專利名稱：：一種生物除鐵除錳功能菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種微生物。技術(shù)背景水體中鐵的去除工藝較為成熟，單純具有除鐵功能的工程菌也比較多，但鐵和錳是地殼中含量豐富的金屬元素，僅將鐵去除遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足現(xiàn)有的水處理標(biāo)準(zhǔn)。普通水體中錳離子的濃度為0.1lmg/L，而厭氧地下水中溶解性的錳離子濃度可高達(dá)7-9mg/L?？扇苄藻i經(jīng)充氧曝氣能夠生成不溶性沉淀物(如Mn02或MnOOH)。Mn02是高度不可溶物質(zhì)(5—Mn02的溶解度kso僅為1(T56)，呈深黑色，可導(dǎo)致供飲用的地下水出現(xiàn)明顯的色度；因此飲用水中的錳必須去除。我國規(guī)定飲用水中錳離子的最高濃度為0.1mg/L，而歐盟已將飲用水中錳離子的最高濃度確定為0.05mg/L。地下水中可溶性Mn(II)的去除通常伴隨著錳離子的氧化、沉淀以及不溶性氧化產(chǎn)物的過濾分離。錳離子發(fā)生的非生物氧化反應(yīng)如下—4她(n)]=^她01)]+fc[她(ii)][她cv]表明Mn(II)的氧化伴隨著MnOx的自催化反應(yīng)，這種自催化作用在飲用水錳處理工藝中較為重要。Mn(II)非生物氧化由氧作電子供體，通常在pH值大于9的條件下完成，低于9的pH條件下氧化反應(yīng)速度極慢。絕大多數(shù)的飲用水pH在6~8之間，這種pH條件下Mn(II)不會(huì)發(fā)生氧化反應(yīng)；因此飲用水中的錳不能通過簡單的曝氣和沉淀法去除。若加入化學(xué)藥劑(如KMn04和C102)雖然除錳效果較為理想，但增加了工藝運(yùn)行費(fèi)用、反應(yīng)殘留物和生成的副產(chǎn)物，引起二次污染。生物氧化除錳具有良好的應(yīng)用前景，但是目前生物氧化除錳主要利用自然選擇建立工程菌群，因此工程菌群生化能力弱、除錳效果差，而且水處理過濾速度慢、不能超過10m/h?，F(xiàn)有水處理除錳生物濾池的建立所需培養(yǎng)、馴化和啟動(dòng)時(shí)間長；一旦工程菌群遭到破壞(中毒等原因?qū)е鹿こ叹劳?其恢復(fù)周期長，在此期間出水中錳含量劇增、出水質(zhì)量難以保證，致使該水處理設(shè)施不能正常運(yùn)轉(zhuǎn)，嚴(yán)重的將威脅人民群眾的正常生活和生態(tài)環(huán)境。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是為了解決目前生物氧化除錳工程菌群靠自然選擇建立，生化能力弱、除錳效果差；水處理除錳生物濾池的建立所需培養(yǎng)、馴化、啟動(dòng)時(shí)間長和工程菌群遭到破壞后恢復(fù)周期長的問題，而提供的一種生物除鐵除錳功能菌。生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C7zo^eoto"m'wwsp.)屬于金黃桿菌屬，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏日期為2007年10月30日，保藏號為CGMCCNo.2239;生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C7z^^oZ)""en'wmsp.)為好氧菌，長為1.52pm，寬為0.8~l.l|am，短桿狀細(xì)胞，兩端鈍圓，多個(gè)細(xì)菌聚集或呈鏈狀排列，形成菌膠團(tuán)，有共同的莢膜；在培養(yǎng)基上形成棕黃色菌落，不透明，菌落為圓形，二分裂生殖；生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C77o^o6。"m'Mmsp.)具有能量貯存顆粒，無芽胞，N，N，N，，N，-四甲基對苯二胺(TMPD)染色為陽性。生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C770^o^"m'wmsp.)能在pH值為7~10的環(huán)境中生長，具有淀粉酶、氧化酶和硝酸鹽還原性，不具有脂肪酶、色氨酸酶和脫氨酶。生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C/2，eok^en'謂sp.)有脂質(zhì)顆粒聚(3-羥基丁酸(PHB)和異染顆粒聚合磷酸鹽(Poly-P)，脂質(zhì)顆粒PHB和異染顆粒Pdy-P都屬于能量貯存顆粒，因此生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C720^o^"m'簡sp.)可以適應(yīng)低溫、貧營養(yǎng)生長環(huán)境，具有惡劣環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明生物除鐵除錳功能菌MSB-4通過16SrDNA基因序列比對分析與其最相近的種屬是金黃桿菌屬的C770^eok"eWMwsp.TM3-8，同源性為99%,因此被命名為C7zo^eo6acfen'wwsp.。本發(fā)明生物除鐵除錳功能菌MSB-4(0，eo^cm'謂sp.)不但能去除水中的Mr^+，還能去除水中的Fe2、Mi^+去除率高于94.44%，F(xiàn)e2+去除率高于90.13%。本發(fā)明生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C/o^o^cten'謂sp.)的生化能力強(qiáng)、除錳效果好，可以直接投入使用，不僅縮短了水處理除錳生物濾池的建立時(shí)間，也可加快過濾速度，并且縮短了工程菌群遭到破壞后的恢復(fù)周期，可以在短暫的34小時(shí)內(nèi)恢復(fù)水處理設(shè)施正常運(yùn)行，保證了出水的質(zhì)量。C7zo^eo6(3cfen.w附sp.屬于金黃桿菌屬(G/w3^e06a"en.wm)i呆藏于中SH斂生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏日期為2007年10月30日，保藏號為CGMCCNo.2239。圖1是生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C720^o&c欣/蘭sp.)的原子力顯微鏡圖片；圖2是生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C770^o6fl"en'調(diào)sp.)的原子力顯微鏡圖片；圖3是生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C/z，eo^cfen'謂sp.)中脂質(zhì)顆粒染色后觀察圖；圖4是生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C72，eo^"m',sp.)中異染顆粒染色后觀察圖；圖5是生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C7z，eo^"en'訓(xùn)sp.)去除水中Mn2+的時(shí)間曲線圖；圖6是生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C/20^06a"eWw/wsp.)去除水中Fe"的時(shí)間曲線圖。具體實(shí)施方式具體實(shí)施方式一本實(shí)施方式生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C7zo^oZ^"m'wwsp.)屬于金黃桿菌屬，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期為2007年10月30日，保藏號為CGMCCNo.2239;生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C7zo^oto"m'畫sp.)為好氧菌，長為1.52pm，寬為0.81.1pm，短桿狀細(xì)胞，兩端鈍圓(如圖1和圖2所示)，多個(gè)細(xì)菌聚集或呈鏈狀排列，形成菌膠團(tuán)，有共同的莢膜；在培養(yǎng)基上形成棕黃色菌落，不透明，菌落為圓形，二分裂生殖；生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C7zo^o&"m'"wsp.)具有能量貯存顆粒，無芽胞，N,N,N，，N，—四甲基對苯二胺(TMPD)染色為陽性。生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C/7o^eokc^7'Mwsp.)能在pH值為7~10的環(huán)境中生長，具有淀粉酶、氧化酶和硝酸鹽還原性，不具有脂肪酶、色氨酸酶和脫氨酶。生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C7zo^o^cten'wmsp.)趨向于形成35個(gè)或更多的細(xì)胞組成的鏈。具體實(shí)施方式二本實(shí)施方式生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C72o^ok^m'騰sp.)是從遼寧省沈陽市張士生物除錳水廠的生物除錳濾池曝氣池壁取泥中篩選得到的。篩選用1L培養(yǎng)基由0.8g蛋白胨、0.2g酵母浸膏，0.1gMnSO4.H2O，0,lgK2HPO4，0.2gMgS04'7H20，0.2gNaNO3，0.1gCaCl2，0.1g(NH4)2CO3，O.OlgFeS04'7H20和余量的蒸餾水制成；然后滅菌。本實(shí)施方式采用平板劃線與平板涂布法相結(jié)合進(jìn)行分菌，采用TMPD法(VandenabeeleJ，DdeBeeretal.Manganeseoxidationbymicrobialconsortiafromsandfilters.Microb.Ecol.1992,24:91-108.)對分離所得菌種進(jìn)行初篩。本實(shí)施方式采用TMPD法的原理是N，N,N',N'-四甲基對苯二胺(N，N，N',N'-Tetramethyl-p-Phenylenedia，TMPD)可與四價(jià)錳反應(yīng)生成藍(lán)色物質(zhì)WursterBlue,利用分光光度法通過測WursterBlue在420nm處的OD值可推知菌落具有,2+氧化能力的強(qiáng)弱(菌落無顏色變化的為陰性、無生物除錳功能)。本實(shí)施方式生物除鐵除錳功能菌MSB-4(CV^eoZ)""m'"wsp.)16SrDNA測序工作由生物工程公司完成；其中PCR擴(kuò)增正向引物BSF8/20:5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，，反向引物BSR1541/20:5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3，。本實(shí)施方式生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C/zo^^^a"en'wmsp.)16SrDNA序列如SEQIDNO.l所示。本實(shí)施方式生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C/20^oZ)a"en'Mmsp.)生理生化分析結(jié)果如表l所示。表1生物除鐵除錳功能菌MSB-4生理生化分析結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>酸。硝酸鹽還原試驗(yàn)+具有硝酸還原鹽能力氧化酶試驗(yàn)+可以和細(xì)胞色素a、b、c構(gòu)成氧化酶系的氧化酶產(chǎn)n引哚試驗(yàn)一不具有能分解色氨酸使之形成吲哚的色氨酸酶明膠液化試驗(yàn)—沒有分解蛋白質(zhì)的能力產(chǎn)硫化氫試驗(yàn)—不能分解含硫有機(jī)物產(chǎn)生硫化氫PH值試驗(yàn)pH7~10(pH8~9時(shí)生長最好)適于在堿性環(huán)境中生長生長溫度試驗(yàn)2037°C一般溫度下都可以正常生長需氧性的測定上部生長屬于好氧型的細(xì)菌生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C7o^ok^m'訓(xùn)sp.)是好氧菌，適于在偏堿性水環(huán)境生長；具淀粉酶和氧化酶；不具有脂肪酶、色氨酸酶、脫氨酶；沒有發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生乙酰四基甲醇的能力；不能在糖代謝過程中分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸；生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C/zo^eo^c&n'wmsp.)有脂質(zhì)顆粒聚P-羥基丁酸(PHB)和異染顆粒聚合磷酸鹽(Poly-P)，脂質(zhì)顆粒PHB和異染顆粒Poly-P都屬于貯存顆粒。生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C/2，eoZ^ten'謂sp.)中脂質(zhì)顆粒染色后觀察圖如圖3所示，生物除鐵除錳功能菌MSB-4(02o^ok"m'iw7sp.)中異染顆粒染色后觀察圖如圖4所示。生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C/zo^o6acten'wmsp.)的發(fā)酵上清液具有較高的除錳活性，試驗(yàn)表明生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C7zrj^M""m'謂sp.)能夠分泌大量的除錳胞外蛋白酶。接菌培養(yǎng)生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C7w7"o6""en'wwsp.)，液體培養(yǎng)液pH值為7.5，在12'C的條件下培養(yǎng)48h，然后向培養(yǎng)液中加入Mr+溶液使培養(yǎng)液中Mi^+的濃度為5.6mg/L，液體培養(yǎng)液中Mi產(chǎn)的濃度隨時(shí)間的變化曲線如圖5所示；在1224h期間，Mr產(chǎn)去除率迅速升高，達(dá)80%。，直到48h后趨于穩(wěn)定，Mn"去除率達(dá)到94.44%。接菌培養(yǎng)生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C/zo^o^"m'訓(xùn)sp.)，液體培養(yǎng)液pH值為7.5，在12'C的條件下培養(yǎng)48h，然后向培養(yǎng)液中加入F^+溶液使培養(yǎng)液中Ff的濃度為，14mg/L，液體培養(yǎng)液中F^+的濃度隨時(shí)間的變化曲線如圖6所示；在12h內(nèi)，F(xiàn)e"去除率迅速增高，去除率高達(dá)81%，F(xiàn)e"濃度由14mg/L降至2.66mg/L。24h后，去除率趨于穩(wěn)定，F(xiàn)e"去除率達(dá)到90.13%。實(shí)驗(yàn)證明，生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C7z，eoZ^"m'謂sp.)屬具除鐵除錳功能的好氧菌種，具異染顆粒、類脂粒，易形成菌膠團(tuán)，對外界不良環(huán)境具有較強(qiáng)抗性。MSB-4具有較高的鐵錳去除率，對F^+去除率高達(dá)90.13%，Mn2+去除率高達(dá)94.44%。<110>哈爾濱工業(yè)大學(xué)<120>—種生物除鐵除錳功能菌<160>3<210>1<211>1515<212>DNA<213>生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C/20^o6a"en'ww平)<220><223>生物除鐵除錳功能菌MSB-416SrDNA基因序列<400>1tgatccagccgcaccttccggtacggctaccttgttacgscttagcccta60gttacttgttttaccctaggcagctcctgttacggtcaccgacttcaggtaccccaasct120tccatggcttgacgggcggtgtgtaca鄉(xiāng)cccggg犯cgtattcaccgcatcatggctg180atatgcgattactagcgattccagcttcat卿gtcgagttgcagactccaatccgaact240g卿ccggctttcgagattcgcatcctatcgctaggt已gctgccctctgtaccggccatt300gt3ttacgtgtgtggccc犯ggcgt已鄉(xiāng)gccgtgatgatttgacgtcatccccaccttc360CtCtCtELCttgcgtaggcagtctcactagagtccccaeictgaatgatggcaactagtgac420郷ggttgcgctcgttgcaggsctt幼cct幼C3CCtCgLCggcacgsgctgscgac^cc480atgcagcacctccga^gaaaagtctatttctaaaxxtgtc540taagccttggtaaggttcctcgcgtatcatcgaatta犯ccacataatccaccgcttgtg600cgggcccccgtcaattcctttgagtttcattcttgcg犯cgtactccccaggtggct犯c660ttatcactttcgcttagtctctg犯tccga￡Lg￡LCCC￡Laa3acgagttagcatcgtttacg720gcgtgg已ctacc已gggtatctaatcctgttcgctccccacgctttcgtccatcagcgtca780agtgacctgccttcgcaattggtgttctaagtaatatctatgcatttcac840cgctacactaCtt已ttCC3gccacttctactttactca^gacctgcagtatc犯tggcag900tttcatagtta已gctatg3gatttcaccactgacttacagatccgcctacgg3CCCttt3960atccggat犯cgcttgcaccctccgtattaccgcggctgctggcacggag1020ttagccggtgcttattcgtatagtaccttcagctttccacacgtgga犯ggtttatccct1080agtttacaacccatagggccgtcgtccttxacgcgg抓ggctgg已tc觀1140gctctcacccattgtccaatattcctxactgctgcctcccgtaggagtctggtccgtgtc1200tcagtaccagtgtgggggatcaccctctcaggccccctaaagatcactgacttggtaggc1260cgttaccctaccaactatctaatcttgcgcgtgcccatctctatccaccggagttttC331320ta犯已a(bǔ)acgatgccgtttcttatattatggggtattaatcttcctttcgaaaggctatcc1380CCCtg3t犯3ggc鄉(xiāng)ttgcacacgtgttccgcacccgtacgccgctctctctattccga1440agaataaataccgctcggcttgcatgtgttaggcctcccgctagcgttcatcctgagcca1500ggatcaaactctaat1515<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)E.coli16SrRNA基因8~20bp設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增正向引物BSF8/20序列<400>2agagtttgatcctggctcag20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)E.coli16SrRNA基因1520~1541bp設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增正向引物BSR1541/20序列。<400>3aaggaggtgatccagccgca20權(quán)利要求1、一種生物除鐵除錳功能菌，其特征在于生物除鐵除錳功能菌MSB-4(Chryseobacteriumsp.)屬于金黃桿菌屬，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期為2007年10月30日，保藏號為CGMCCNo.2239；生物除鐵除錳功能菌MSB-4(Chryseobacteriumsp.)為好氧菌，長為1.5～2μm，寬為0.8～1.1μm，短桿狀細(xì)胞，兩端鈍圓，多個(gè)細(xì)菌聚集或呈鏈狀排列，形成菌膠團(tuán)，有共同的莢膜；在培養(yǎng)基上形成棕黃色菌落，不透明，菌落為圓形，二分裂生殖；生物除鐵除錳功能菌MSB-4(Chryseobacteriumsp.)具有能量貯存顆粒，無芽胞，N，N，N’，N’-四甲基對苯二胺染色為陽性。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生物除鐵除錳功能菌，其特征在于生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C/2o^ok/"m'wwsp.)能在pH值為710的環(huán)境中生長，具有淀粉酶、氧化酶和硝酸鹽還原性，不具有脂肪酶、色氨酸酶和脫氨酶。全文摘要一種生物除鐵除錳功能菌，它涉及一種微生物。它解決了目前生物氧化除錳工程菌群靠自然選擇建立，生化能力弱、除錳效果差；水處理除錳生物濾池的建立所需培養(yǎng)、馴化、啟動(dòng)時(shí)間長和工程菌群遭到破壞后恢復(fù)周期長的問題。生物除鐵除錳功能菌MSB-4(Chryseobacteriumsp.)屬于金黃桿菌屬，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期為2007年10月30日，保藏號為CGMCCNo.2239；菌株MSB-4為好氧菌，長為1.5～2μm，寬為0.8～1.1μm，短桿狀細(xì)胞，兩端鈍圓；在培養(yǎng)基上形成棕黃色菌落，不透明，菌落為圓形；菌株MSB-4具異染顆粒和類脂粒，無芽胞，N，N，N’，N’-四甲基對苯二胺染色為陽性。本發(fā)明生物除鐵除錳功能菌MSB-4具有去除水中Mn²⁺、Fe²⁺的能力，Mn²⁺去除率高達(dá)94.44％，F(xiàn)e²⁺去除率高達(dá)90.13％。文檔編號C02F1/62GK101230326SQ20081006381公開日2008年7月30日申請日期2008年1月7日優(yōu)先權(quán)日2008年1月7日發(fā)明者杰張,冬李,焱趙申請人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)