專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種生物除錳除鐵功能菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種微生物。技術(shù)背景水體中鐵的去除工藝較為成熟，單純具有除鐵功能的工程菌也比較多，但鐵和錳是地殼中含量豐富的金屬元素，僅將鐵去除遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足現(xiàn)有的水處理標(biāo)準(zhǔn)。普通水體中錳離子的濃度為0.1~lmg/L，而厭氧地下水中溶解性的錳離子濃度可高達(dá)7-9mg/L。可溶性錳經(jīng)充氧曝氣能夠生成不溶性沉淀物(如Mn02或MnOOH)。、Mn02是高度不可溶物質(zhì)(S—Mn02的溶解度kso僅為1(T56)，呈深黑色，可導(dǎo)致供飲用的地下水出現(xiàn)明顯的色度；因此飲用水中的錳必須去除。我國(guó)規(guī)定飲用水中錳離子的最高濃度為0.1mg/L，而歐盟已將飲用水中錳離子的最高濃度確定為0.05mg/L。地下水中可溶性Mn(II)的去除通常伴隨著錳離子的氧化、沉淀以及不溶性氧化產(chǎn)物的過(guò)濾分離。錳離子發(fā)生的非生物氧化反應(yīng)如下一4她(u)]=b[她(u"+&[她(n)][她^表明Mn(II)的氧化伴隨著MnOx的自催化反應(yīng)，這種自催化作用在飲用水錳處理工藝中較為重要。Mn(II)非生物氧化由氧作電子供體，通常在pH值大于9的條件下完成，低于9的pH條件下氧化反應(yīng)速度極慢。絕大多數(shù)的飲用水pH在68之間，這種pH條件下Mn(II)不會(huì)發(fā)生氧化反應(yīng)；因此飲用水中的錳不能通過(guò)簡(jiǎn)單的曝氣和沉淀法去除。若加入化學(xué)藥劑(如KMn04和C102)雖然除錳效果較為理想，但增加了工藝運(yùn)行費(fèi)用、反應(yīng)殘留物和生成的副產(chǎn)物，引起二次污染。生物氧化除錳具有良好的應(yīng)用前景，但是目前生物氧化除錳主要利用自然選擇建立工程菌群，因此工程菌群生化能力弱、除錳效果差，而且水處理過(guò)濾速度慢、不能超過(guò)10m/h?，F(xiàn)有水處理除錳生物濾池的建立所需培養(yǎng)、馴化和啟動(dòng)時(shí)間長(zhǎng)；一旦工程菌群遭到破壞(中毒等原因?qū)е鹿こ叹劳?其恢復(fù)周3期長(zhǎng)，在此期間出水中錳含量劇增、出水質(zhì)量難以保證，致使諄水處理設(shè)施不能正常運(yùn)轉(zhuǎn)，嚴(yán)重的將威脅人民群眾的正常生活和生態(tài)環(huán)境。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是為了解決目前生物氧化除錳工程菌群靠自然選擇建立，生化能力弱、除錳效果差，過(guò)濾速度慢；水處理除錳生物濾池的建立所需培養(yǎng)、馴化、啟動(dòng)時(shí)間長(zhǎng)和工程菌群遭到破壞后恢復(fù)周期長(zhǎng)的問(wèn)題，而提供的一種生物除錳除鐵功能菌。生物除錳除鐵功能菌MS604C&go^cten'wmsp.)屬于鞘氨醇桿菌屬，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏日期為2007年10月30日，保藏號(hào)為CGMCCNo.2240;生物除錳除鐵功能菌MS604CS^/z/"gokc/eWwmsp.)為革蘭氏陰性好氧菌，為多形態(tài)桿菌，長(zhǎng)為12pm，寬為0.30.4^im，細(xì)胞兩端圓鈍；在培養(yǎng)基上形成乳黃色菌落，菌落圓形，不透明，邊緣整齊；生物除錳除鐵功能菌MS6040S;^'"gok^en'wmsp.)具有能源貯存顆粒，有芽胞和莢膜，N，N，N'，N'-四甲基對(duì)苯二胺(N,N，N，,N，-Tetramethyl-p-Phenylenedia，TMPD)染色為陽(yáng)性。生物除錳除鐵功能菌MS604GS//n'"go6a"m'wmsp.)能在pH值為6~9的環(huán)境中生長(zhǎng)，具有脂肪酶和硝酸鹽還原性，不具有色氨酸酶、氧化酶、脫氨酶和淀粉酶。生物除錳除鐵功能菌MS604GS/^'"go^"m'訓(xùn)sp.)細(xì)菌體內(nèi)有類(lèi)脂顆粒聚卩-羥基丁酸(PHB)和異染顆粒聚合磷酸鹽(Poly-P)，PHB和Poly-P都屬于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的能源貯存顆粒，因此生物除錳除鐵功能菌MS604(^/n'"go^"en'簡(jiǎn)sp.)可以更好的適應(yīng)低溫、貧營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)環(huán)境，具有惡劣環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明生物除錳除鐵功能菌MS604通過(guò)16SrDNA基因序列比對(duì)分析與其最相近的種屬是鞘氨醇桿菌屬的5^/'"goZwcfen'wwsp.CI01(GenbankDQ530064.1)，同源性為97%，因此被命名為5^/7/wgo&cfen'wwsp.。本發(fā)明生物除錳除鐵功能菌MS604具有去除水中Mr^+和F^+的能力，Mi^+去除率高于79%，F(xiàn)e"去除率率高于90%。本發(fā)明生物除錳除鐵功能菌MS仞《5^2/"^^ac^n'wmsp.)的生化能力強(qiáng)、除錳、除鐵效果好，可以直接投入使用，不僅縮短了水處理除錳除鐵生物濾池的建立時(shí)間，也可加快過(guò)濾速度，并且縮短了工程菌群遭到破壞后的恢復(fù)周期，可以在短暫的3~4小時(shí)內(nèi)恢復(fù)水處理設(shè)施正常運(yùn)行，保證了出水的質(zhì)量。S;W"go^cfen'wmsp.屬于鞘氨醇桿菌屬(Sp/n'wgo^cfen^附)保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏日期為2007年10月30日，保藏號(hào)為CGMCCNo.2240。圖1是生物除錳除鐵功能菌MS604(5^/wgoZw"en'^7sp.)中異染顆粒染色后觀察圖，圖2是生物除錳除鐵功能菌MS604CSp/z/"go^c^/畫(huà)sp.)芽胞染色后觀察圖，圖3是生物除錳除鐵功能菌MS604CS/7/H'"go&cfen'wwsp.)中類(lèi)脂顆粒染色后觀察圖，圖4是生物除錳除鐵功能菌MS604(S/7/z/"go^c^7'wmsp.)莢膜染色后觀察圖，圖5是生物除錳除鐵功能菌MS604C/"go&cfen'謂sp.)去除水中Mn2+的時(shí)間曲線(xiàn)圖，圖6是生物除錳除鐵功能菌MS604(5^2/"gokz"m'wwsp.)去除水中Mn2+的pH值關(guān)系曲線(xiàn)圖，圖7是生物除錳除鐵功能菌MS604(Sp/z/wgo^c^/調(diào)sp.)培養(yǎng)時(shí)間與菌液濁度關(guān)系曲線(xiàn)，圖8是生物除錳除鐵功能菌MS604CS^^go&cfm'wmsp.)去除水中Fe"的時(shí)間曲線(xiàn)圖。具體實(shí)施方式具體實(shí)施方式一本實(shí)施方式生物除錳除鐵功能菌MS604CSp/n'"go^"m'Wmsp.)屬于鞘氨醇桿菌屬，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期為2007年10月30日，保藏號(hào)為CGMCCNo,2240;生物除錳除鐵功能菌MS604GSp/2/"go&cfen'畫(huà)sp.)為革蘭氏陰性好氧菌，為多形態(tài)桿菌，長(zhǎng)為l~2pm，寬為0.3~0.4pm，細(xì)胞兩端圓鈍；在培養(yǎng)基上形成乳黃色菌落，菌落圓形，不透明，邊緣整齊；生物除錳除鐵功能菌MS6040Sp/2/"gOk^&WMmsp.)具有能源貯存顆粒，有芽胞和莢膜(如圖2和圖4所示)，N,N，N',N'—四甲基對(duì)苯二胺(N,N,N',N'-Tetramethyl-p-Phenylenedia，TMPD)染色為陽(yáng)性。生物除錳除鐵功能菌MS604(S//H'"go&"m^msp.)能在pH值為69的環(huán)境中生長(zhǎng)，具有脂肪酶和硝酸鹽還原性，不具有色氨酸酶、氧化酶、脫氨酶和淀粉酶。生物除錳除鐵功能菌MS604(Sp/n'"gok7cteWwwsp.)單個(gè)或成簇排列，菌落大。具體實(shí)施方式二本實(shí)施方式生物除錳除鐵功能菌MS604(Sp/7/"go^"m'訓(xùn)sp.)是從遼寧省沈陽(yáng)市張士生物除錳水廠的生物除錳濾池曝氣池壁取泥中篩選得到的。篩選用1L培養(yǎng)基由0.8g蛋白胨、0.2g酵母浸膏，O.lgMnS04.H20，0.1gK2HPO4，0.2gMgS04'7H20，0.2gNaNO3，0.1gCaCl2，0.1g(NH4)2CO3，O.OlgFeS04'7H20和余量的蒸餾水制成；然后滅菌。本實(shí)施方式采用平板劃線(xiàn)與平板涂布法相結(jié)合進(jìn)行分菌，采用TMPD法(VandenabeeleJ,DdeBeeretal.Manganeseoxidationbymicrobialconsortiafromsandfilters.Microb.Ecol.1992,24:91-108.)對(duì)分離所得菌種進(jìn)行初篩。本實(shí)施方式采用TMPD法的原理是N，N,N',N'-四甲基對(duì)苯二胺(N，N，N',N'-Tetramethyl-p-Phenylenedia，TMPD)可與四價(jià)錳反應(yīng)生成藍(lán)色物質(zhì)WursterBlue,利用分光光度法通過(guò)測(cè)WursterBlue在420nm處的OD值可推知菌落具有Mn"氧化能力的強(qiáng)弱(菌落無(wú)顏色變化的為陰性、無(wú)生物除錳功能)。本實(shí)施方式生物除錳除鐵功能菌MS604(5^/"gok^en'wwsp.)16SrDNA測(cè)序工作由生物工程公司完成；其中PCR擴(kuò)增正向引物BSF8/20:5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3,，反向引物BSR1541/20:5，-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'。本實(shí)施方式生物除錳除鐵功能菌MS604(S;/7/"go^c^"/wmsp.)16SrDNA序列如SEQIDNO,l所示。本實(shí)施方式生物除錳除鐵功能菌MS604(&/7/wgok^eWwmsp.)生理生化分析結(jié)果如表1所示。表1生物除錳除鐵功能菌MS604生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)名稱(chēng)試驗(yàn)結(jié)果結(jié)果所說(shuō)明的問(wèn)題乙酰甲基醇試驗(yàn)一沒(méi)有發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生乙酰四基甲醇的能力。甲基紅試驗(yàn)一不能在糖代謝過(guò)程中分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸。淀粉水解試驗(yàn)—不能產(chǎn)生能夠水解淀粉的淀粉酶。產(chǎn)氨試驗(yàn)--不能產(chǎn)生脫氨酶<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明生物除錳除鐵功能菌MS604(S;/H77go^c欣Z謂sp.)是好氧菌，適于在中性或堿性環(huán)境中生長(zhǎng)；O'C低溫條件下仍可生長(zhǎng)，典型低溫菌種；具有脂肪酶和硝酸鹽還原性，不具有色氨酸酶、氧化酶、脫氨酶和淀粉酶；可將水中的脂肪分解成甘油和脂肪酸，沒(méi)有發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生乙酰四基甲醇的能力，不能在糖代謝過(guò)程中分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸。生物除錳除鐵功能菌MS604(5^/z/"go^c^7'wwsp.)有脂質(zhì)顆粒聚卩-羥基丁酸(PHB)和異染顆粒聚合磷酸鹽(Poly-P)，脂質(zhì)顆粒PHB和異染顆粒Poly-P都屬于能源貯存顆粒。生物除錳除鐵功能菌MS604CS//z/"go^"m'訓(xùn)sp.)中脂質(zhì)顆粒染色后觀察圖如圖3所示，生物除錳除鐵功能菌MS604(5^/"go6""m^wsp.)中異染顆粒染色后觀察圖如圖1所示。生物除錳除鐵功能菌MS604CS//n'wgo6acfen'wwsp.)的發(fā)酵上清液具有較高的除錳活性，試驗(yàn)表明生物除錳除鐵功能菌MS604(S—/"go6a"m'訓(xùn)sp.)能夠分泌大量的除錳胞外蛋白酶。接菌培養(yǎng)生物除錳除鐵功能菌MS604CS//7/"gok^en'wmsp.)，液體培養(yǎng)液pH值為7.5，在lrC低溫條件下培養(yǎng)48h，然后向培養(yǎng)液中加入高濃度Mn^溶液使培養(yǎng)液中Mi^+的濃度為9mg/L，液體培養(yǎng)液中Mr+的濃度隨時(shí)間的變化曲線(xiàn)如圖5所示；1224hMn"濃度有大幅度消減，由8.47mg/L降至2.98mg/L。24h后消減程度略趨平緩，直到48h后趨于穩(wěn)定(2.35mg/L)，之后維持在2mg/L左右，到72h時(shí)，Mn"去除率達(dá)到79.08%。1。實(shí)驗(yàn)證明，生物除錳除鐵功能菌MS604(5^/7/wgo^cfen'wmsp.)具有較高的生物除錳性能，且具有較高的胞外酶活性，通過(guò)48h的低溫培養(yǎng)菌株向胞外分泌大量活性蛋白，活性蛋白與Mr+相結(jié)合，使Mi^+轉(zhuǎn)化為MnOx，得以去除。由圖6可知，生物除錳除鐵功能菌MS604(5^/2/"go^c^7'應(yīng)sp.)的最佳活性pH值為8，生物除錳除鐵功能菌MS604(Sp/z/"go6"cten'wwsp.)在pH值為14的環(huán)境中幾乎無(wú)法去除Mn2、主要因?yàn)檩^低的pH環(huán)境不適合菌株生長(zhǎng)，同時(shí)對(duì)酶活有抑制作用；pH值大于4去除率開(kāi)始迅猛增長(zhǎng)；pH值大于9Mi+去除率雖然略有下降，但仍保持在較高的范圍內(nèi)，雖然生理生化試驗(yàn)表明值pH大于10生物除錳除鐵功能菌MS604(&WMgok^m^msp.)根本不能生長(zhǎng)，但由于Mn2+在pH〉9.5的堿性環(huán)境下可以被溶解氧迅速氧化成Mn02而析出，因此pH為10~14時(shí)Mr^+去除率仍高達(dá)75%左右。考察菌濁度的目的是確定MS604的生長(zhǎng)周期，為工程應(yīng)用提供指導(dǎo)性的參數(shù)。由圖7可知接種時(shí)原始菌濁度(OD值)為0.12，接種后12h內(nèi)細(xì)菌數(shù)量迅速增加，OD值高達(dá)0.6;之后的36小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)明顯的波動(dòng)狀態(tài)，菌濁度在經(jīng)過(guò)迅速下降-迅速上升-下降的變化后趨于平穩(wěn)，穩(wěn)定在OD值0.48左右。這種無(wú)規(guī)律的變化曲線(xiàn)很難準(zhǔn)確測(cè)出MS604的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。在培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)接種12h后，培養(yǎng)液底部出現(xiàn)細(xì)菌聚集現(xiàn)象，這可能是因?yàn)镸S604胞外存在莢膜和粘液，使較高濃度的細(xì)菌在相互接觸過(guò)程中形成菌膠團(tuán)。因而測(cè)定OD值時(shí)，細(xì)菌分布不均勻，導(dǎo)致數(shù)值的不真實(shí)可靠。由此可見(jiàn)，使用常規(guī)方法，即通過(guò)測(cè)菌濁度，確定生長(zhǎng)曲線(xiàn)的方法對(duì)生物除錳除鐵功能菌MS604(5^/z/"go6<3cte/-/wmsp.)不適合。接菌培養(yǎng)生物除錳除鐵功能菌MS604(5^/z/"go^c欣/wwsp.)，液體培養(yǎng)液pH值為7.5，在12。C低溫條件下培養(yǎng)48h，然后向培養(yǎng)液中加入高濃度Fe2+溶液使培養(yǎng)液中Fe^的濃度為14mg/L，液體培養(yǎng)液中Mi+的濃度隨時(shí)間的變化曲線(xiàn)如圖8所示，12h內(nèi)F^+去除率迅速增高，去除率高達(dá)72.69%，F(xiàn)e2+濃度由Mmg/L降至6.56mg/L，24h后去除率趨于穩(wěn)定，F(xiàn)e^去除率維持在90%左右。序列表<110>哈爾濱工業(yè)大學(xué)<120>—種生物除錳除鐵功能菌<160>3<210〉1<211>1522<212>DNA<213〉生物除錳除鐵功能菌MS604(&W"go^c^7'wmsp.)<220><223>生物除錳除鐵功能菌MS60416SrDNA基因序列<400〉1犯gg鄉(xiāng)tg3atcggttttaggcttgacggcgattactagtggcttttagcacgtgtgtactgtttgcacgggttgcgctgcagcaccta鄉(xiāng)cccgggtgggcccccgttaacgctttccgtggactactaccagcttagctacttgtcgcgatggttgtccagccgcaccctaacacggcggtgtgtaCg3atCC33Cagattagcatgccccggacgaggcagtctgcgttgcgggagtttcgtgtc犯ggttcctccaattcctttgct犯gacgccagggtatctgtg昭ctgccttattccgccagccaccgtaccttccggtactccttgcggc犯ggcccggttcstggggtcatattgctat犯gggccattttagagtcccttaacccaaccg犯ggacggCgt已tC3tCgagtttcacctggctgtctaaatcctgttcttcgc犯tcgcacttcaaattttcacccctcggctacctttcacatgcttgaacgtattccgsgttg卿tgtagctgccgstgacttgsccaccattaccacctcacggagaccgtctcg犯ttaaacccttgcgggcgtcgccaacstgatccccacgg恥ttctaBgggattcaagcg￡LCtt￡Lait￡tggttacgactttaggtaccccaccgcgtcatacccc3atcccgctgtaccacgtcgcccccatgctggcaacacgagctgatggtctcttcacatgctccttactccccagCg3gtt3tC3ctttcgtgcaacatatctatccatcagtatgccgcctacgagccccaatt60caactttcat120tgctgatacg180gaactgtgaa240tccattgtag300accttcctca360ctaaacatag420cgacagccat480actaactttc540ccgcttgtgc600gtggataact660tcgtttaggg720tcagcgtcaa780gcatttcacc840caaaggcact900cacccttt肌960acccaataaatccggat犯cgctcggatcctagccgatccttattcttccagtacattcagtttacaacccatagggcsgcttccgcccattgaccaatattccttactgcagtaccagtgtgggggattctcctctcaggttaccctacc犯ctagctaatgtcacgcgatatcccgatgccggtacattatattatgcCCCtg3t犯3ggt鄉(xiāng)ttgctcacgcgtt3agcaagctctgattccaatcccgtccgacttcctgagccaggatc犯actct1522tccgtattaccgcggctgctggcacggagt翻gctaaatacscgt3tttaggtttattcctg1080tcatcctgcacgcggcatggctggttc鄉(xiāng)1140ctgcctcccgtaggagtctggtccgtgtct1200agcccctagacatcgtcgccttggt犯gcc1260agcccatctctatcctataaatatttaata1320ggtgtt犯tctctctttcgag3ggCt3tCC1380cgcacccgtgcgccactctcatggaaccag1440tgcatgtatt鄉(xiāng)cctgccgctagcgttca1500<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)E.coli16SrRNA基因8~20bp設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增正向引物BSF8/20序列。<400>2卿gtttgatcctggctcag20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)E.coli16SrRNA基因152(M541bp設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增正向引物B《R1541/20序列。<400>3aaggaggtgatccagccgca2010權(quán)利要求1、一種生物除錳除鐵功能菌，其特征在于生物除錳除鐵功能菌MS604(Sphingobacteriumsp.)屬于鞘氨醇桿菌屬，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期為2007年10月30日，保藏號(hào)為CGMCCNo.2240；生物除錳除鐵功能菌MS604(Sphingobacteriumsp.)為革蘭氏陰性好氧菌，為多形態(tài)桿菌，長(zhǎng)為1～2μm，寬為0.3～0.4μm，細(xì)胞兩端圓鈍；在培養(yǎng)基上形成乳黃色菌落，菌落圓形，不透明，邊緣整齊；生物除錳除鐵功能菌MS604(Sphingobacteriumsp.)具有能源貯存顆粒，有芽胞和莢膜，N，N，N’，N’-四甲基對(duì)苯二胺染色為陽(yáng)性。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生物除錳除鐵功能菌，其特征在于生物除錳除鐵功能菌MS604CSp/z/"go6""m'M/wsp.)能在pH值為6~9的環(huán)境中生長(zhǎng)，具有脂肪酶和硝酸鹽還原性，不具有色氨酸酶、氧化酶、脫氨酶和淀粉酶。全文摘要一種生物除錳除鐵功能菌，它涉及一種微生物。它解決了目前生物氧化除錳工程菌群靠自然選擇建立，生化能力弱、除錳效果差；水處理除錳生物濾池的建立所需培養(yǎng)、馴化、啟動(dòng)時(shí)間長(zhǎng)和工程菌群遭到破壞后恢復(fù)周期長(zhǎng)的問(wèn)題。生物除錳除鐵功能菌MS604(Sphingobacteriumsp.)屬于鞘氨醇桿菌屬，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期為2007年10月30日，保藏號(hào)為CGMCCNo.2240；菌株MS604為革蘭氏陰性好氧菌，為多形態(tài)桿菌，長(zhǎng)為1～2μm，寬為0.3～0.4μm，細(xì)胞兩端圓鈍；在培養(yǎng)基上形成乳黃色菌落，菌落圓形，不透明，邊緣整齊；菌株MS604具有能源貯存顆粒，有芽胞和莢膜，N，N，N’，N’-四甲基對(duì)苯二胺染色為陽(yáng)性。本發(fā)明生物除錳除鐵功能菌MS604具有去除水中Mn²⁺和Fe²⁺的能力，Mn²⁺去除率高于79％，F(xiàn)e²⁺去除率率高于90％。文檔編號(hào)C12R1/01GK101260376SQ20081006381公開(kāi)日2008年9月10日申請(qǐng)日期2008年1月7日優(yōu)先權(quán)日2008年1月7日發(fā)明者杰張,冬李,焱趙申請(qǐng)人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)