Psez^omowwsp.)的原子力顯微鏡圖片；圖3是除錳功能菌MB32(Pww^wwm^sp.)簇生的原子力顯微鏡圖片；圖4是除錳功能菌MB32(尸"Womo"ossp.)簇生的原子力顯微鏡圖片MB32(尸"^fowo"wsp.)中類脂顆粒染色后觀察圖MB320P"Wowo"assp.)中異染顆粒染色后觀察圖MB32(尸"m^ww"似sp.)去除水中Mn"的時間曲線圖，圖7中"■"表示水中Mri"濃度曲線，""表示Mr+去除率曲線。具體實施例方式具體實施方式一本實施方式除錳功能菌MB32CP"^/owo"oysp.)屬于假單胞菌屬，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2007年10月30日，保藏號為CGMCCNo.2238;除錳功能菌MB32(尸"w^mo"wsp.)為革蘭氏陰性兼性厭氧菌，直或彎的短桿狀，長為13pm，寬為11.5nm，細胞兩端圓鈍(如圖1和圖2所示)；在培養(yǎng)基上形成乳白色菌落，不透明，邊緣不規(guī)則，四周微藍；除錳功能菌MB32(尸"i^fomomwsp.)具有能源貯存顆粒，有芽胞和莢膜，N,N,N',N'-四甲基對苯二胺(N,N，N'，N'-Tetramethyl-p-Phenylenedia，TMPD)染色為陽性。除錳功能菌MB32(尸"^fowo"oysp.)能在pH值為58的環(huán)境中生長，具有脂肪酶和硝酸鹽還原性，不具有色氨酸酶、氧化酶、脫氨酶和淀粉酶。除錳功能菌MB32(尸化^tomo"wsp.)常成簇排列(如圖3和圖4所示)。具體實施方式二本實施方式除錳功能菌MB32(i^ei^omomwsp.)是從遼寧省沈陽市張士生物除錳水廠的生物除錳濾池曝氣池壁取泥中篩選得到的。篩選用1L培養(yǎng)基由0.8g蛋白胨、0.2g酵母浸膏，0.1gMnSO4.H2O，0.1gK2HPO4，0.2gMgSO4-7H2O，0.2gNaNO3，0.1gCaCl2，O.lg(NH4)2C03，O.OlgFeS04,7H20和余量的蒸餾水制成；然后滅菌。本實施方式采用平板劃線與平板涂布法相結合進行分菌，采用TMPD法(VandenabeeleJ,DdeBeeretal.Manganeseoxidationbymicrobialconsortiafromsandfilters.Microb.Ecol.1992,24:91-108.)對分離所得菌種進行初篩。本實施方式采用TMPD法的原理是N,N,N'，N'-四甲基對苯二胺(N，N，N',N'-Tetramethyl-p-Phenylenedia，TMPD)可與四價錳反應生成藍色物質(zhì)WursterBlue,利用分光光度法通過測WursterBlue在420nm處的OD值可推知菌落具有Mr^+氧化能力的強弱(菌落無顏色變化的為陰性、無生物除錳功能)。本實施方式除錳功能菌MB32(fto^omo"assp.)16SrDNA測序工作由生物工程公司完成；其中PCR擴增正向引物BSF8/20:5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，，反向引物BSR1541/20:5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3，。本實施方式除錳功能菌MB32(尸化w^wo"ossp.)16SrDNA序列如SEQIDNO.l所示。本實施方式除錳功能菌MB32(尸"^fomowwsp.)生理生化分析結果如表1所示。表1除錳功能菌MB32生理生化實驗分析結果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>生理生化實驗結果表明除錳功能菌MB32(尸"w^wwmwsp.)是兼性厭氧菌，pH8時生長最好，適于在堿性環(huán)境中生長；5。C低溫條件下仍可生長，典型低溫菌種；具有脂肪酶和硝酸鹽還原性，不具有色氨酸酶、氧化酶、脫氨酶和淀粉酶；可將水中的脂肪分解成甘油和脂肪酸，沒有發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生乙酰四'基甲醇的能力，不能在糖代謝過程中分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸。除錳功能菌MB32CP"m^^o"msp.)有脂質(zhì)顆粒聚(3-羥基丁酸(PHB)和異染顆粒聚合磷酸鹽(Poly-P)，脂質(zhì)顆粒PHB和異染顆粒Poly-P都屬于能源貯存顆粒。除錳功能菌MB32(尸M^fowo"oysp.)中脂質(zhì)顆粒染色后觀察圖如圖5所示，除錳功能菌MB32(尸化w^wwwwsp.)中異染顆粒染色后觀察圖如圖6所示。除錳功能菌MB32(尸"i^c^o"wsp.)的發(fā)酵上清液具有較高的除錳活性，試驗表明除錳功能菌MB32(尸^^fowo"wsp.)能夠分泌大量的除錳胞外蛋白酶。接菌培養(yǎng)除錳功能菌MB32(尸^^foww7ossp.)，液體培養(yǎng)液pH值為7.5，在12C低溫條件下培養(yǎng)48h，然后向培養(yǎng)液中加入高濃度Mr^+溶液使培養(yǎng)液中Mn"的濃度為22.32mg/L，液體培養(yǎng)液中Mn"的濃度隨時間的變化曲線如圖7所示；12h內(nèi)Mn"農(nóng)度迅速下降由22.32mg/L降至5.71mg/L，12h后消減程度略趨平緩，36h后趨于穩(wěn)定維持在1.8mg/L左右；36h內(nèi)Mi^+去除率高達92.16%。實驗證明，除錳功能菌MB32(尸^^owo"msp.)具有較高的生物除錳性能，且具有較高的胞外酶活性，通過48h的低溫培養(yǎng)菌株向胞外分泌大量活性蛋白，活性蛋白與M^+相結合，使Mi^+轉(zhuǎn)化為MnOx，得以去除。<110>哈爾濱工業(yè)大學<120>—種除錳功能菌<160>3<210>1<211>1536<212>DNA<213>除錳功能菌MB32CPwWowomwsp.)<220><223>除錳功能菌MB3216SrDNA基因序列<400>1tgatcctggctc3ga^ttg犯cgctggcggcaggcctaacacatgcaagtc60gagcggatgagaagagcttgctcttcgattC3gCggCgg3cgggtgagtaatgcctagga120atctgcctggt解tggggg3caacgtttcgaaagg犯cgctaataccgcatacgtcctac180ggg鄉(xiāng)鄉(xiāng)cagg卿ccttcgggccttgcgCt6Ltcagatgagcctaggtcggattagct240agttggtgaggt犯tggctcacc犯ggcgaCg3tCCgt犯ctggtctgag3ggstg3tca300gtcacactgg犯ctg站acacggtccagactcctacgggaggcagcagtgggg肪tattg360g織atgggcg犯agcctgatccagccatgccgcgtgtgtga卿aggtcttcggattgt420aaagcELCttt鄉(xiāng)ttgggaggaagggcattaacctaatacgttagtgttttgacgttacc480gacagaataagcaccggctaactctgtgccagcagccgcggtaatacagagggtgcaagc540gtt￡L3tCgg￡Lattactgggcgtaaagcgcgcgt鄉(xiāng)tggtttgttaagttggatgtg咖600gccccgggctc犯cctgggaactgcatccaaaactggcasgctagagtacggtagagggt660ggtgg犯Utcctgtgtagcggtg咖tgcgtsgatateiggaaggaacacCElgtggCg朋720ggcgaccacctgg已ctgatsggtgcggiaagcgtggggagcaaacagg8ttagataccctggtagtccacgCCgt3EL3Cg3tgtcaact3gccgttggaatccttgagatt840ttagtggcgcagctaacgcatt犯gttg3Ccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaa900ttgscgggggcccgcacaag-tgtggtttaacgcg犯g犯cctt已ccaggccttgacatgcagsgaactttCC卿g3tggattggtgcct1020tcgggaactctgacacaggtgctgcstggctgtcgtcagctcgtgtcgtg卿tgttggg1080ttaagtcccgtaacgagcgcaacccttgtccttagttaccagcELCgttatggtgggcact1140Ct￡L￡tgg￡Lg￡LCtgccggtgaca犯ccggagga鄉(xiāng)"tgggg8tgacgtcaagtcatcatggc1200CCtt2LCggCCtgggctacacacgtgctacaatggtcggta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