一種食療發(fā)酵黑米汁的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種食療發(fā)酵黑米汁的制備方法，包括：將產(chǎn)納豆激酶兼吡咯喹啉醌的納豆芽孢桿菌10261和10263分別進(jìn)行亞硝基胍誘變，然后混合二者誘變后代，進(jìn)行細(xì)胞融合傳代培養(yǎng)，并在基因組重排技術(shù)基礎(chǔ)上進(jìn)一步采用底物誘導(dǎo)適應(yīng)性策略，高通量篩選得到高產(chǎn)納豆激酶兼吡咯喹啉醌的納豆芽孢桿菌；將干酪乳桿菌進(jìn)行亞硝基胍誘變，從中篩選出甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷型的干酪乳桿菌；將篩選出的納豆芽孢桿菌和干酪乳桿菌共發(fā)酵黑米汁，得到富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的黑米汁。本發(fā)明得到的富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的黑米汁中，吡咯喹啉醌含量達(dá)到64-128ng/mL，納豆激酶活力達(dá)到481-774U/mL。
【專利說明】-種食療發(fā)酵黑米汁的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物工程與發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及一種食療發(fā)酵黑米汁的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 納豆由大豆經(jīng)納豆芽抱桿菌炬acillus natto)發(fā)酵而成，具有多重生理功效：
[0003] ①納豆對也血管系統(tǒng)的作用：納豆中一種標(biāo)志性生理活性物質(zhì)納豆激酶 (化ttokinase，NK)是能夠溶解血栓的蛋白質(zhì)，由275個氨基酸殘基組成，分子量27邸左右， 無毒、無副作用，是一種絲氨酸蛋白酶，其溶栓效果甚至超過溶栓制劑尿激酶。納豆激酶除 具有直接溶栓作用外，還具有促進(jìn)靜脈內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生纖維蛋白溶酶原激活劑的能力，從而 間接表現(xiàn)其溶栓活性。納豆中亞油酸占全脂質(zhì)的50%，亞油酸能夠降低血漿中膽固醇含量， 有預(yù)防動脈硬化、也臟病和高血壓的功效，具有血栓溶解作用；
[0004] ②納豆對消化系統(tǒng)的作用；大豆蛋白質(zhì)經(jīng)納豆酶的作用轉(zhuǎn)化成可溶性多膚和氨 基酸，有利于人體吸收。Ig納豆中含有10億個W上納豆菌，納豆菌繁殖快，能消耗腸道中 的氧，可W抑制引起腸內(nèi)異常發(fā)酵的癡疾桿菌等腐敗菌，促進(jìn)乳酸菌繁殖，調(diào)節(jié)腸內(nèi)細(xì)菌平 衡，預(yù)防癡疾、腸炎和便秘等。大豆經(jīng)過納豆菌發(fā)酵蓄積了大量蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、醋 酶、纖維素酶和脈酶等酶群，該些生物酶在消化系統(tǒng)中能夠有效調(diào)理促進(jìn)消化吸收。納豆芽 抱桿菌在通過分解利用大豆蛋白進(jìn)行繁殖的過程中，可W產(chǎn)生大量酵素、維生素、多聚谷氨 酸和多聚果糖等粘性物質(zhì)，其被覆在胃腸粘膜表面起到保護(hù)作用，飲酒時可緩解酒醉。納豆 菌還能殺死腸道出血性大腸桿菌；
[0005] ③納豆對免疫系統(tǒng)的作用；通過接種納豆菌的動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，納豆可W提高機(jī)體 抵抗力，排除侵入的葡萄球菌，還可W誘發(fā)機(jī)體干擾素生成，增強(qiáng)機(jī)體免疫力；納豆中含有 活性物質(zhì)如皂草式、維生素B2、維生素E等，每天食用可除去體內(nèi)致癌物質(zhì)，預(yù)防癌癥發(fā)生， 并可軟化血管，促進(jìn)肌膚光滑；
[0006] ④促進(jìn)骨骼發(fā)育；維生素K,可促進(jìn)巧與蛋白質(zhì)結(jié)合從而促進(jìn)骨骼形成，在骨骼形 成過程中起著重要作用，而納豆中維生素K,含量是其他發(fā)酵食品的數(shù)百倍，有預(yù)防骨質(zhì)疏 松、腰痛等老年病的功效。
[0007] 近年發(fā)現(xiàn)納豆還具有其它更豐富廣泛的生理功效，源于其另一種標(biāo)志性生理活性 物質(zhì)-化咯唾晰釀（pyrroloquinoline quinone，PQ曲，它是繼黃素核巧酸和煙醜胺核巧 酸之后在細(xì)菌脫氨酶中發(fā)現(xiàn)的第H種輔基，化學(xué)名稱為4, 5-二氨-4, 5-二氧化-1-氨化咯 (2, 3f)釀-2, 7, 9-H駿酸，又名Methaxatin。雖然自然條件下僅少數(shù)細(xì)菌如Meth}dovo;rus、 Deinococcus radiodurans、Gluconobacter oxydans、Klebsiella pneumoniae 等會長夠合成 PQQ，但在各種植物、動物W及人體內(nèi)都發(fā)現(xiàn)含有微量PQQ。日本科學(xué)家測定了 26種常見食 物中的PQQ含量，發(fā)現(xiàn)1克食物中PQQ含量在3. 65-61納克不等，例如，蔬菜中的歐芹、青椒， 水果中的奇異果、木瓜，飲品中的綠茶、烏龍茶，W及人們常吃的豆腐。值得注意的是，日本 傳統(tǒng)食物納豆當(dāng)中PQQ含量最高，達(dá)到61納克/克。
[0008] PQQ作為一種普遍存在于動物和植物組織中的氧化還原酶輔基，雖然含量非常低， 但作用重要，不僅是一種新發(fā)現(xiàn)的線粒體呼吸鏈組分，參與催化生物體內(nèi)氧化還原反應(yīng)，還 具有非常多樣的生物活性，缺乏時會引起哺乳動物諸多代謝障礙，被認(rèn)為是一種新型維生 素。PQQ對哺乳動物的主要生理作用有：
[0009] ①全面提高人體免疫功能；PQQ作為人類發(fā)育的必要因子，能刺激人體細(xì)胞生長， 尤其是激活人體B細(xì)胞、T細(xì)胞，提高人體免疫功能；
[0010] ②防治肝損傷；PQQ能顯著降低血清膽紅素和谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平，調(diào)理肝損傷，對肝 臟疾病有極好療效；
[0011] ③減少自由基對人體的傷害；PQQ是一種氧化還原酶輔基，參與生物體內(nèi)氧化還 原反應(yīng)，能有效清除體內(nèi)自由基，減少自由基對人體傷害所引發(fā)的各種疾病，如也臟病、癌 癥W及各類炎癥；
[0012] ④調(diào)理各種神經(jīng)系統(tǒng)疾?。籔QQ在體內(nèi)能促進(jìn)神經(jīng)因子合成，調(diào)理各種神經(jīng)系統(tǒng) 疾?。?br> [0013] ⑥促進(jìn)氨基酸吸收；PQQ是釀蛋白酶的輔基，參與呼吸鏈電子傳遞，在人體內(nèi)能促 進(jìn)氨基酸吸收；
[0014] ⑧促進(jìn)生長因子合成：生長因子是人類生長的激素，PQQ能刺激人體細(xì)胞生長，增 加細(xì)胞密度，微量PQQ就能提高生物體組織的代謝能力和生長機(jī)能；
[0015] ⑦防治老年癡呆癥；PQQ具有修復(fù)神經(jīng)纖維、活化神經(jīng)元、激活休眠神經(jīng)細(xì)胞的能 力，能有效防治老年癡呆癥和改善記憶力；
[0016] ⑨促進(jìn)谷脫甘膚合成；谷脫甘膚具有重要抗氧化作用和整合解毒作用，PQQ能促 進(jìn)機(jī)體谷脫甘膚合成，防止白內(nèi)障發(fā)生和肝臟膽紅素積累；
[0017] ⑨極強(qiáng)的抗癌功能；PQQ激活自然殺傷細(xì)胞（NK)細(xì)胞為ANK細(xì)胞，使其具有殺腫 瘤作用；使NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞聚集，更有效地殺滅腫瘤細(xì)胞；封閉腫瘤細(xì)胞載鐵蛋白受體， 阻斷其功能，抑制腫瘤生長、轉(zhuǎn)移；破壞腫瘤細(xì)胞脂質(zhì)雙層，使腫瘤細(xì)胞溶解死亡；阻止腫 瘤細(xì)胞DNA復(fù)制，促其調(diào)亡。
[0018] 在天然食品中，納丑獨(dú)有NK,并且PQQ含量最豐富。納丑中的NK和PQQ由納丑牙 抱桿菌產(chǎn)生。納豆是日常健康食品，納豆芽抱桿菌是公認(rèn)安全的食品級微生物（GRAS微生 物），對納豆芽抱桿菌進(jìn)行定向選育，然后與乳酸菌共發(fā)酵，制備富含NK和PQQ的食品，對于 人們在日常飲食中補(bǔ)充NK和PQQ、充分發(fā)揮NK和PQQ的生理調(diào)理作用具有重要意義。
[0019] 黑米是稻米中的珍貴品種，屬于懦米類。主要營養(yǎng)成分按占干物質(zhì)計，含粗蛋白質(zhì) 8. 5-12. 5%，粗脂肪2. 7-3. 8%，碳水化合物75-84%，粗灰分1. 7-2%，富含B族維生素、維 生素E、巧、磯、鐘、鎮(zhèn)、鐵、鋒等，所含猛、鋒、銅等礦質(zhì)元素比大米高1?3倍，更含有大米所 缺乏的維生素C、葉綠素、花青素、胡蘿h素及強(qiáng)也式等獨(dú)特成分。用黑米熬制的米粥清香油 亮，軟懦適口，營養(yǎng)豐富，具有很好的滋補(bǔ)作用，因此被稱為"補(bǔ)血米"、"長壽米"等；中醫(yī)理 論認(rèn)為黑米性平、味甘，歸脾、胃經(jīng)，有開胃益中、滋陰補(bǔ)腎、健脾暖肝、補(bǔ)益脾胃、益氣活血、 養(yǎng)肝明目等功效，可抗衰老，補(bǔ)充人體需要的蛋白質(zhì)、猛、鋒等，適宜產(chǎn)后血虛、病后體虛者、 貧血者、腎虛者、年少須發(fā)早白者食用。經(jīng)常食用黑米，有利于防治頭昏、目胺、貧血、白發(fā)、 眼疾、腰膝酸軟、肺燥咳嗽、大便秘結(jié)、小便不利、腎虛水腫、食欲不振、脾胃虛弱等癥?，F(xiàn)代 醫(yī)學(xué)研究表明，黑米具有清除自由基、改善缺鐵性貧血、抗應(yīng)激反應(yīng)W及免疫調(diào)節(jié)等多種生 理功能；黑米中的黃銅類化合物能維持血管正常滲透壓，減輕血管脆性，防止血管破裂和止 血；黑米有抗菌功效；黑米有抑制癌細(xì)胞生長的功效；黑米有輔助降低血壓功效；黑米還具 有改善也肌營養(yǎng)，降低也肌耗氧量等功效。黑米汁是用黑米加水高溫研磨加工而成的飲品， 保留了黑米營養(yǎng)成分，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后，將進(jìn)一步形成乳酸菌素、活性脂肪酸、W乳酸為主 的有機(jī)酸等諸多食療物質(zhì)。
[0020] 乳酸菌發(fā)酵除能產(chǎn)生諸多食療成分外，還能賦予怡人的甜酸口感。納豆芽抱桿菌 發(fā)酵則能產(chǎn)生NK和PQQ。本發(fā)明通過選育納豆芽抱桿菌和干酪乳桿菌及其共發(fā)酵，開發(fā)出 富含NK和PQQ的食療發(fā)酵黑米汁。但如果干酪乳桿菌與納豆芽抱桿菌在同一體系中生長不 平衡會導(dǎo)致一種菌在競爭中排斥另一種，共發(fā)酵無法順利進(jìn)行。關(guān)于生理特性，即使在野生 狀態(tài)下，乳酸菌胞壁蛋白酶PrtS也只有少數(shù)菌株具有且活力不高，分解蛋白質(zhì)獲得必需氨 基酸的能力不足，而納豆芽抱桿菌具有較強(qiáng)蛋白酶活力，其分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生氨基酸和膚可 滿足乳酸菌對氨基酸的需求。納豆芽抱桿菌兼性厭氧，通過消耗氧氣也促進(jìn)乳酸菌生長和 產(chǎn)酸。在本發(fā)明中，除了納豆芽抱桿菌和干酪乳桿菌兩者之間存在不嚴(yán)格偏利共生關(guān)系外， 更通過選育手段使干酪乳桿菌因形成甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷（Met-)而與納豆芽抱桿菌形成嚴(yán) 格偏利共生關(guān)系，從而保證了干酪乳桿菌與納豆芽抱桿菌的共發(fā)酵順利進(jìn)行。
[0021] 納豆芽抱桿菌合成NK和PQQ的代謝途徑迄今尚未完全明了，從而無法通過理性優(yōu) 化手段提高納豆芽抱桿菌合成NK和PQQ的產(chǎn)率。而且由于糖、氨基酸、脂類、核巧酸四大有 機(jī)物代謝之間的相通和密切關(guān)聯(lián)，使得微生物細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)既顯示出剛性巧igidity)又 顯示出柔性（Plasticity),處于嚴(yán)格控制之中，剛性表現(xiàn)為牽一發(fā)而動全身，從而在許多情 形下，即使明了代謝途徑，定點(diǎn)理性突變也并不能獲得理想表型，而柔性表現(xiàn)為對整個代謝 網(wǎng)絡(luò)中處于不同節(jié)點(diǎn)但又相關(guān)的途徑進(jìn)行協(xié)同突變后，會表現(xiàn)出新的代謝屬性。欲提高納 豆芽抱桿菌合成NK和PQQ的產(chǎn)率，不明了其代謝途徑并不成為不可逾越的障礙，只要有合 適的非理性優(yōu)化手段（Unrational optimization technique),對所有可能與NK和PQQ合 成有關(guān)的主流及旁支途徑統(tǒng)籌優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)多位點(diǎn)協(xié)同突變，并通過高通量篩選使多位點(diǎn)協(xié) 同突變的表型從突變庫中凸顯，即可實(shí)現(xiàn)提高納豆芽抱桿菌合成NK和PQQ產(chǎn)率的目標(biāo)。
[0022] 隨機(jī)突變是最常見的非理性優(yōu)化手段，雖然它能夠產(chǎn)生突變位點(diǎn)數(shù)量足夠大的突 變庫，但在突變庫中，各突變位點(diǎn)往往是分散獨(dú)立于單個細(xì)胞中，相互之間無法優(yōu)化組合， 而且大多不產(chǎn)生可見表型，從而使得絕大多數(shù)突變隱沒于突變庫中而不能得到篩選。
[0023] 基因組重排（Genome化uffling)是在隨機(jī)突變的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新型誘變育 種技術(shù)。它是在通過隨機(jī)突變產(chǎn)生突變位點(diǎn)數(shù)量足夠大的突變庫的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過 細(xì)胞融合使各突變位點(diǎn)優(yōu)化組合，從而使突變指數(shù)級上升特別是增加大量表型可見突變。 基因組重排為利用微生物代謝網(wǎng)絡(luò)該種柔性進(jìn)行多點(diǎn)協(xié)同突變的菌種選育提供了技術(shù)支 撐?；痑ng等（2002)首先W傳統(tǒng)誘變方法獲得一個突變庫，篩選出若干個正向突變株作為 出發(fā)株，然后通過多輪遞推原生質(zhì)體融合的方式使眾多基因隨機(jī)重組，實(shí)現(xiàn)基因組重排，最 終從突變庫中篩選出性狀被提升的目的菌株；Ste地anopoulos(2002)通過基因組重排改 造了細(xì)菌表型；Patna化等（2002)利用基因組產(chǎn)品技術(shù)實(shí)現(xiàn)了乳酸桿菌的一株工業(yè)菌株 的改良，令其在抑4.0下乳酸產(chǎn)量為出發(fā)野生菌株的3倍；Gao等（2012)通過兩輪基因 組重排，使 Clostridium acetobut}di州m CICC 8012 產(chǎn) Acetone-Butanol-Ethanol (ABE〇 提高了 34. 53% ;Ge 等（2012)通過基因組重排獲得 Saccharomyces cerevisiae GS3-10, 其對五碳糖和六碳糖的轉(zhuǎn)化率達(dá)到69. 48 %和100%，而出發(fā)菌株為14. 83 %和100%， 己醇產(chǎn)率達(dá)到47.08g/L，而出發(fā)菌株為18. 12g/L;Kang等（2011)通過基因組重排，使 Aureobasidium pullulans產(chǎn)普魯藍(lán)多糖大幅度提高，并且遺傳穩(wěn)定；Zheng等（2010)通 過基因組重排提商了 Sporolactobacillus inulinus ATCC 15538的D-乳酸產(chǎn)率和耐 酸性John等（2008)通過原生質(zhì)體融合式的基因組重排，獲得了 W木墓-甘藏渣為基質(zhì) 的乳酸高產(chǎn)菌株；化等（2008)通過基因組重排獲得了糖耐度提高從而乳酸產(chǎn)率增加的 Lactobacillus rhamnosus ;Wang等（2007)通過基因組重排獲得了耐酸度提高從而乳酸產(chǎn) 率增加的 Lactobacillus rhamnosus。
[0024] 基因組重排也為進(jìn)行微生物代謝組學(xué)分析提供了支撐。經(jīng)過基因組重排而代謝 優(yōu)化的目的菌其遺傳背景來源于出發(fā)菌，故通過比對目的菌與出發(fā)菌的蛋白表達(dá)譜差異， 輔W代謝流和代謝控制分析技術(shù)，即可解析導(dǎo)致代謝優(yōu)化的關(guān)鍵酶及有關(guān)途徑的調(diào)控機(jī) 債J。Luo 等（2012)通過基因組重排使 Streptomyces gilvosporeus ATCC 13326 的游霉素 (natamycin)產(chǎn)率明顯升高，Streptomyces gilvosporeus ATCC 13326 的蛋白表達(dá)譜發(fā)生 明顯改變，34種蛋白表達(dá)上升而20種蛋白表達(dá)下降，提示與游霉素合成有關(guān)的牽涉廣泛的 代謝網(wǎng)絡(luò)得到優(yōu)化；化ang等（2010)通過基因組重排，使Propionibacterium shermanii產(chǎn) 心2大幅度提高，重排后菌株38種蛋白表達(dá)發(fā)生改變，其中22種蛋白表達(dá)上升而16種蛋白 表達(dá)下降，在表達(dá)上升的22種蛋白中，有6種是Vci2合成途徑中的酶，提示與Vm2合成有關(guān) 的牽涉廣泛的代謝網(wǎng)絡(luò)得到優(yōu)化。
[00巧]但目前基因組重排在策略上存在一定缺陷，主要是選育培養(yǎng)基與發(fā)酵培養(yǎng)基之間 無關(guān)聯(lián)，使得選育到的菌株在發(fā)酵時目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)率遠(yuǎn)低于預(yù)期。針對此問題，本發(fā)明在進(jìn)行 基因組重排選育時，選育平板中添加一定比例的發(fā)酵培養(yǎng)基組分，而發(fā)酵培養(yǎng)基中添加一 定比例的選育平板組分，使得選育與發(fā)酵兩環(huán)節(jié)之間形成關(guān)聯(lián)，保障了選育環(huán)節(jié)表現(xiàn)出高 產(chǎn)表型的菌株在發(fā)酵時依然表現(xiàn)出高產(chǎn)表型，此即為本發(fā)明的底物誘導(dǎo)適應(yīng)性策略。因此， 在對納豆芽抱桿菌高產(chǎn)NK兼PQQ表型進(jìn)行基因組重排選育時，在選育平板中添加一定比例 黑米汁，而在黑米汁發(fā)酵時則添加一定比例豆芽汁。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0026] 本發(fā)明提供了一種食療發(fā)酵黑米汁的制備方法。本發(fā)明在基因組重排技術(shù)基 礎(chǔ)上進(jìn)一步采用底物誘導(dǎo)適應(yīng)性策略，對納豆芽抱桿菌所有可能與NK和PQQ合成有關(guān) 的主流及旁支途徑統(tǒng)籌優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)多位點(diǎn)協(xié)同突變，進(jìn)而通過高通量篩選使多位點(diǎn)協(xié) 同突變的表型從突變庫中凸顯，獲得能夠在黑米汁發(fā)酵中高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽抱 桿菌BN-NKPQQ-RWX-306。同時，通過隨機(jī)誘變獲得甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷（Mef)干酪乳 桿菌（Lactobacillus casei Shirota-Met-，LcS-Met-)。LcS-Met-在生長速度上高于 BN-NKPQQ-RWX-306,但前者對后者營養(yǎng)依賴，兩者之間形成穩(wěn)定共生關(guān)系，保障了共發(fā)酵順 利完成，從而獲得富含NK和PQQ的黑米汁。
[0027] -種食療發(fā)酵黑米汁的制備方法，包括W下步驟：
[002引1)、將產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽抱桿菌10261和納豆芽抱桿菌10263分別進(jìn)行亞硝基 脈誘變；然后混合二者誘變后代，進(jìn)行細(xì)胞融合傳代培養(yǎng)，在基因組重排技術(shù)基礎(chǔ)上進(jìn)一步 采用底物誘導(dǎo)適應(yīng)性策略，高通量篩選得到高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽抱桿菌，命名為納豆芽 抱桿菌 BN-NKPQQ-RWX-306 ;
[0029] 細(xì)胞融合傳代培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)基因組改組，使納豆芽抱桿菌10261和10623所有誘變后 代的優(yōu)勢突變得到優(yōu)化整合。如有必要，可對融合后代進(jìn)行第二輪或者多輪誘變及融合，直 至選育出NK兼PQQ產(chǎn)率高且生長胚盛、遺傳穩(wěn)定、適合作為生產(chǎn)菌株的高產(chǎn)NK兼PQQ納豆 芽抱桿菌。
[0030] 2)、將干酪乳桿菌（Lactobacillus casei aiirota)進(jìn)行亞硝基脈誘變，從中篩選 出甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷型的干酪乳桿菌，命名為干酪乳桿菌LcS-Met-(Lactobacillus casei Shirota-Met_)；
[0031] 3)將納豆芽抱桿菌BN-NKPQQ-RWX-306和干酪乳桿菌LcS-Mef共發(fā)酵黑米汁，得 至IJ富含NK和PQQ的黑米汁，得到的富含NK和PQQ的黑米汁即為食療發(fā)酵黑米汁。
[0032] 本發(fā)明在基因組重排技術(shù)基礎(chǔ)上進(jìn)一步采用底物誘導(dǎo)適應(yīng)性策略，對納豆芽抱桿 菌所有可能與NK和PQQ合成有關(guān)的主流及旁支途徑統(tǒng)籌優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)多位點(diǎn)協(xié)同突變，進(jìn)而 通過高通量篩選使多位點(diǎn)協(xié)同突變的表型從突變庫中凸顯，獲得能夠在黑米汁發(fā)酵中高產(chǎn) NK兼PQQ的納豆芽抱桿菌BN-NKPQQ-RWX-306。同時，通過隨機(jī)誘變獲得甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷 (Met )干酪乳桿菌LcS-Met。
[0033] 欲使干酪乳桿菌與納豆芽抱桿菌順利共發(fā)酵，兩者之間應(yīng)形成共生關(guān)系。本發(fā) 明的策略是使通常情況下競爭占優(yōu)的干酪乳桿菌成為甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷（LcS-MetO，從 而在代謝上對納豆芽抱桿菌BN-NKPQQ-RWX-306形成依賴，其所需要的甲硫氨酸（Met) 由納豆芽抱桿菌供給，即形成嚴(yán)格的偏利共生關(guān)系。雖然LcS-Mef在生長速度上高于 BN-NKPQQ-RWX-306,但前者對后者營養(yǎng)依賴，兩菌之間形成穩(wěn)定共生關(guān)系，保障了共發(fā)酵順 利完成，從而獲得富含NK和PQQ的黑米汁。
[0034] 所用納豆芽抱桿菌和干酪乳桿菌均屬于食品級安全微生物，共發(fā)酵得到的富含NK 和PQQ的黑米汁中，PQQ含量達(dá)到64-128ng/mL，高于天然食品中含量最高的納豆巧5-63ng/ mL)和豆腐（25-30ng/mL)。NK活力達(dá)到481-774U/mL。所獲得的黑米汁富含納豆激酶和化 咯唾晰釀，具有黑米汁固有的滋味和發(fā)酵后特有的風(fēng)味。
[00巧]步驟1)中，納豆芽抱桿菌10261和納豆芽抱桿菌10263采用現(xiàn)有技術(shù)，納豆芽抱 桿菌10261來自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中也（CICC)，地址；北京市朝陽區(qū)酒仙橋中 路24號院6號樓；保藏日期為2002年，菌種保持編號為10261 ;納豆芽抱桿菌10263來自中 國工業(yè)微生物菌種保藏管理中也（CICC)，地址；北京市朝陽區(qū)酒仙橋中路24號院6號樓； 保藏日期為2002年，菌種保持編號為10263;干酪乳桿菌（Lactobacillus casei化irota) 來自養(yǎng)樂多（上海）有限公司；小鼠抗PQQ IgG單抗PQQ-mAb采用市售產(chǎn)品，購自嘉興元科 生物科技有限公司，商品號為YK-Ab-〇13。
[0036] 所述的底物誘導(dǎo)適應(yīng)性基因組重排后的高通量篩選具體包括；①制備2個平板豆 芽汁黑米汁固體培養(yǎng)基（黑米汁占平板總量的10% -15%，使得選育培養(yǎng)基與發(fā)酵培養(yǎng)基 之間發(fā)生關(guān)聯(lián)，此即為本發(fā)明的底物誘導(dǎo)適應(yīng)性策略），其中一個將小鼠抗PQQ IgG單抗 PQQ-mAb配入，形成平板A，另一個將瓊脂糖-纖維蛋白配入，形成平板B ;②將納豆芽抱桿 菌10261和納豆芽抱桿菌10263的誘變?nèi)诤虾蟠坎计渲幸粋€平板后，再用纖維素膜影印 至另一個平板，使平板A和平板B互為影印平板；③平板A中，高產(chǎn)PQQ誘變?nèi)诤虾蟠?周圍形成肉眼可見沉淀線，根據(jù)沉淀圈直徑大小可肉眼判斷產(chǎn)PQQ量大??；④平板B中，高 產(chǎn)NK誘變?nèi)诤虾蟠渲車纬赏该魅?，根?jù)透明圈直徑大小可肉眼判斷產(chǎn)NK活力高低； ⑥平板A與平板B中，高產(chǎn)PQQ菌落與高產(chǎn)NK菌落處于同一位置者，即為高產(chǎn)NK兼PQQ的 納豆芽抱桿菌。
[0037] 所獲得的高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽抱桿菌BN-NKPQQ-RWX-306保藏于斜面豆芽汁黑 米汁固體培養(yǎng)基中。
[0038] 所述的平板豆芽汁黑米汁固體培養(yǎng)基和斜面豆芽汁黑米汁固體培養(yǎng)基W 1L計， 由W下量的組分組成：
[0039] 黑米汁 100?15〇1化； 黯糖 4.0?6.0g; 瓊脂 1.5?2.0g; 豆芽汁 余量。
[0040] 進(jìn)一步優(yōu)選，所述的平板豆芽汁黑米汁固體培養(yǎng)基和斜面豆芽汁黑米汁固體培養(yǎng) 基W 1L計，由W下量的組分組成：
[0041] 黑米ii' 100?150m^ 謊糖 5.0g; 瓊臘 1.5?2.0g; 豆芽汁 余量。
[0042] 所述的豆芽汁的制備；剛出芽的大豆500g，加水2500血，煮沸濃縮至1000血后過 濾，得到豆芽汁。
[0043] 該平板豆芽汁黑米汁固體培養(yǎng)基的配方有利于納豆芽抱桿菌菌落形成和高通量 篩選。該斜面豆芽汁黑米汁固體培養(yǎng)基的配方有利于納豆芽抱桿菌保藏。
[0044] 本發(fā)明中，采用基因組重排技術(shù)選育納豆芽抱桿菌BN-NKPQQ-RWX-306時，選育平 板中添加一定比例的發(fā)酵培養(yǎng)基組分（黑米汁），而發(fā)酵培養(yǎng)基中添加一定比例的選育平 板組分（豆芽汁），使得選育與發(fā)酵兩環(huán)節(jié)之間形成關(guān)聯(lián)，促使選育環(huán)節(jié)表現(xiàn)出高產(chǎn)表型的 菌株在發(fā)酵時依然表現(xiàn)出高產(chǎn)表型，此即為本發(fā)明的底物誘導(dǎo)適應(yīng)性策略。
[0045] 步驟2)中，所述的從中篩選出甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷型的干酪乳桿菌，具體包括；① 制備2個平板MRS固體培養(yǎng)基，其中一個將甲硫氨酸（Met)配入（Met添加量為10-15mg/ L)，為平板C，另一個為單純MRS固體培養(yǎng)基平板（平板D)，為平板D ;②將誘變后的干酪乳 桿菌（Lactobacillus casei化irota)涂布其中一個平板后，再用纖維素膜影印至另一個 平板，使平板C和平板D互為影印平板；③在平板C與平板D的同一位置，平板C出現(xiàn)菌落 而平板D未出現(xiàn)菌落，或平板C上的菌落顯著大于平板D上的菌落，則該菌落為甲硫氨酸營 養(yǎng)缺陷型干酪乳桿菌，命名為干酪乳桿菌LcS-Mef，保藏于斜面MRS固體培養(yǎng)基中。
[0046] 所述的平板MRS固體培養(yǎng)基和斜面MRS固體培養(yǎng)基W 1L計，由W下量的組分組 成：
[0047] 蛋白腺 lO.Og; 牛肉膏 lO.Og; 酵母膏 5.0g; 粹様酸氨二轅 2.0g; 葡萄糖 20.0g; 這酸鑰 5.0g; 憐酸氨二鐘 2.0g; 硫酸鎮(zhèn) 0.58g; 硫酸儘 0.25g; 瓊脂 20g; 化溫 80 l.OmL; 水 余量；
[004引該MRS固體培養(yǎng)基的抑值保持在6. 2?6. 4。
[0049] 該MRS固體培養(yǎng)基有利于干酪乳桿菌菌落形成和甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷型干酪乳桿 菌的篩選。
[0050] 本發(fā)明中，采用隨機(jī)誘變技術(shù)獲得甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷（MeO的干酪乳桿 菌（Xactobacillus casei Shirota-Met-，LcS-Met-)。LcS-Met-在生長速度上商于 BN-NKPQQ-RWX-306,但前者對后者營養(yǎng)依賴，兩者之間形成穩(wěn)定共生關(guān)系，通過構(gòu)建共生關(guān) 系的策略實(shí)現(xiàn)納豆芽抱桿菌與干酪乳桿菌的共發(fā)酵，獲得富含NK和PQQ的黑米汁。
[0051] 步驟3)中，在共發(fā)酵之前，將BN-NKPQQ-RWX-306和LcS-Met-分別進(jìn)行活化培 養(yǎng)，BN-NKPQQ-RWX-306在豆芽汁黑米汁液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為34? 36 °C (優(yōu)選35 °C )，LcS-Met-在MRS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為36?38 °C (優(yōu) 選 37〇C )。
[0052] 所述的豆芽汁黑米汁液體培養(yǎng)基W 1L計，由W下量的組分組成：
[0053] 黑米汁 100?150血；
[0054] 藏糖 4. 0 ?6. Og ;
[005引豆芽汁 余量。
[0056] 所述的豆芽汁黑米汁液體培養(yǎng)基W 1L計，優(yōu)選的，由W下量的組分組成：
[0057] 黑米汁 100?150血；
[005引 藏糖 5. Og ;
[005引豆芽汁 余量。
[0060] 該豆芽汁黑米汁液體培養(yǎng)基的配方有利于納豆芽抱桿菌增殖培養(yǎng)。豆芽汁制備： 剛出芽的大豆500g，加水2500血，煮沸濃縮至1000血后過濾，得到豆芽汁。
[0061] 所述的MRS液體培養(yǎng)基W 1L計，由W下量的組分組成：
[0062] 蛋白腺 lO.Og; 牛肉膏 lO.Og; 酵母膏 5.0g; 巧樣酸氨二轅 2.0g; 葡萄糖 20.0g; 乙酸銷 5.0g; 憐酸氨二卿 2.0g; 硫酸僕 0.58g; 硫酸鑑 0.25g; 吐溫 80 l.OmL； 水 余量；
[006引該MRS液體培養(yǎng)基的抑值保持在6. 2?6. 4。
[0064] 該MRS液體培養(yǎng)基有利于干酪乳桿菌增殖培養(yǎng)。
[0065] 將BN-NKPQQ-RWX-306和LcS-Mef共發(fā)酵含黑米汁的發(fā)酵培養(yǎng)基，具體包括；將活 化后的BN-NKPQQ-RWX-306和LcS-Mef混合，形成混合菌液，將混合菌液接種至含黑米汁的 發(fā)酵培養(yǎng)基，紗布封口培養(yǎng)后得到富含NK和PQQ的黑米汁。
[0066] 所述的含黑米汁的發(fā)酵培養(yǎng)基W 1L計，由W下量的組分組成：
[0067] 謊糖 50.0g; 酪氨酸 〇.5g; 谷氨酸 〇.5g; 麥芽糖 20.0g; .口.芽汁 lOOnrL; 黑米汁 余量。
[006引所述的黑米汁的制備包括；水中加黑米，浸泡2?12小時后，9(TC?99°C碼磨成 漿汁，得到黑米汁，其中，所述的水的體積與黑米的質(zhì)量之比為lOOmL ;10?25g。具體地如 100血水中加10?25g黑米，浸泡2小時W上后，9(TC W上碼磨成漿汁。
[0069] 混合菌液中，所述的BN-NKPQQ-RWX-306和LcS-Mef的混合密度比為1:2?1:5。
[0070] 所述的混合菌液接種至含黑米汁的發(fā)酵培養(yǎng)基的接種量為1 %?5%。
[0071] 所述的紗布封口培養(yǎng)的條件為；37°C?42C六層紗布封口培養(yǎng)2化?36h。
[007引共發(fā)酵時，在含黑米汁的發(fā)酵培養(yǎng)基中，添加酪氨酸和谷氨酸對 BN-NKPQQ-RWX-306進(jìn)行代謝調(diào)控，促進(jìn)PQQ合成，添加麥芽糖對BN-NKPQQ-RWX-306進(jìn)行代 謝調(diào)控，促進(jìn)NK生成，添加豆芽汁促進(jìn)BN-NKPQQ-RWX-306在黑米汁發(fā)酵過程中的增殖。本 發(fā)明中，納豆芽抱桿菌與干酪乳桿菌選育及其共發(fā)酵制備的發(fā)酵黑米汁富含納豆激酶和化 咯唾晰釀，具有黑米汁固有的滋味和發(fā)酵后特有的風(fēng)味。
[0073] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0074] -、本發(fā)明使用的納豆芽抱桿菌和干酪乳桿菌均屬于食品級安全微生物。
[00巧]二、首次采用基因組重排技術(shù)優(yōu)化NK和PQQ合成途徑，對納豆芽抱桿菌所有可能 與NK和PQQ合成有關(guān)的主流及旁支途徑統(tǒng)籌優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)多位點(diǎn)協(xié)同突變，進(jìn)而通過高通量 篩選使多位點(diǎn)協(xié)同突變的表型從突變庫中凸顯。同時，在基因組重排技術(shù)基礎(chǔ)上進(jìn)一步采 用底物誘導(dǎo)適應(yīng)性策略，保障了選育環(huán)節(jié)表現(xiàn)出高產(chǎn)表型的菌株在發(fā)酵時依然表現(xiàn)出高產(chǎn) 表型，獲得能夠在黑米汁發(fā)酵中高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽抱桿菌BN-NKPQQ-RWX-306。
[0076] H、首次采用構(gòu)建共生關(guān)系的策略實(shí)現(xiàn)納豆芽抱桿菌與干酪乳桿菌的共發(fā)酵。通 過隨機(jī)誘變獲得甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷（Met-)干酪乳桿菌LcS-Met-。LcS-Met-在生長速度上 高于BN-NKPQQ-RWX-306,但前者對后者營養(yǎng)依賴，兩者之間形成穩(wěn)定共生關(guān)系，保障了共發(fā) 酵順利完成，從而獲得富含NK和PQQ的黑米汁。
[0077] 四、從結(jié)構(gòu)上看，PQQ通過酪氨酸和谷氨酸之間形成膚鍵連接環(huán)化而成。本發(fā)明通 過在含黑米汁的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加酪氨酸和谷氨酸對BN-NKPQQ-RWX-306進(jìn)行代謝調(diào)控， 促進(jìn)PQQ合成。通過在含黑米汁的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加麥芽糖對BN-NKPQQ-RWX-306進(jìn)行代 謝調(diào)控，促進(jìn)NK生成。通過在含黑米汁的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加豆芽汁促進(jìn)BN-NKPQQ-RWX-306 在黑米汁發(fā)酵過程中的增殖，從而得到富含NK和PQQ的黑米汁，PQQ含量達(dá)到64-128ng/ 血，高于天然食品中含量最高的納豆巧5-63ng/mL)和豆腐（25-30ng/mL)。NK活力達(dá)到 481-774U/mL。所獲得的黑米汁富含納豆激酶和化咯唾晰釀，具有黑米汁固有的滋味和發(fā)酵 后特有的風(fēng)味。

【具體實(shí)施方式】
[007引在實(shí)施例中，有關(guān)培養(yǎng)基配制如下，
[0079] (a)所述的豆芽汁黑米汁液體培養(yǎng)基配制完成后，12rC滅菌15min，W 1L計，由W 下量的組分組成：
[0080] 黑米汁 130血；
[00引]藏糖 5. Og;
[0082] 豆芽汁 余量；
[0083] 該豆芽汁黑米汁液體培養(yǎng)基的配方有利于納豆芽抱桿菌增殖培養(yǎng)。豆芽汁制備： 剛出芽的大豆500g，加水2500血，煮沸濃縮至1000血后過濾，得到豆芽汁。
[0084] 化）所述的豆芽汁黑米汁固體培養(yǎng)基（平板）配制完成后，12rC滅菌15min，W 1L 計，由W下量的組分組成：
[0085] 黑米汁 130mL; 藤糖 5.0g; 瓊脂 1.8g; 豆芽汁 余量；
[0086] 該豆芽汁黑米汁固體培養(yǎng)基（平板）的配方有利于納豆芽抱桿菌菌落形成和高通 量篩選。
[0087] (c)所述的豆芽汁黑米汁固體培養(yǎng)基（斜面）配制完成后，12rc滅菌15min，w IL 計，由W下量的組分組成：
[0088] 黑米汁 130m^ 薦糖 5.0g; 瓊脂 1.8g; 豆芽汁 余量； 倒試管斜面
[0089] 該豆芽汁黑米汁固體培養(yǎng)基（斜面）的配方有利于納豆芽抱桿菌的保藏。
[0090] (d)所述的MRS液體培養(yǎng)基配制完成后，12rC滅菌15min，W 1L計，由W下量的組 分組成：
[0091] 蛋白膝 lO.Og; 牛肉膏 lO.Og; 酵母膏 5.0g; 驚樣酸氨二較 2.0g; 葡萄糖 20.0g; 乙酸銷 5.0g; 憐酸氨二鐘 2.0g; 硫酸儀 〇.58g; 硫酸鑑 0.25g; 化溫 80 l.OmL； 水 余量； pH 6.2 ?6.4
[0092] 該MRS液體培養(yǎng)基有利于干酪乳桿菌增殖培養(yǎng)。
[009引 （e)所述的MRS固體培養(yǎng)基（平板）配制完成后，12rC滅菌15min，W 1L計，由W 下量的組分組成：
[0094] 蛋白滕 lO.Og; 牛肉膏 lO.Og; 酵母膏 5.0g; 梓樣酸氨二錢 2.0g; 葡萄糖 20.0g;
[0095] 乙酸鋼 5.0g； 磯酸氨二鐘 2.0g; 硫酸鏡 〇.58g; 硫酸猛 0.25g; 瓊脂 20g; 化溫 80 l.OmL； 水 余量； pH 6.2 ?6.4
[0096] 該MRS固體培養(yǎng)基有利于干酪乳桿菌菌落形成和篩選。
[0097] 訊所述的MRS固體培養(yǎng)基（斜面）配制完成后，12rC滅菌15min，W 1L計，由W 下量的組分組成：
[0098] 蛋白腺 lO.Og; 牛肉膏 lO.Og; 酵母膏 5.0g; 巧樣酸氨二倭 2.0g; 葡萄糖 20.0g; 乙酸銷 5.0g; 憐酸氨二鐘 2.0g; 硫酸犧 〇.58g; 硫酸猛 0.25g; 瓊脂 20g; 化溫 80 l.OmL； 水 余雖； pH 6.2 ?6.4 倒試管斜面
[009引該MRS固體培養(yǎng)基（斜面）有利于干酪乳桿菌保藏。
[0100] (g)所述的含黑米汁的發(fā)酵培養(yǎng)基W 1L計，由W下量的組分組成：
[0101] 黯糖 50.0g; 酪氨酸 〇.5g; 谷氨酸 〇.5g; 麥芽糖 20.0g; 打芽汁 lOOmL；
[0102] 黑米汁 余量。
[010引 化）所述的黑米汁的制備包括；1000血水中加190g黑米，浸泡6小時后，95C碼磨 成漿汁，得到黑米汁。
[0104] 本發(fā)明實(shí)施例中，納豆芽抱桿菌10261和納豆芽抱桿菌10263采用現(xiàn)有技術(shù)，納豆 芽抱桿菌10261來自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中也（CICC)，地址；北京市朝陽區(qū)酒仙 橋中路24號院6號樓；保藏日期為2002年，菌種保持編號為10261 ;納豆芽抱桿菌10263 來自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中也（CICC)，地址；北京市朝陽區(qū)酒仙橋中路24號院 6號樓；保藏日期為2002年，菌種保持編號為10263 ;干酪乳桿菌（Lactobacillus casei 化irota)來自養(yǎng)樂多（上海）有限公司；小鼠抗PQQ IgG單抗PQQ-mAb采用市售產(chǎn)品，購 自嘉興元科生物科技有限公司，商品號為YK-Ab-013。
[0105] 實(shí)施例1
[0106] 本發(fā)明通過納豆芽抱桿菌與干酪乳桿菌選育及其共發(fā)酵制備富含NK和PQQ的黑 米汁，包括W下步驟：
[0107] (1)高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽抱桿菌BN-NKPQQ-RWX-306的選育
[0108] 采用底物誘導(dǎo)適應(yīng)性策略，通過基因組重排及高通量篩選技術(shù)獲得高產(chǎn)NK兼PQQ 的納豆芽抱桿菌BN-NKPQQ-RWX-306,具體方法為；首先構(gòu)建納豆芽抱桿菌突變庫，將已獲 得的產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽抱桿菌10261和10263分別進(jìn)行亞硝基脈誘變；然后混合二者誘 變后代，進(jìn)行細(xì)胞融合（促融劑為聚己二醇4000)，傳代培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)基因組改組，使納豆芽抱 桿菌10261和10623所有誘變后代的優(yōu)勢突變得到優(yōu)化整合，選育出NK兼PQQ產(chǎn)率高且生 長胚盛、遺傳穩(wěn)定、適合作為生產(chǎn)菌株的高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽抱桿菌。
[0109] 突變庫高通量篩選；①制備2個豆芽汁黑米汁固體培養(yǎng)基平板（黑米汁占平板總 量的10-15%，使得選育培養(yǎng)基與發(fā)酵培養(yǎng)基之間發(fā)生關(guān)聯(lián)，此即為本發(fā)明的底物誘導(dǎo)適應(yīng) 性策略），其中一個將小鼠抗PQQ IgG單抗PQQ-mAb配入，形成平板A，另一個將瓊脂糖-纖 維蛋白配入，形成平板B ;②將納豆芽抱桿菌10261和納豆芽抱桿菌10263的誘變?nèi)诤虾蟠?涂布其中一個平板后，再用纖維素膜影印至另一個平板，使平板A和平板B互為影印平板； ③平板A中，高產(chǎn)PQQ誘變?nèi)诤虾蟠渲車纬扇庋劭梢姵恋砭€，根據(jù)沉淀圈直徑大小可 肉眼判斷產(chǎn)PQQ量大小；④平板B中，高產(chǎn)NK誘變?nèi)诤虾蟠渲車纬赏该魅Γ鶕?jù)透明 圈直徑大小可肉眼判斷產(chǎn)NK活力高低；⑥平板A與平板B中，高產(chǎn)PQQ菌落與高產(chǎn)NK菌落 處于同一位置者，即為高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽抱桿菌。所獲得的高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽 抱桿菌命名為BN-NKPQQ-RWX-306,保藏于豆芽汁黑米汁固體培養(yǎng)基（斜面）中。
[0110] 似甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷（MeO的干酪乳桿菌（LcS-MeO的選育
[0111] 將干酪乳桿菌（Lactobacillus casei化irota)進(jìn)行亞硝基脈誘變，從中篩選出 甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷型（LcS-Met-)。
[0112] LcS-Met-篩選；①制備2個MRS固體培養(yǎng)基平板，其中一個將甲硫氨酸（Met)配 入（平板C，Met添加量為10-15mg/L)，另一個為單純MRS平板（平板D);②將干酪乳桿菌 (Lactobacillus casei化irota)的誘變后代涂布其中一個平板后，再用纖維素膜影印至 另一個平板，使平板C和平板D互為影印平板；③在平板C與平板D的同一位置，平板C出 現(xiàn)菌落而平板D未出現(xiàn)菌落，或平板C上的菌落顯著大于平板D上的菌落，則該菌落甲硫氨 酸營養(yǎng)缺陷型干酪乳桿菌，命名為LcS-Mef，保藏于MRS固體培養(yǎng)基（斜面）中。
[0113] (3) BN-NKPQQ-RWX-306 的活化培養(yǎng)
[0114] 將保存于豆芽汁黑米汁固體培養(yǎng)基（斜面）中的BN-NKPQQ-RWX-306取一環(huán)，接種 至豆芽汁黑米汁液體培養(yǎng)基活化，培養(yǎng)溫度35C，培養(yǎng)結(jié)束菌種密度達(dá)到10 9c化/血左右。
[0115] (4) LcS-Met-的活化培養(yǎng)
[0116] 將保存于MRS固體培養(yǎng)基（斜面）中的LcS-Mef取一環(huán)，接種至MRS液體培養(yǎng)基 37C活化培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束菌種密度達(dá)到10 9c化/mL左右。
[0117] (5)富含NK和PQQ的黑米汁的發(fā)酵制備
[0118] 將活化的BN-NKPQQ-RWX-306與LcS-Mef混合，使混合菌液中二者密度比為 1:2 (1 X 108CFM/mL: 2 X 108CFM/mL)，混合菌液W 1 %接種量接種含黑米汁的發(fā)酵培養(yǎng)基， 42C六層紗布封口培養(yǎng)2化，得到富含NK和PQQ的黑米汁。含黑米汁的發(fā)酵培養(yǎng)基中所含 豆芽汁、酪氨酸、谷氨酸和麥芽糖對BN-NKPQQ-RWX-306合成NK和PQQ進(jìn)行代謝調(diào)控，豆芽 汁有利于納豆芽抱桿菌增殖，麥芽糖有利于NK合成，而PQQ由酪氨酸和谷氨酸通過膚鍵連 接環(huán)化而成。發(fā)酵結(jié)束后，黑米汁中NK活力481U/mL，PQQ含量64ng/mL。所獲得的黑米汁 富含納豆激酶和化咯唾晰釀，具有黑米汁固有的滋味和發(fā)酵后特有的風(fēng)味。
[011引 實(shí)施例2
[0120] 本發(fā)明通過納豆芽抱桿菌與干酪乳桿菌選育及其共發(fā)酵制備富含NK和PQQ的黑 米汁，包括W下步驟：
[0121 ] (1)高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽抱桿菌BN-NKPQQ-RWX-306的選育
[0122] 采用底物誘導(dǎo)適應(yīng)性策略，通過基因組重排及高通量篩選技術(shù)獲得高產(chǎn)NK兼PQQ 的納豆芽抱桿菌BN-NKPQQ-RWX-306,具體方法為；首先構(gòu)建納豆芽抱桿菌突變庫，將已獲 得的產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽抱桿菌10261和10263分別進(jìn)行亞硝基脈誘變；然后混合二者誘 變后代，進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)融合（促融劑為聚己二醇4000)，傳代培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)基因組改組，使納豆芽 抱桿菌10261和10623所有誘變后代的優(yōu)勢突變得到優(yōu)化整合，選育出NK兼PQQ產(chǎn)率高且 生長胚盛、遺傳穩(wěn)定、適合作為生產(chǎn)菌株的高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽抱桿菌。
[0123] 突變庫高通量篩選；①制備2個豆芽汁黑米汁固體培養(yǎng)基平板（黑米汁占平板總 量的10-15%，使得選育培養(yǎng)基與發(fā)酵培養(yǎng)基之間發(fā)生關(guān)聯(lián)，此即為本發(fā)明的底物誘導(dǎo)適應(yīng) 性策略），其中一個將小鼠抗PQQ IgG單抗PQQ-mAb配入，形成平板A，另一個將瓊脂糖-纖 維蛋白配入，形成平板B ;②將納豆芽抱桿菌10261和納豆芽抱桿菌10263的誘變?nèi)诤虾蟠?涂布其中一個平板后，再用纖維素膜影印至另一個平板，使平板A和平板B互為影印平板； ③平板A中，高產(chǎn)PQQ誘變?nèi)诤虾蟠渲車纬扇庋劭梢姵恋砭€，根據(jù)沉淀圈直徑大小可 肉眼判斷產(chǎn)PQQ量大??；④平板B中，高產(chǎn)NK誘變?nèi)诤虾蟠渲車纬赏该魅?，根?jù)透明 圈直徑大小可肉眼判斷產(chǎn)NK活力高低；⑥平板A與平板B中，高產(chǎn)PQQ菌落與高產(chǎn)NK菌落 處于同一位置者，即為高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽抱桿菌。所獲得的高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽 抱桿菌命名為BN-NKPQQ-RWX-306,保藏于豆芽汁黑米汁固體培養(yǎng)基（斜面）中。
[0124] (2)甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷（MeO的干酪乳桿菌（LcS-MeO的選育
[01巧]將干酪乳桿菌（Lactobacillus casei化irota)進(jìn)行亞硝基脈誘變，從中篩選出 甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷型（LcS-Met-)。
[0126] LcS-Met-篩選；①制備2個MRS固體培養(yǎng)基平板，其中一個將甲硫氨酸（Met)配入 (平板C，Met添加量為10-15mg/L)，另一個為單純MRS固體培養(yǎng)基平板（平板D);②將干 酪乳桿菌（Lactobacillus casei化irota)的誘變后代涂布其中一個平板后，再用纖維素 膜影印至另一個平板，使平板C和平板D互為影印平板；③在平板C與平板D的同一位置， 平板C出現(xiàn)菌落而平板D未出現(xiàn)菌落，或平板C上的菌落顯著大于平板D上的菌落，則該菌 落甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷型干酪乳桿菌，命名為LcS-Mef，保藏于MRS固體培養(yǎng)基（斜面）中。
[0127] (3)BN-NKPQQ-RWX-306 的活化培養(yǎng)
[0128] 將保存于豆芽汁黑米汁固體培養(yǎng)基（斜面）中的BN-NKPQQ-RWX-306取一環(huán)，接種 至豆芽汁黑米汁液體培養(yǎng)基活化，培養(yǎng)溫度35C，培養(yǎng)結(jié)束菌種密度達(dá)到10 9c化/血左右。
[0129] (4) LcS-Met-的活化培養(yǎng)
[0130] 將保存于MRS固體培養(yǎng)基（斜面）中的LcS-Mef取一環(huán)，接種至MRS液體培養(yǎng)基 37C活化培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束菌種密度達(dá)到10 9c化/mL左右。
[013。 （5)富含NK和PQQ的黑米汁的發(fā)酵制備
[0132] 將活化的BN-NKPQQ-RWX-306與LcS-Met-混合，使混合菌液中二者密度比為 1:5 (1 X 108CFM/mL: 5 X 108CFM/mL)，混合菌液W 5 %接種量接種含黑米汁的發(fā)酵培養(yǎng)基， 37C六層紗布封口培養(yǎng)36h，得到富含NK和PQQ的黑米汁。含黑米汁的發(fā)酵培養(yǎng)基中所含 豆芽汁、酪氨酸、谷氨酸和麥芽糖對BN-NKPQQ-RWX-306合成NK和PQQ進(jìn)行代謝調(diào)控，豆芽 汁有利于納豆芽抱桿菌增殖，麥芽糖有利于NK合成，而PQQ由酪氨酸和谷氨酸通過膚鍵連 接環(huán)化而成。發(fā)酵結(jié)束后，黑米汁中NK活力774U/mL，PQQ含量128ng/mL。所獲得的黑米 汁富含納豆激酶和化咯唾晰釀，具有黑米汁固有的滋味和發(fā)酵后特有的風(fēng)味。
[0133] 本發(fā)明中采用色譜法測定PQQ，具體步驟參照"Noji N,化kamura T, Kit址ata N, et al. Simple and sensitive method for pyrroloquinoline quinone(PQQ)analysis in various foods using liquid chromatography/electrospray-lonization tandem mass spectrometry. J Agri Food Chem, 2007, 55(18):7258-7263. "〇
[0134] 本發(fā)明中采用瓊脂糖-纖維蛋白原平板法測定NK活力。測定步驟；將發(fā)酵液過濾 后點(diǎn)種在瓊脂糖-纖維蛋白平板上，37C賠育1她，W尿激酶作為標(biāo)準(zhǔn)品，通過測量透明圈 直徑計算納豆激酶相當(dāng)于尿激酶的活力單位扣/mL)。
【權(quán)利要求】
1. 一種食療發(fā)酵黑米汁的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： 1)、將產(chǎn)納豆激酶兼吡咯喹啉醌的納豆芽孢桿菌10261和納豆芽孢桿菌10263分別進(jìn) 行亞硝基胍誘變；然后混合二者誘變后代，進(jìn)行細(xì)胞融合傳代培養(yǎng)，高通量篩選得到高產(chǎn)納 豆激酶兼吡咯喹啉醌的納豆芽孢桿菌，命名為納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-306 ; 2) 、將干酪乳桿菌進(jìn)行亞硝基胍誘變，從中篩選出甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷型的干酪乳桿菌， 命名為干酪乳桿菌LcS-Met_ ; 3)將納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-306和干酪乳桿菌LcS-Met_共發(fā)酵黑米汁，得到富 含納豆激酶和吡咯喹啉醌的黑米汁。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的食療發(fā)酵黑米汁的制備方法，其特征在于，步驟1)中，所述 的高通量篩選具體包括：①制備2個平板豆芽汁黑米汁固體培養(yǎng)基，其中一個將小鼠抗PQQ IgG單抗PQQ-mAb配入，形成平板A，另一個將瓊脂糖-纖維蛋白配入，形成平板B ;②將納 豆芽孢桿菌10261和納豆芽孢桿菌10263的誘變?nèi)诤虾蟠坎计渲幸粋€平板后，再用纖維 素膜影印至另一個平板，使平板A和平板B互為影印平板；③平板A中，高產(chǎn)吡咯喹啉醌的 誘變?nèi)诤虾蟠渲車纬扇庋劭梢姵恋砣?，根?jù)沉淀圈直徑大小可肉眼判斷產(chǎn)吡咯喹啉 醌量大??；④平板B中，高產(chǎn)納豆激酶的誘變?nèi)诤虾蟠渲車纬赏该魅Γ鶕?jù)透明圈直 徑大小可肉眼判斷產(chǎn)納豆激酶活力高低；⑤平板A與平板B中，高產(chǎn)吡咯喹啉醌菌落與高產(chǎn) 納豆激酶菌落處于同一位置者，即為高產(chǎn)納豆激酶兼吡咯喹啉醌的納豆芽孢桿菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的食療發(fā)酵黑米汁的制備方法，其特征在于，步驟1)中，所述的 平板豆芽汁黑米汁固體培養(yǎng)基以1L計，由以下量的組分組成： 黑米汁 100?150mL; 庶糖 4.0?6.0g; 瓊脂 1.5?2.0g; 豆芽汁 余量。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的食療發(fā)酵黑米汁的制備方法，其特征在于，步驟2)中，所述 的從中篩選出甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷型的干酪乳桿菌，具體包括：①制備2個平板MRS固體培養(yǎng) 基，其中一個將甲硫氨酸配入，為平板C，另一個為單純MRS固體培養(yǎng)基平板，為平板D;②將 誘變后的干酪乳桿菌涂布其中一個平板后，再用纖維素膜影印至另一個平板，使平板C和 平板D互為影印平板；③在平板C與平板D的同一位置，平板C出現(xiàn)菌落而平板D未出現(xiàn)菌 落，或平板C上的菌落顯著大于平板D上的菌落，則該菌落為甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷型干酪乳桿 菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的食療發(fā)酵黑米汁的制備方法，其特征在于，步驟2)中，所述的 平板MRS固體培養(yǎng)基以1L計，由以下量的組分組成： 蛋白胨 lO.Og; 牛肉膏 lO.Og; 酵母膏 5.0g; 檸檬酸氫二銨 2.0g; 葡萄糖 20.0g; 乙酸鈉 5.0g; 磷酸氫二鉀 2.0g; 硫酸鎂 0.58g; 硫酸錳 0.25g; 瓊脂 20g; 吐溫80 l.OmL； 水 余量； 該MRS固體培養(yǎng)基的pH值保持在6. 2?6. 4。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的食療發(fā)酵黑米汁的制備方法，其特征在于，步驟3)中，在共 發(fā)酵之前，將納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-306和干酪乳桿菌LcS-Met_分別進(jìn)行活化培養(yǎng)， 納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-306在豆芽汁黑米汁液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度 為34?36°C，干酪乳桿菌LcS-Met_在MRS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為36? 38。。。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的食療發(fā)酵黑米汁的制備方法，其特征在于，步驟3)中，所述的 豆芽汁黑米汁液體培養(yǎng)基以1L計，由以下量的組分組成： 黑米汁 100?150mL; 鹿糖 4. 0?6. 0g; 豆芽汁 余量； 所述的MRS液體培養(yǎng)基以1L計，由以下量的組分組成： 蛋白胨 lO.Og; 牛肉膏 lO.Og; 酵母膏 5.0g; 檸檬酸氫二銨 2.0g; 葡萄糖 20.0g; 乙酸鈉 5.0g; 磷酸氫二鉀 2.0g; 硫酸鎂 〇.58g; 硫酸錳 0.25g; 吐溫 80 l.OmL； 水 余量； 該MRS液體培養(yǎng)基的pH值保持在6. 2?6. 4。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的食療發(fā)酵黑米汁的制備方法，其特征在于，步驟3)中，將納 豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-306和干酪乳桿菌LcS-Met_共發(fā)酵黑米汁，具體包括：將活化后 的納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-306和干酪乳桿菌LcS-Mef混合，形成混合菌液，將混合菌 液接種至含黑米汁的發(fā)酵培養(yǎng)基，紗布封口培養(yǎng)后得到富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的黑米 汁。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的食療發(fā)酵黑米汁的制備方法，其特征在于，步驟3)中，所述的 含黑米汁的發(fā)酵培養(yǎng)基以1L計，由以下量的組分組成： 蔗糖 50.0g; 酪氨酸 〇.5g; 谷氨酸 〇.5g; 麥芽糖 20.0g; V芽什 lOOmL； 黑米汁 余量。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的食療發(fā)酵黑米汁的制備方法，其特征在于，步驟3)中，所述 的黑米汁的制備包括：水中加黑米，浸泡2?12小時后，90°C?99°C碾磨成漿汁，得到黑米 汁。
【文檔編號】A23L2/38GK104397815SQ201410752234
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月10日
【發(fā)明者】張哲滔, 徐薇薇, 阮子琦, 吳淵, 莫凡 申請人:杭州元佩特生物科技有限公司