一種選育納豆芽孢桿菌與干酪乳桿菌共發(fā)酵萵筍的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種選育納豆芽孢桿菌與干酪乳桿菌共發(fā)酵萵筍的方法，包括：將產(chǎn)納豆激酶兼吡咯喹啉醌的納豆芽孢桿菌10261和10263分別進(jìn)行亞硝基胍誘變，然后混合二者誘變后代，進(jìn)行細(xì)胞融合傳代培養(yǎng)，并在基因組重排技術(shù)基礎(chǔ)上進(jìn)一步采用底物誘導(dǎo)適應(yīng)性策略，高通量篩選得到高產(chǎn)納豆激酶兼吡咯喹啉醌的納豆芽孢桿菌；將干酪乳桿菌進(jìn)行亞硝基胍誘變，從中篩選出甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型的干酪乳桿菌；將篩選出的納豆芽孢桿菌和干酪乳桿菌共發(fā)酵萵筍，得到富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的發(fā)酵萵筍。本發(fā)明得到的富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的發(fā)酵萵筍中，吡咯喹啉醌含量達(dá)到88-107ng/mL，納豆激酶活力達(dá)到875-1000U/mL。
【專利說(shuō)明】-種選育納豆芽抱桿菌與干酪乳桿菌共發(fā)酵萬(wàn)第的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物工程與發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及一種選育納豆芽抱桿菌與干酪乳桿 菌共發(fā)酵窩算的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 納豆由大豆經(jīng)納豆芽抱桿菌炬acillus natto)發(fā)酵而成，具有多重生理功效：
[0003] ①納豆對(duì)也血管系統(tǒng)的作用：納豆中一種標(biāo)志性生理活性物質(zhì)納豆激酶 (化ttokinase，NK)是能夠溶解血栓的蛋白質(zhì)，由275個(gè)氨基酸殘基組成，分子量27邸左右， 無(wú)毒、無(wú)副作用，是一種絲氨酸蛋白酶，其溶栓效果甚至超過(guò)溶栓制劑尿激酶。納豆激酶除 具有直接溶栓作用外，還具有促進(jìn)靜脈內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生纖維蛋白溶酶原激活劑的能力，從而 間接表現(xiàn)其溶栓活性。納豆中亞油酸占全脂質(zhì)的50%，亞油酸能夠降低血漿中膽固醇含量， 有預(yù)防動(dòng)脈硬化、也臟病和高血壓的功效，具有血栓溶解作用；
[0004] ②納豆對(duì)消化系統(tǒng)的作用；大豆蛋白質(zhì)經(jīng)納豆酶的作用轉(zhuǎn)化成可溶性多膚和氨 基酸，有利于人體吸收。Ig納豆中含有10億個(gè)W上納豆菌，納豆菌繁殖快，能消耗腸道中 的氧，可W抑制引起腸內(nèi)異常發(fā)酵的癡疾桿菌等腐敗菌，促進(jìn)乳酸菌繁殖，調(diào)節(jié)腸內(nèi)細(xì)菌平 衡，預(yù)防癡疾、腸炎和便秘等。大豆經(jīng)過(guò)納豆菌發(fā)酵蓄積了大量蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、醋 酶、纖維素酶和脈酶等酶群，該些生物酶在消化系統(tǒng)中能夠有效調(diào)理促進(jìn)消化吸收。納豆芽 抱桿菌在通過(guò)分解利用大豆蛋白進(jìn)行繁殖的過(guò)程中，可W產(chǎn)生大量酵素、維生素、多聚谷氨 酸和多聚果糖等粘性物質(zhì)，其被覆在胃腸粘膜表面起到保護(hù)作用，飲酒時(shí)可緩解酒醉。納豆 菌還能殺死腸道出血性大腸桿菌；
[0005] ③納豆對(duì)免疫系統(tǒng)的作用；通過(guò)接種納豆菌的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，納豆可W提高機(jī)體 抵抗力，排除侵入的葡萄球菌，還可W誘發(fā)機(jī)體干擾素生成，增強(qiáng)機(jī)體免疫力；納豆中含有 活性物質(zhì)如皂草式、維生素B2、維生素E等，每天食用可除去體內(nèi)致癌物質(zhì)，預(yù)防癌癥發(fā)生， 并可軟化血管，促進(jìn)肌膚光滑；
[0006] ④促進(jìn)骨骼發(fā)育；維生素K2可促進(jìn)巧與蛋白質(zhì)結(jié)合從而促進(jìn)骨骼形成，在骨骼形 成過(guò)程中起著重要作用，而納豆中維生素K,含量是其他發(fā)酵食品的數(shù)百倍，有預(yù)防骨質(zhì)疏 松、腰痛等老年病的功效。
[0007] 近年發(fā)現(xiàn)納豆還具有其它更豐富廣泛的生理功效，源于其另一種標(biāo)志性生理活性 物質(zhì)-化咯唾晰釀（pyrroloquinoline quinone，PQ曲，它是繼黃素核巧酸和煙醜胺核巧 酸之后在細(xì)菌脫氨酶中發(fā)現(xiàn)的第H種輔基，化學(xué)名稱為4, 5-二氨-4, 5-二氧化-1-氨化咯 (2, 3f)釀-2, 7, 9-H駿酸，又名Methaxatin。雖然自然條件下僅少數(shù)細(xì)菌如Meth}dovo;rus、 Deinococcus radiodurans、Gluconobacter oxydans、Klebsiella pneumoniae 等會(huì)長(zhǎng)夠合成 PQQ，但在各種植物、動(dòng)物W及人體內(nèi)都發(fā)現(xiàn)含有微量PQQ。日本科學(xué)家測(cè)定了 26種常見食 物中的PQQ含量，發(fā)現(xiàn)1克食物中PQQ含量在3. 65-61納克不等，例如，蔬菜中的歐芹、青椒， 水果中的奇異果、木瓜，飲品中的綠茶、烏龍茶，W及人們常吃的豆腐。值得注意的是，日本 傳統(tǒng)食物納豆當(dāng)中PQQ含量最高，達(dá)到61納克/克。
[0008] PQQ作為一種普遍存在于動(dòng)物和植物組織中的氧化還原酶輔基，雖然含量非常低， 但作用重要，不僅是一種新發(fā)現(xiàn)的線粒體呼吸鏈組分，參與催化生物體內(nèi)氧化還原反應(yīng)，還 具有非常多樣的生物活性，缺乏時(shí)會(huì)引起哺乳動(dòng)物諸多代謝障礙，被認(rèn)為是一種新型維生 素。PQQ對(duì)哺乳動(dòng)物的主要生理作用有：
[0009] ①全面提高人體免疫功能；PQQ作為人類發(fā)育的必要因子，能刺激人體細(xì)胞生長(zhǎng)， 尤其是激活人體B細(xì)胞、T細(xì)胞，提高人體免疫功能；
[0010] ②防治肝損傷；PQQ能顯著降低血清膽紅素和谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平，調(diào)理肝損傷，對(duì)肝 臟疾病有極好療效；
[0011] ③減少自由基對(duì)人體的傷害；PQQ是一種氧化還原酶輔基，參與生物體內(nèi)氧化還 原反應(yīng)，能有效清除體內(nèi)自由基，減少自由基對(duì)人體傷害所引發(fā)的各種疾病，如也臟病、癌 癥W及各類炎癥；
[0012] ④調(diào)理各種神經(jīng)系統(tǒng)疾?。籔QQ在體內(nèi)能促進(jìn)神經(jīng)因子合成，調(diào)理各種神經(jīng)系統(tǒng) 疾病；
[0013] ⑥促進(jìn)氨基酸吸收；PQQ是釀蛋白酶的輔基，參與呼吸鏈電子傳遞，在人體內(nèi)能促 進(jìn)氨基酸吸收；
[0014] ⑧促進(jìn)生長(zhǎng)因子合成：生長(zhǎng)因子是人類生長(zhǎng)的激素，PQQ能刺激人體細(xì)胞生長(zhǎng)，增 加細(xì)胞密度，微量PQQ就能提高生物體組織的代謝能力和生長(zhǎng)機(jī)能；
[0015] ⑦防治老年癡呆癥；PQQ具有修復(fù)神經(jīng)纖維、活化神經(jīng)元、激活休眠神經(jīng)細(xì)胞的能 力，能有效防治老年癡呆癥和改善記憶力；
[0016] ⑨促進(jìn)谷脫甘膚合成；谷脫甘膚具有重要抗氧化作用和整合解毒作用，PQQ能促 進(jìn)機(jī)體谷脫甘膚合成，防止白內(nèi)障發(fā)生和肝臟膽紅素積累；
[0017] ⑨極強(qiáng)的抗癌功能；PQQ激活自然殺傷細(xì)胞（NK)細(xì)胞為ANK細(xì)胞，使其具有殺腫 瘤作用；使NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞聚集，更有效地殺滅腫瘤細(xì)胞；封閉腫瘤細(xì)胞載鐵蛋白受體， 阻斷其功能，抑制腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移；破壞腫瘤細(xì)胞脂質(zhì)雙層，使腫瘤細(xì)胞溶解死亡；阻止腫 瘤細(xì)胞DNA復(fù)制，促其調(diào)亡。
[0018] 在天然食品中，納豆獨(dú)有NK，并且PQQ含量最豐富。納豆中的NK和PQQ由納豆芽 抱桿菌產(chǎn)生。納豆是日常健康食品，納豆芽抱桿菌是公認(rèn)安全的食品級(jí)微生物（GRAS微生 物），對(duì)納豆芽抱桿菌進(jìn)行定向選育，然后與乳酸菌共發(fā)酵，制備富含NK和PQQ的食品，對(duì)于 人們?cè)谌粘ｏ嬍持醒a(bǔ)充NK和PQQ、充分發(fā)揮NK和PQQ的生理調(diào)理作用具有重要意義。
[0019] 窩算（Lac1:ucapsativapL. var. asparaginapBailey)營(yíng)養(yǎng)豐富，對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育很有 益處，在食療上適宜小便不通、尿血及水腫、糖尿病和服胖、神經(jīng)衰弱癥、高血壓、也律不齊、 失眠患者食用；婦女產(chǎn)后缺奶或乳汁不通也宜食用；酒后食用可解酒；兒童少年生長(zhǎng)發(fā)育 期時(shí)食用更佳；每天吃200克窩算葉，即可滿足胡蘿h素需要，吃500克窩算葉，即可滿足 維生素C需要；窩算還含豐富磯與巧，對(duì)促進(jìn)骨骼正常發(fā)育，預(yù)防倆傻病，幫助正常長(zhǎng)牙都 很有好處；窩算葉對(duì)也臟病、腎臟病、神經(jīng)衰弱、高血壓病等都有一定治療作用，經(jīng)常吃窩算 葉，有利于血管張力，改善也肌收縮力，加強(qiáng)利尿等。
[0020] 窩算適合制作發(fā)酵蔬果。本發(fā)明通過(guò)選育納豆芽抱桿菌和干酪乳桿菌及其共發(fā) 酵，開發(fā)出富含NK和PQQ的發(fā)酵窩算。但如果干酪乳桿菌與納豆芽抱桿菌在同一體系中生 長(zhǎng)不平衡會(huì)導(dǎo)致一種菌在競(jìng)爭(zhēng)中排斥另一種，共發(fā)酵無(wú)法順利進(jìn)行。關(guān)于生理特性，即使在 野生狀態(tài)下，乳酸菌胞壁蛋白酶PrtS也只有少數(shù)菌株具有且活力不高，分解牛乳蛋白質(zhì)獲 得必需氨基酸的能力不足，而納豆芽抱桿菌具有較強(qiáng)蛋白酶活力，其分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生氨基 酸和膚可滿足乳酸菌對(duì)氨基酸的需求。納豆芽抱桿菌兼性厭氧，通過(guò)消耗氧氣也促進(jìn)乳酸 菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酸。在本發(fā)明中，除了納豆芽抱桿菌和干酪乳桿菌兩者之間存在不嚴(yán)格偏利共 生關(guān)系外，更通過(guò)選育手段使干酪乳桿菌因形成甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷（Met-)而與納豆芽抱 桿菌形成嚴(yán)格偏利共生關(guān)系，從而保證了干酪乳桿菌與納豆芽抱桿菌的共發(fā)酵順利進(jìn)行。
[0021] 納豆芽抱桿菌合成NK和PQQ的代謝途徑迄今尚未完全明了，從而無(wú)法通過(guò)理性優(yōu) 化手段提高納豆芽抱桿菌合成NK和PQQ的產(chǎn)率。而且由于糖、氨基酸、脂類、核巧酸四大有 機(jī)物代謝之間的相通和密切關(guān)聯(lián)，使得微生物細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)既顯示出剛性巧igidity)又 顯示出柔性（Plasticity),處于嚴(yán)格控制之中，剛性表現(xiàn)為牽一發(fā)而動(dòng)全身，從而在許多情 形下，即使明了代謝途徑，定點(diǎn)理性突變也并不能獲得理想表型，而柔性表現(xiàn)為對(duì)整個(gè)代謝 網(wǎng)絡(luò)中處于不同節(jié)點(diǎn)但又相關(guān)的途徑進(jìn)行協(xié)同突變后，會(huì)表現(xiàn)出新的代謝屬性。欲提高納 豆芽抱桿菌合成NK和PQQ的產(chǎn)率，不明了其代謝途徑并不成為不可逾越的障礙，只要有合 適的非理性優(yōu)化手段（Unrational optimization technique),對(duì)所有可能與NK和PQQ合 成有關(guān)的主流及旁支途徑統(tǒng)籌優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)多位點(diǎn)協(xié)同突變，并通過(guò)高通量篩選使多位點(diǎn)協(xié) 同突變的表型從突變庫(kù)中凸顯，即可實(shí)現(xiàn)提高納豆芽抱桿菌合成NK和PQQ產(chǎn)率的目標(biāo)。
[0022] 隨機(jī)突變是最常見的非理性優(yōu)化手段，雖然它能夠產(chǎn)生突變位點(diǎn)數(shù)量足夠大的突 變庫(kù)，但在突變庫(kù)中，各突變位點(diǎn)往往是分散獨(dú)立于單個(gè)細(xì)胞中，相互之間無(wú)法優(yōu)化組合， 而且大多不產(chǎn)生可見表型，從而使得絕大多數(shù)突變隱沒(méi)于突變庫(kù)中而不能得到篩選。
[0023] 基因組重排（Genome化uffling)是在隨機(jī)突變的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的新型誘變育 種技術(shù)。它是在通過(guò)隨機(jī)突變產(chǎn)生突變位點(diǎn)數(shù)量足夠大的突變庫(kù)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過(guò) 細(xì)胞融合使各突變位點(diǎn)優(yōu)化組合，從而使突變指數(shù)級(jí)上升特別是增加大量表型可見突變。 基因組重排為利用微生物代謝網(wǎng)絡(luò)該種柔性進(jìn)行多點(diǎn)協(xié)同突變的菌種選育提供了技術(shù)支 撐?；痑ng等（2002)首先W傳統(tǒng)誘變方法獲得一個(gè)突變庫(kù)，篩選出若干個(gè)正向突變株作為 出發(fā)株，然后通過(guò)多輪遞推原生質(zhì)體融合的方式使眾多基因隨機(jī)重組，實(shí)現(xiàn)基因組重排，最 終從突變庫(kù)中篩選出性狀被提升的目的菌株；Ste地anopoulos(2002)通過(guò)基因組重排改 造了細(xì)菌表型；Patna化等（2002)利用基因組產(chǎn)品技術(shù)實(shí)現(xiàn)了乳酸桿菌的一株工業(yè)菌株 的改良，令其在抑4.0下乳酸產(chǎn)量為出發(fā)野生菌株的3倍；Gao等（2012)通過(guò)兩輪基因 組重排，使 Clostridium acetobut}di州m CICC 8012 產(chǎn) Acetone-Butanol-Ethanol (ABE〇 提高了 34. 53% ;Ge 等（2012)通過(guò)基因組重排獲得 Saccharomyces cerevisiae GS3-10, 其對(duì)五碳糖和六碳糖的轉(zhuǎn)化率達(dá)到69. 48 %和100%，而出發(fā)菌株為14. 83 %和100%， 己醇產(chǎn)率達(dá)到47.08g/L，而出發(fā)菌株為18. 12g/L;Kang等（2011)通過(guò)基因組重排，使 Aureobasidium pullulans產(chǎn)普魯藍(lán)多糖大幅度提高，并且遺傳穩(wěn)定；Zheng等（2010)通 過(guò)基因組重排提高了 Sporolactobacillus inulinus ATCC 15538的D-乳酸產(chǎn)率和耐 酸性John等（2008)通過(guò)原生質(zhì)體融合式的基因組重排，獲得了 W木墓-甘藏渣為基質(zhì) 的乳酸高產(chǎn)菌株；化等（2008)通過(guò)基因組重排獲得了糖耐度提高從而乳酸產(chǎn)率增加的 Lactobacillus rhamnosus ;Wang等（2007)通過(guò)基因組重排獲得了耐酸度提高從而乳酸產(chǎn) 率增加的 Lactobacillus rhamnosus。
[0024] 基因組重排也為進(jìn)行微生物代謝組學(xué)分析提供了支撐。經(jīng)過(guò)基因組重排而代謝 優(yōu)化的目的菌其遺傳背景來(lái)源于出發(fā)菌，故通過(guò)比對(duì)目的菌與出發(fā)菌的蛋白表達(dá)譜差異， 輔W代謝流和代謝控制分析技術(shù)，即可解析導(dǎo)致代謝優(yōu)化的關(guān)鍵酶及有關(guān)途徑的調(diào)控機(jī) 債J。Luo 等（2012)通過(guò)基因組重排使 Streptomyces gilvosporeus ATCC 13326 的游霉素 (natamycin)產(chǎn)率明顯升高，Streptomyces gilvosporeus ATCC 13326 的蛋白表達(dá)譜發(fā)生 明顯改變，34種蛋白表達(dá)上升而20種蛋白表達(dá)下降，提示與游霉素合成有關(guān)的牽涉廣泛的 代謝網(wǎng)絡(luò)得到優(yōu)化；化ang等（2010)通過(guò)基因組重排，使Propionibacterium shermanii產(chǎn) 心2大幅度提高，重排后菌株38種蛋白表達(dá)發(fā)生改變，其中22種蛋白表達(dá)上升而16種蛋白 表達(dá)下降，在表達(dá)上升的22種蛋白中，有6種是Vci2合成途徑中的酶，提示與Vm2合成有關(guān) 的牽涉廣泛的代謝網(wǎng)絡(luò)得到優(yōu)化。
[00巧]但目前基因組重排在策略上存在一定缺陷，主要是選育培養(yǎng)基與發(fā)酵培養(yǎng)基之間 無(wú)關(guān)聯(lián)，使得選育到的菌株在發(fā)酵時(shí)目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)率遠(yuǎn)低于預(yù)期。針對(duì)此問(wèn)題，本發(fā)明在進(jìn)行 基因組重排選育時(shí)，選育平板中添加一定比例的發(fā)酵培養(yǎng)基組分，而發(fā)酵培養(yǎng)基中添加一 定比例的選育平板組分，使得選育與發(fā)酵兩環(huán)節(jié)之間形成關(guān)聯(lián)，保障了選育環(huán)節(jié)表現(xiàn)出高 產(chǎn)表型的菌株在發(fā)酵時(shí)依然表現(xiàn)出高產(chǎn)表型，此即為本發(fā)明的底物誘導(dǎo)適應(yīng)性策略。因此， 在對(duì)納豆芽抱桿菌高產(chǎn)NK兼PQQ表型進(jìn)行基因組重排選育時(shí)，在選育平板中添加一定比例 窩算汁，而在發(fā)酵窩算時(shí)則添加一定比例豆芽汁。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0026] 本發(fā)明提供了一種選育納豆芽抱桿菌與干酪乳桿菌共發(fā)酵窩算的方法。本發(fā)明 在基因組重排技術(shù)基礎(chǔ)上進(jìn)一步采用底物誘導(dǎo)適應(yīng)性策略，對(duì)納豆芽抱桿菌所有可能與 NK和PQQ合成有關(guān)的主流及旁支途徑統(tǒng)籌優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)多位點(diǎn)協(xié)同突變，進(jìn)而通過(guò)高通量篩 選使多位點(diǎn)協(xié)同突變的表型從突變庫(kù)中凸顯，獲得能夠在窩算發(fā)酵中高產(chǎn)NK兼PQQ的納 豆芽抱桿菌BN-NKPQQ-RWX-406。同時(shí)，通過(guò)隨機(jī)誘變獲得甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷（Mef)干酪 乳桿菌（Lactobacillus casei Shirota-Met-，LcS-Met-)。LcS-Met-在生長(zhǎng)速度上高于 BN-NKPQQ-RWX-406,但前者對(duì)后者營(yíng)養(yǎng)依賴，兩者之間形成穩(wěn)定共生關(guān)系，保障了共發(fā)酵順 利完成，從而獲得富含NK和PQQ的發(fā)酵窩算。
[0027] -種選育納豆芽抱桿菌與干酪乳桿菌共發(fā)酵窩算的方法，包括W下步驟：
[002引1)、將產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽抱桿菌10261和納豆芽抱桿菌10263分別進(jìn)行亞硝基 脈誘變；然后混合二者誘變后代，進(jìn)行細(xì)胞融合傳代培養(yǎng)，在基因組重排技術(shù)基礎(chǔ)上進(jìn)一步 采用底物誘導(dǎo)適應(yīng)性策略，高通量篩選得到高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽抱桿菌，命名為納豆芽 抱桿菌 BN-NKPQQ-RWX-406 ;
[0029] 細(xì)胞融合傳代培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)基因組改組，使納豆芽抱桿菌10261和10623所有誘變后 代的優(yōu)勢(shì)突變得到優(yōu)化整合。如有必要，可對(duì)融合后代進(jìn)行第二輪或者多輪誘變及融合，直 至選育出NK兼PQQ產(chǎn)率高且生長(zhǎng)胚盛、遺傳穩(wěn)定、適合作為生產(chǎn)菌株的高產(chǎn)NK兼PQQ納豆 芽抱桿菌。
[0030] 2)、將干酪乳桿菌（Lactobacillus casei Siirota)進(jìn)行亞硝基脈誘變，從中篩選 出甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型的干酪乳桿菌，命名為干酪乳桿菌LcS-Met-(Lactobacillus casei Shirota-Met_)；
[0031] 3)將納豆芽抱桿菌BN-NKPQQ-RWX-406和干酪乳桿菌LcS-Mef共發(fā)酵窩算，得到 富含NK和PQQ的發(fā)酵窩算。
[0032] 本發(fā)明在基因組重排技術(shù)基礎(chǔ)上進(jìn)一步采用底物誘導(dǎo)適應(yīng)性策略，對(duì)納豆芽抱桿 菌所有可能與NK和PQQ合成有關(guān)的主流及旁支途徑統(tǒng)籌優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)多位點(diǎn)協(xié)同突變，進(jìn)而 通過(guò)高通量篩選使多位點(diǎn)協(xié)同突變的表型從突變庫(kù)中凸顯，獲得能夠在窩算發(fā)酵中高產(chǎn)NK 兼PQQ的納豆芽抱桿菌BN-NKPQQ-RWX-406。同時(shí)，通過(guò)隨機(jī)誘變獲得甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷 (Met )干酪乳桿菌LcS-Met。
[0033] 欲使干酪乳桿菌與納豆芽抱桿菌順利共發(fā)酵，兩者之間應(yīng)形成共生關(guān)系。本發(fā) 明的策略是使通常情況下競(jìng)爭(zhēng)占優(yōu)的干酪乳桿菌成為甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷（LcS-MetO，從 而在代謝上對(duì)納豆芽抱桿菌BN-NKPQQ-RWX-406形成依賴，其所需要的甲硫氨酸（Met) 由納豆芽抱桿菌供給，即形成嚴(yán)格的偏利共生關(guān)系。雖然LcS-Mef在生長(zhǎng)速度上高于 BN-NKPQQ-RWX-406,但前者對(duì)后者營(yíng)養(yǎng)依賴，兩菌之間形成穩(wěn)定共生關(guān)系，保障了共發(fā)酵順 利完成，從而獲得富含NK和PQQ的發(fā)酵窩算。
[0034] 所用納豆芽抱桿菌和干酪乳桿菌均屬于食品級(jí)安全微生物，共發(fā)酵得到的富含 NK和PQQ的發(fā)酵窩算中，PQQ含量達(dá)到88-107ng/mU高于天然食品中含量最高的納豆 巧5-63ng/mL)和豆腐（25-30ng/mL)。NK活力達(dá)到875-lOOOU/mL。所獲得的發(fā)酵窩算富含 納豆激酶和化咯唾晰釀，具有發(fā)酵窩算固有的滋味和發(fā)酵后特有的風(fēng)味。
[00巧]步驟1)中，納豆芽抱桿菌10261和納豆芽抱桿菌10263采用現(xiàn)有技術(shù)，納豆芽抱 桿菌10261來(lái)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中也（CICC)，地址；北京市朝陽(yáng)區(qū)酒仙橋中 路24號(hào)院6號(hào)樓；保藏日期為2002年，菌種保持編號(hào)為10261 ;納豆芽抱桿菌10263來(lái)自中 國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中也（CICC)，地址；北京市朝陽(yáng)區(qū)酒仙橋中路24號(hào)院6號(hào)樓； 保藏日期為2002年，菌種保持編號(hào)為10263;干酪乳桿菌（Lactobacillus casei化irota) 來(lái)自養(yǎng)樂(lè)多（上海）有限公司；小鼠抗PQQ IgG單抗PQQ-mAb采用市售產(chǎn)品，購(gòu)自嘉興元科 生物科技有限公司，商品號(hào)為YK-Ab-〇13。
[0036] 所述的底物誘導(dǎo)適應(yīng)性基因組重排后的高通量篩選具體包括；①制備2個(gè)平板豆 芽汁窩算汁固體培養(yǎng)基（窩算汁占平板總量的10% -15%，使得選育培養(yǎng)基與發(fā)酵培養(yǎng)基 之間發(fā)生關(guān)聯(lián)，此即為本發(fā)明的底物誘導(dǎo)適應(yīng)性策略），其中一個(gè)將小鼠抗PQQ IgG單抗 PQQ-mAb配入，形成平板A，另一個(gè)將瓊脂糖-纖維蛋白配入，形成平板B ;②將納豆芽抱桿 菌10261和納豆芽抱桿菌10263的誘變?nèi)诤虾蟠坎计渲幸粋€(gè)平板后，再用纖維素膜影印 至另一個(gè)平板，使平板A和平板B互為影印平板；③平板A中，高產(chǎn)PQQ誘變?nèi)诤虾蟠?周圍形成肉眼可見沉淀線，根據(jù)沉淀圈直徑大小可肉眼判斷產(chǎn)PQQ量大??；④平板B中，高 產(chǎn)NK誘變?nèi)诤虾蟠渲車纬赏该魅?，根?jù)透明圈直徑大小可肉眼判斷產(chǎn)NK活力高低； ⑥平板A與平板B中，高產(chǎn)PQQ菌落與高產(chǎn)NK菌落處于同一位置者，即為高產(chǎn)NK兼PQQ的 納豆芽抱桿菌。
[0037] 所獲得的高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽抱桿菌BN-NKPQQ-RWX-406保藏于斜面豆芽汁窩 算汁固體培養(yǎng)基中。
[0038] 所述的平板豆芽汁窩算汁固體培養(yǎng)基和斜面豆芽汁窩算汁固體培養(yǎng)基W 1L計(jì)， 由W下量的組分組成：
[0039] 巧邦r 100?15〇1化； 藏糖 4 0?6.0g; 瓊脂 1.5?2.0g; 豆芽汁 余量。
[0040] 進(jìn)一步優(yōu)選，所述的平板豆芽汁窩算汁固體培養(yǎng)基和斜面豆芽汁窩算汁固體培養(yǎng) 基W 1L計(jì)，由W下量的組分組成：
[0041] 巧巧汁 100?15〇1化； 薦糖 5.0g; 瓊脂 1.5?2.0g; 豆牙汁 余量。
[0042] 所述的豆芽汁的制備；剛出芽的大豆500g，加水2500血，煮沸濃縮至1000血后過(guò) 濾，得到豆芽汁。
[0043] 該平板豆芽汁窩算汁固體培養(yǎng)基的配方有利于納豆芽抱桿菌菌落形成和高通量 篩選。該斜面豆芽汁窩算汁固體培養(yǎng)基的配方有利于納豆芽抱桿菌保藏。
[0044] 本發(fā)明中，采用基因組重排技術(shù)選育納豆芽抱桿菌BN-NKPQQ-RWX-406時(shí)，選育平 板中添加一定比例的發(fā)酵培養(yǎng)基組分（窩算汁），而發(fā)酵培養(yǎng)基中添加一定比例的選育平 板組分（豆芽汁），使得選育與發(fā)酵兩環(huán)節(jié)之間形成關(guān)聯(lián)，促使選育環(huán)節(jié)表現(xiàn)出高產(chǎn)表型的 菌株在發(fā)酵時(shí)依然表現(xiàn)出高產(chǎn)表型，此即為本發(fā)明的底物誘導(dǎo)適應(yīng)性策略。
[0045] 步驟2)中，所述的從中篩選出甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型的干酪乳桿菌，具體包括；① 制備2個(gè)平板MRS固體培養(yǎng)基，其中一個(gè)將甲硫氨酸（Met)配入（Met添加量為10-15mg/ L)，為平板C，另一個(gè)為單純MRS固體培養(yǎng)基平板（平板D)，為平板D ;②將誘變后的干酪乳 桿菌（Lactobacillus casei化irota)涂布其中一個(gè)平板后，再用纖維素膜影印至另一個(gè) 平板，使平板C和平板D互為影印平板；③在平板C與平板D的同一位置，平板C出現(xiàn)菌落 而平板D未出現(xiàn)菌落，或平板C上的菌落顯著大于平板D上的菌落，則該菌落為甲硫氨酸營(yíng) 養(yǎng)缺陷型干酪乳桿菌，命名為干酪乳桿菌LcS-Mef，保藏于斜面MRS固體培養(yǎng)基中。
[0046] 所述的平板MRS固體培養(yǎng)基和斜面MRS固體培養(yǎng)基W 1L計(jì)，由W下量的組分組 成：
[0047] 蛋白腺 lO.Og; 牛肉膏 lO.Og; 酵母膏 5.0g; 梓樣酸氨二較 2.0g; 葡萄糖 20.0g; 乙酸鑰 5.0g; 憐酸氨二鐘 2.0g; 硫酸鑲 0.58g; 硫酸儘 0.25g; 瓊脂 20g; 吐溫 80 l.OmL； 水 余量； 該MRS固體培養(yǎng)基的pH值保持在6.2?6.4。
[0048] 該MRS固體培養(yǎng)基有利于干酪乳桿菌菌落形成和甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型干酪乳桿 菌的篩選。
[0049] 本發(fā)明中，采用隨機(jī)誘變技術(shù)獲得甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷（MeO的干酪乳桿 菌（Xactobacillus casei Shirota-Met-，LcS-Met-)。LcS-Met-在生長(zhǎng)速度上商于 BN-NKPQQ-RWX-406,但前者對(duì)后者營(yíng)養(yǎng)依賴，兩者之間形成穩(wěn)定共生關(guān)系，通過(guò)構(gòu)建共生關(guān) 系的策略實(shí)現(xiàn)納豆芽抱桿菌與干酪乳桿菌的共發(fā)酵，獲得富含NK和PQQ的發(fā)酵窩算。
[0050] 步驟3)中，在共發(fā)酵之前，將BN-NKPQQ-RWX-406和LcS-Met-分別進(jìn)行活化培 養(yǎng)，BN-NKPQQ-RWX-406在豆芽汁窩算汁液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為34? 36 °C (優(yōu)選35 °C )，LcS-Met-在MRS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為36?38 °C (優(yōu) 選 37〇C )。
[0051] 所述的豆芽汁窩算汁液體培養(yǎng)基W 1L計(jì)，由W下量的組分組成：
[0052] 窩算汁 100 ?150mL ；
[005引 藏糖 4. 0?6. Og ;
[0054] 豆芽汁 余量。
[00巧]所述的豆芽汁窩算汁液體培養(yǎng)基W 1L計(jì)，優(yōu)選的，由W下量的組分組成：
[0056] 窩算汁 100 ?150mL ；
[0057] 藏糖 5. Og ;
[005引豆芽汁 余量。
[0059] 該豆芽汁窩算汁液體培養(yǎng)基的配方有利于納豆芽抱桿菌增殖培養(yǎng)。豆芽汁制備： 剛出芽的大豆500g，加水2500mU煮沸濃縮至lOOOmL后過(guò)濾，得到豆芽汁。
[0060] 所述的MRS液體培養(yǎng)基W 1L計(jì)，由W下量的組分組成：
[0061] 蛋白膝 lO.Og; 牛肉膏 lO.Og; 酵母膏 5.0g; 梓樣酸氨二錠 2.0g; 葡萄糖 20.0g; 乙酸銷 5.0g; 磯酸氨二鐘 2.0g; 硫酸犧 0.58g; 硫酸猛 0.25g; 吐溫 80 l.OmL： 水 余量； 該MRS液體培養(yǎng)基的腳值保持在6.2?6.4。
[0062] 該MRS液體培養(yǎng)基有利于干酪乳桿菌增殖培養(yǎng)。
[0063] 將BN-NKPQQ-RWX-406和LcS-Mef共發(fā)酵含窩算的發(fā)酵培養(yǎng)基，具體包括；將活化 后的BN-NKPQQ-RWX-406和LcS-Mef混合，形成混合菌液，將混合菌液接種至含窩算的發(fā)酵 培養(yǎng)基，紗布封口培養(yǎng)后得到富含NK和PQQ的發(fā)酵窩算。
[0064] 所述的含窩算的發(fā)酵培養(yǎng)基W 1L計(jì)，由W下量的組分組成：
[0065] 謊糖 50.0g; 酪氨酸 〇.5g; 谷氨酸 〇.5g; 麥芽糖 20.0g; 對(duì)芽汁 10〇1化； 窩算 余量；
[0066] 在容器中加入藏糖、酪氨酸、谷氨酸、麥芽糖和豆芽汁之后，用窩算填滿至1L即 可。
[0067] 混合菌液中，所述的BN-NKPQQ-RWX-406和LcS-Mef的混合密度比為1:2?1:5。
[0068] 所述的混合菌液接種至含窩算的發(fā)酵培養(yǎng)基的接種量為1%?5%。
[0069] 所述的紗布封口培養(yǎng)的條件為；37°C?42C六層紗布封口培養(yǎng)2化?36h。
[0070] 窩算汁的制備是直接將窩算棒汁后得到。
[0071] 共發(fā)酵時(shí)，在含窩算的發(fā)酵培養(yǎng)基中，添加酪氨酸和谷氨酸對(duì)BN-NKPQQ-RWX-406 進(jìn)行代謝調(diào)控，促進(jìn)PQQ合成，添加麥芽糖對(duì)BN-NKPQQ-RWX-406進(jìn)行代謝調(diào)控，促進(jìn)NK生 成，添加豆芽汁促進(jìn)BN-NKPQQ-RWX-406在窩算發(fā)酵過(guò)程中的增殖。本發(fā)明中，納豆芽抱桿 菌與干酪乳桿菌選育及其共發(fā)酵制備的發(fā)酵窩算富含納豆激酶和化咯唾晰釀，具有發(fā)酵窩 算固有的滋味和發(fā)酵后特有的風(fēng)味。
[0072] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0073] -、本發(fā)明使用的納豆芽抱桿菌和干酪乳桿菌均屬于食品級(jí)安全微生物。
[0074] 二、首次采用基因組重排技術(shù)優(yōu)化NK和PQQ合成途徑，對(duì)納豆芽抱桿菌所有可能 與NK和PQQ合成有關(guān)的主流及旁支途徑統(tǒng)籌優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)多位點(diǎn)協(xié)同突變，進(jìn)而通過(guò)高通量 篩選使多位點(diǎn)協(xié)同突變的表型從突變庫(kù)中凸顯。同時(shí)，在基因組重排技術(shù)基礎(chǔ)上進(jìn)一步采 用底物誘導(dǎo)適應(yīng)性策略，保障了選育環(huán)節(jié)表現(xiàn)出高產(chǎn)表型的菌株在發(fā)酵時(shí)依然表現(xiàn)出高產(chǎn) 表型，獲得能夠在窩算發(fā)酵中高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽抱桿菌BN-NKPQQ-RWX-406。
[00巧]H、首次采用構(gòu)建共生關(guān)系的策略實(shí)現(xiàn)納豆芽抱桿菌與干酪乳桿菌的共發(fā)酵。通 過(guò)隨機(jī)誘變獲得甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷（Met-)干酪乳桿菌LcS-Met-。LcS-Met-在生長(zhǎng)速度上 高于BN-NKPQQ-RWX-406,但前者對(duì)后者營(yíng)養(yǎng)依賴，兩者之間形成穩(wěn)定共生關(guān)系，保障了共發(fā) 酵順利完成，從而獲得富含NK和PQQ的發(fā)酵窩算。
[0076] 四、從結(jié)構(gòu)上看，PQQ通過(guò)酪氨酸和谷氨酸之間形成膚鍵連接環(huán)化而成。本發(fā)明通 過(guò)在含窩算的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加酪氨酸和谷氨酸對(duì)BN-NKPQQ-RWX-406進(jìn)行代謝調(diào)控，促 進(jìn)PQQ合成。通過(guò)在含窩算的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加麥芽糖對(duì)BN-NKPQQ-RWX-406進(jìn)行代謝調(diào) 控，促進(jìn)NK生成。通過(guò)在含窩算的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加豆芽汁促進(jìn)BN-NKPQQ-RWX-406在窩算 發(fā)酵過(guò)程中的增殖，從而得到富含NK和PQQ的發(fā)酵窩算，PQQ含量達(dá)到88-107ng/mU高于 天然食品中含量最高的納豆巧5-63ng/mL)和豆腐（25-30ng/mL)。NK活力達(dá)到875-1000U/ mL。所獲得的發(fā)酵窩算富含納豆激酶和化咯唾晰釀，具有發(fā)酵窩算固有的滋味和氣味。

【具體實(shí)施方式】
[0077] 在實(shí)施例中，有關(guān)培養(yǎng)基配制如下，
[0078] (a)所述的豆芽汁窩算汁液體培養(yǎng)基配制完成后，12rC滅菌15min，W 1L計(jì)，由W 下量的組分組成：
[0079] 窩算汁 130mL ;
[0080] 藏糖 5. Og ;
[00引]豆芽汁 余量；
[0082] 該豆芽汁窩算汁液體培養(yǎng)基的配方有利于納豆芽抱桿菌增殖培養(yǎng)。豆芽汁制備： 剛出芽的大豆500g，加水2500血，煮沸濃縮至1000血后過(guò)濾，得到豆芽汁。
[008引 化）所述的豆芽汁窩算汁固體培養(yǎng)基（平板）配制完成后，12rC滅菌15min，W 1L 計(jì)，由W下量的組分組成：
[0084] 窩贊汁 130m^ 謊糖 5.0g; 瓊脂 1.8g; 豆芽汁 余量；
[0085] 該豆芽汁窩算汁固體培養(yǎng)基（平板）的配方有利于納豆芽抱桿菌菌落形成和高通 量篩選。
[0086] (c)所述的豆芽汁窩算汁固體培養(yǎng)基（斜面）配制完成后，12rc滅菌15min，w IL 計(jì)，由W下量的組分組成：
[0087] 窩贊汁 130m^ 謊糖 5.0g; 瓊脂 1.8g; 豆芽汁 余量； 倒試管斜面
[0088] 該豆芽汁窩算汁固體培養(yǎng)基（斜面）的配方有利于納豆芽抱桿菌的保藏。
[008引 （d)所述的MRS液體培養(yǎng)基配制完成后，12rc滅菌15min，W 1L計(jì)，由W下量的組 分組成：
[0090] 蛋白腺 lO.Og; 牛肉膏 lO.Og; 酵母膏 5.0g; 巧樣酸氨二錠 2.0g; 葡萄糖 20.0g; 乙酸鑰 5.0g; 憐酸氨二鐘 2.0g; 硫酸鎮(zhèn) 0.58g; 硫酸儘 0.25g; 化溫 80 l.OmL; 水 余量； pH 6.2 ?6.4
[0091] 該MRS液體培養(yǎng)基有利于干酪乳桿菌增殖培養(yǎng)。
[009引 （e)所述的MRS固體培養(yǎng)基（平板）配制完成后，12rC滅菌15min，W 1L計(jì)，由W 下量的組分組成：
[0093] 蛋白腺 lO.Og; 牛肉膏 lO.Og; 酵母膏 5.0g; 粹様酸氨二鎊 2.0g; 葡萄糖 20.0g; 這酸鑰 5.0g; 憐酸氨二鐘 2.0g; 硫酸鎮(zhèn) 〇.58g; 硫酸輸 025g; 瓊脂 20g; 化溫 80 l.OmL； 水 余量； pH 6.2 ?6.4
[0094] 該MRS固體培養(yǎng)基有利于干酪乳桿菌菌落形成和篩選。
[009引 訊所述的MRS固體培養(yǎng)基（斜面）配制完成后，12rC滅菌15min，W 1L計(jì)，由W 下量的組分組成：
[0096] 蛋白腺 lO.Og;
[0097] 牛肉膏 lOOg; 酵母膏 5.0g; 巧樣酸氨二鞍 2.0g; 葡萄糖 20.0g; 乙酸銷 5.0g; 磯酸氨二鐘 2.0g; 硫酸鏡 〇.58g; 硫酸儘 0.25g; 瓊脂 20g; 吐溫 80 l.OmL; 水 余量； pH 6.2 ?6.4 倒試管斜面
[009引該MRS固體培養(yǎng)基（斜面）有利于干酪乳桿菌保藏。
[0099] (g)所述的含窩算的發(fā)酵培養(yǎng)基W 1L計(jì)，由W下量的組分組成：
[0100] 黯糖 50.0g; 酪氨酸 〇.5g; 谷氨酸 〇.5g; 麥芽糖 20.0g; 豆芽汁 lOOmL 窩算 余量；
[0101] 在容器中加入藏糖、酪氨酸、谷氨酸、麥芽糖和豆芽汁之后，用窩算填滿至1L即 可。
[0102] 化）窩算汁的制備是直接將窩算棒汁后得到。
[0103] 本發(fā)明實(shí)施例中，納豆芽抱桿菌10261和納豆芽抱桿菌10263采用現(xiàn)有技術(shù)，納豆 芽抱桿菌10261來(lái)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中也（CICC)，地址；北京市朝陽(yáng)區(qū)酒仙 橋中路24號(hào)院6號(hào)樓；保藏日期為2002年，菌種保持編號(hào)為10261 ;納豆芽抱桿菌10263 來(lái)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中也（CICC)，地址；北京市朝陽(yáng)區(qū)酒仙橋中路24號(hào)院 6號(hào)樓；保藏日期為2002年，菌種保持編號(hào)為10263 ;干酪乳桿菌（Lactobacillus casei 化irota)來(lái)自養(yǎng)樂(lè)多（上海）有限公司；小鼠抗PQQ IgG單抗PQQ-mAb采用市售產(chǎn)品，購(gòu) 自嘉興元科生物科技有限公司，商品號(hào)為YK-Ab-013。
[0104] 實(shí)施例1
[0105] 本發(fā)明通過(guò)納豆芽抱桿菌與干酪乳桿菌選育及其共發(fā)酵制備富含NK和PQQ的發(fā) 酵窩算，包括W下步驟：
[0106] (1)高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽抱桿菌BN-NKPQQ-RWX-406的選育
[0107] 采用底物誘導(dǎo)適應(yīng)性策略，通過(guò)基因組重排及高通量篩選技術(shù)獲得高產(chǎn)NK兼PQQ 的納豆芽抱桿菌BN-NKPQQ-RWX-406,具體方法為；首先構(gòu)建納豆芽抱桿菌突變庫(kù)，將已獲 得的產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽抱桿菌10261和10263分別進(jìn)行亞硝基脈誘變；然后混合二者誘 變后代，進(jìn)行細(xì)胞融合（促融劑為聚己二醇4000)，傳代培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)基因組改組，使納豆芽抱 桿菌10261和10623所有誘變后代的優(yōu)勢(shì)突變得到優(yōu)化整合，選育出NK兼PQQ產(chǎn)率高且生 長(zhǎng)胚盛、遺傳穩(wěn)定、適合作為生產(chǎn)菌株的高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽抱桿菌。
[0108] 突變庫(kù)高通量篩選；①制備2個(gè)豆芽汁窩算汁固體培養(yǎng)基平板（窩算汁占平板總 量的10-15%，使得選育培養(yǎng)基與發(fā)酵培養(yǎng)基之間發(fā)生關(guān)聯(lián)，此即為本發(fā)明的底物誘導(dǎo)適應(yīng) 性策略），其中一個(gè)將小鼠抗PQQ IgG單抗PQQ-mAb配入，形成平板A，另一個(gè)將瓊脂糖-纖 維蛋白配入，形成平板B ;②將納豆芽抱桿菌10261和納豆芽抱桿菌10263的誘變?nèi)诤虾蟠?涂布其中一個(gè)平板后，再用纖維素膜影印至另一個(gè)平板，使平板A和平板B互為影印平板； ③平板A中，高產(chǎn)PQQ誘變?nèi)诤虾蟠渲車纬扇庋劭梢姵恋砭€，根據(jù)沉淀圈直徑大小可 肉眼判斷產(chǎn)PQQ量大小；④平板B中，高產(chǎn)NK誘變?nèi)诤虾蟠渲車纬赏该魅Γ鶕?jù)透明 圈直徑大小可肉眼判斷產(chǎn)NK活力高低；⑥平板A與平板B中，高產(chǎn)PQQ菌落與高產(chǎn)NK菌落 處于同一位置者，即為高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽抱桿菌。所獲得的高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽 抱桿菌命名為BN-NKPQQ-RWX-406,保藏于豆芽汁窩算汁固體培養(yǎng)基（斜面）中。
[0109] (2)甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷（Mef)的干酪乳桿菌（LcS-MeO的選育
[0110] 將干酪乳桿菌（Lactobacillus casei化irota)進(jìn)行亞硝基脈誘變，從中篩選出 甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型（LcS-Met-)。
[0111] LcS-Met-篩選；①制備2個(gè)MRS固體培養(yǎng)基平板，其中一個(gè)將甲硫氨酸（Met)配 入（平板C，Met添加量為10-15mg/L)，另一個(gè)為單純MRS平板（平板D);②將干酪乳桿菌 (Lactobacillus casei化irota)的誘變后代涂布其中一個(gè)平板后，再用纖維素膜影印至 另一個(gè)平板，使平板C和平板D互為影印平板；③在平板C與平板D的同一位置，平板C出 現(xiàn)菌落而平板D未出現(xiàn)菌落，或平板C上的菌落顯著大于平板D上的菌落，則該菌落甲硫氨 酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型干酪乳桿菌，命名為L(zhǎng)cS-Mef，保藏于MRS固體培養(yǎng)基（斜面）中。
[0112] (3) BN-NKPQQ-RWX-406 的活化培養(yǎng)
[0113] 將保存于豆芽汁窩算汁固體培養(yǎng)基（斜面）中的BN-NKPQQ-RWX-406取一環(huán)，接種 至豆芽汁窩算汁液體培養(yǎng)基活化，培養(yǎng)溫度35C，培養(yǎng)結(jié)束菌種密度達(dá)到10 9c化/血左右。
[0114] (4) LcS-Met-的活化培養(yǎng)
[0115] 將保存于MRS固體培養(yǎng)基（斜面）中的LcS-Met-取一環(huán)，接種至MRS液體培養(yǎng)基 37C活化培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束菌種密度達(dá)到10 9c化/mL左右。
[0116] (5)富含NK和PQQ的發(fā)酵窩算的發(fā)酵制備
[0117] 將活化的BN-NKPQQ-RWX-406與LcS-Mef混合，使混合菌液中二者密度比為 l:2aX108CFM/mL:2X108CFM/mL)，混合菌液Wl%接種量接種窩含窩算的發(fā)酵培養(yǎng)基， 42C六層紗布封口培養(yǎng)2化，得到富含NK和PQQ的發(fā)酵窩算。含窩算的發(fā)酵培養(yǎng)基中所含 豆芽汁、酪氨酸、谷氨酸和麥芽糖對(duì)BN-NKPQQ-RWX-406合成NK和PQQ進(jìn)行代謝調(diào)控，豆芽 汁有利于納豆芽抱桿菌增殖，麥芽糖有利于NK合成，而PQQ由酪氨酸和谷氨酸通過(guò)膚鍵連 接環(huán)化而成。發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵窩算中NK活力87抓/mL，PQQ含量88ng/mL。所獲得的發(fā)酵 窩算富含納豆激酶和化咯唾晰釀，具有發(fā)酵窩算固有的滋味和發(fā)酵后特有的風(fēng)味。
[om] 實(shí)施例2
[0119] 本發(fā)明通過(guò)納豆芽抱桿菌與干酪乳桿菌選育及其共發(fā)酵制備富含NK和PQQ的發(fā) 酵窩算，包括W下步驟：
[0120] (1)高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽抱桿菌BN-NKPQQ-RWX-406的選育
[0121] 采用底物誘導(dǎo)適應(yīng)性策略，通過(guò)基因組重排及高通量篩選技術(shù)獲得高產(chǎn)NK兼PQQ 的納豆芽抱桿菌BN-NKPQQ-RWX-406,具體方法為；首先構(gòu)建納豆芽抱桿菌突變庫(kù)，將已獲 得的產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽抱桿菌10261和10263分別進(jìn)行亞硝基脈誘變；然后混合二者誘 變后代，進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)融合（促融劑為聚己二醇4000)，傳代培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)基因組改組，使納豆芽 抱桿菌10261和10623所有誘變后代的優(yōu)勢(shì)突變得到優(yōu)化整合，選育出NK兼PQQ產(chǎn)率高且 生長(zhǎng)胚盛、遺傳穩(wěn)定、適合作為生產(chǎn)菌株的高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽抱桿菌。
[0122] 突變庫(kù)高通量篩選；①制備2個(gè)豆芽汁窩算汁固體培養(yǎng)基平板（窩算汁占平板總 量的10-15%，使得選育培養(yǎng)基與發(fā)酵培養(yǎng)基之間發(fā)生關(guān)聯(lián)，此即為本發(fā)明的底物誘導(dǎo)適應(yīng) 性策略），其中一個(gè)將小鼠抗PQQ IgG單抗PQQ-mAb配入，形成平板A，另一個(gè)將瓊脂糖-纖 維蛋白配入，形成平板B ;②將納豆芽抱桿菌10261和納豆芽抱桿菌10263的誘變?nèi)诤虾蟠?涂布其中一個(gè)平板后，再用纖維素膜影印至另一個(gè)平板，使平板A和平板B互為影印平板； ③平板A中，高產(chǎn)PQQ誘變?nèi)诤虾蟠渲車纬扇庋劭梢姵恋砭€，根據(jù)沉淀圈直徑大小可 肉眼判斷產(chǎn)PQQ量大??；④平板B中，高產(chǎn)NK誘變?nèi)诤虾蟠渲車纬赏该魅?，根?jù)透明 圈直徑大小可肉眼判斷產(chǎn)NK活力高低；⑥平板A與平板B中，高產(chǎn)PQQ菌落與高產(chǎn)NK菌落 處于同一位置者，即為高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽抱桿菌。所獲得的高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽 抱桿菌命名為BN-NKPQQ-RWX-406,保藏于豆芽汁窩算汁固體培養(yǎng)基（斜面）中。
[0123] (2)甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷（MeO的干酪乳桿菌（LcS-MeO的選育
[0124] 將干酪乳桿菌（Lactobacillus casei化irota)進(jìn)行亞硝基脈誘變，從中篩選出 甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型（LcS-Met-)。
[01巧]LcS-Met-篩選；①制備2個(gè)MRS固體培養(yǎng)基平板，其中一個(gè)將甲硫氨酸（Met)配入 (平板C，Met添加量為10-15mg/L)，另一個(gè)為單純MRS固體培養(yǎng)基平板（平板D);②將干 酪乳桿菌（Lactobacillus casei化irota)的誘變后代涂布其中一個(gè)平板后，再用纖維素 膜影印至另一個(gè)平板，使平板C和平板D互為影印平板；③在平板C與平板D的同一位置， 平板C出現(xiàn)菌落而平板D未出現(xiàn)菌落，或平板C上的菌落顯著大于平板D上的菌落，則該菌 落甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型干酪乳桿菌，命名為L(zhǎng)cS-Mef，保藏于MRS固體培養(yǎng)基（斜面）中。
[0126] (3)BN-NKPQQ-RWX-406 的活化培養(yǎng)
[0127] 將保存于豆芽汁窩算汁固體培養(yǎng)基（斜面）中的BN-NKPQQ-RWX-406取一環(huán)，接種 至豆芽汁窩算汁液體培養(yǎng)基活化，培養(yǎng)溫度35C，培養(yǎng)結(jié)束菌種密度達(dá)到109c化/血左右。 [012引 （4) LcS-Met-的活化培養(yǎng)
[0129] 將保存于MRS固體培養(yǎng)基（斜面）中的LcS-Mef取一環(huán)，接種至MRS液體培養(yǎng)基 37C活化培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束菌種密度達(dá)到10 9c化/mL左右。
[0130] (5)富含NK和PQQ的發(fā)酵窩算的發(fā)酵制備
[0131] 將活化的BN-NKPQQ-RWX-406與LcS-Mef混合，使混合菌液中二者密度比為 l:5aX10 8CFM/mL:5X108CFM/mL)，混合菌液W5%接種量接種含窩算的發(fā)酵培養(yǎng)基，37°C 六層紗布封口培養(yǎng)36h，得到富含NK和PQQ的發(fā)酵窩算。含窩算的發(fā)酵培養(yǎng)基中所含豆芽 汁、酪氨酸、谷氨酸和麥芽糖對(duì)BN-NKPQQ-RWX-406合成NK和PQQ進(jìn)行代謝調(diào)控，豆芽汁有 利于納豆芽抱桿菌增殖，麥芽糖有利于NK合成，而PQQ由酪氨酸和谷氨酸通過(guò)膚鍵連接環(huán) 化而成。發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵窩算中NK活力1000U/mL，PQQ含量107ng/mL。所獲得的發(fā)酵窩 算富含納豆激酶和化咯唾晰釀，具有發(fā)酵窩算固有的滋味和發(fā)酵后特有的風(fēng)味。
[0132] 本發(fā)明中采用色譜法測(cè)定PQQ，具體步驟參照"Noji N,化kamura T, Kit址ata N, et al. Simple and sensitive method for pyrroloquinoline quinone(PQQ)analysis in various foods using liquid chromatography/electrospray-lonization tandem mass spectrometiT.J Agri Food Qiem, 2007, 55(18):7258-7263."。
[0133] 本發(fā)明中采用瓊脂糖-纖維蛋白原平板法測(cè)定NK活力。測(cè)定步驟；將發(fā)酵物與等 量水混合碼磨均勻后過(guò)濾，濾液點(diǎn)種在瓊脂糖-纖維蛋白平板上，37C賠育1她，W尿激酶 作為標(biāo)準(zhǔn)品，通過(guò)測(cè)量透明圈直徑計(jì)算納豆激酶相當(dāng)于尿激酶的活力單位扣/mL)。
【權(quán)利要求】
1. 一種選育納豆芽孢桿菌與干酪乳桿菌共發(fā)酵萵筍的方法，其特征在于，包括以下步 驟： 1) 、將產(chǎn)納豆激酶兼吡咯喹啉醌的納豆芽孢桿菌10261和納豆芽孢桿菌10263分別進(jìn) 行亞硝基胍誘變；然后混合二者誘變后代，進(jìn)行細(xì)胞融合傳代培養(yǎng)，高通量篩選得到高產(chǎn)納 豆激酶兼吡咯喹啉醌的納豆芽孢桿菌，命名為納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-406 ; 2) 、將干酪乳桿菌進(jìn)行亞硝基胍誘變，從中篩選出甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型的干酪乳桿菌， 命名為干酪乳桿菌LcS-Met_ ; 3) 將納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-406和干酪乳桿菌LcS-Met_共發(fā)酵萵筍，得到富含 納豆激酶和吡咯喹啉醌的發(fā)酵萵筍。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的選育納豆芽孢桿菌與干酪乳桿菌共發(fā)酵萵筍的方法，其特征 在于，步驟1)中，所述的高通量篩選具體包括：①制備2個(gè)平板豆芽汁萵筍汁固體培養(yǎng)基， 其中一個(gè)將小鼠抗PQQIgG單抗PQQ-mAb配入，形成平板A，另一個(gè)將瓊脂糖-纖維蛋白配 入，形成平板B;②將納豆芽孢桿菌10261和納豆芽孢桿菌10263的誘變?nèi)诤虾蟠坎计渲?一個(gè)平板后，再用纖維素膜影印至另一個(gè)平板，使平板A和平板B互為影印平板；③平板A 中，高產(chǎn)吡咯喹啉醌的誘變?nèi)诤虾蟠渲車纬扇庋劭梢姵恋砣?，根?jù)沉淀圈直徑大小 可肉眼判斷產(chǎn)吡咯喹啉醌量大小；④平板B中，高產(chǎn)納豆激酶的誘變?nèi)诤虾蟠渲車?成透明圈，根據(jù)透明圈直徑大小可肉眼判斷產(chǎn)納豆激酶活力高低；⑤平板A與平板B中，高 產(chǎn)吡咯喹啉醌菌落與高產(chǎn)納豆激酶菌落處于同一位置者，即為高產(chǎn)納豆激酶兼吡咯喹啉醌 的納豆芽孢桿菌。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的選育納豆芽孢桿菌與干酪乳桿菌共發(fā)酵萵筍的方法，其特征 在于，步驟1)中，所述的平板豆芽汁萵筍汁固體培養(yǎng)基以1L計(jì)，由以下量的組分組成： 萵筍汁 100?150mL; 鹿糖 4.0?6.0g; 瓊脂 1.5?2.0g; 豆芽汁 余量。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的選育納豆芽孢桿菌與干酪乳桿菌共發(fā)酵萵筍的方法，其特征 在于，步驟2)中，所述的從中篩選出甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型的干酪乳桿菌，具體包括：①制備 2個(gè)平板MRS固體培養(yǎng)基，其中一個(gè)將甲硫氨酸配入，為平板C，另一個(gè)為單純MRS固體培養(yǎng) 基平板，為平板D;②將誘變后的干酪乳桿菌涂布其中一個(gè)平板后，再用纖維素膜影印至另 一個(gè)平板，使平板C和平板D互為影印平板；③在平板C與平板D的同一位置，平板C出現(xiàn) 菌落而平板D未出現(xiàn)菌落，或平板C上的菌落顯著大于平板D上的菌落，則該菌落為甲硫氨 酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型干酪乳桿菌。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的選育納豆芽孢桿菌與干酪乳桿菌共發(fā)酵萵筍的方法，其特征 在于，步驟2)中，所述的平板MRS固體培養(yǎng)基以1L計(jì)，由以下量的組分組成： 蛋白胨 lO.Og; 牛肉膏 lO.Og; 酵母膏 5.0g; 豐寧檬酸氫二銨 2.0g; 葡萄糖 20.0g; 乙酸鈉 5.0g; 磷酸氫二鉀 2.0g; 硫酸鎂 〇.58g; 硫酸錳 0.25g; 瓊脂 20g; 吐溫80 l.OmL； 水 余量； 該MRS固體培養(yǎng)基的pH值保持在6. 2?6. 4。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的選育納豆芽孢桿菌與干酪乳桿菌共發(fā)酵萵筍的方法，其 特征在于，步驟3)中，在共發(fā)酵之前，將納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-406和干酪乳桿菌 LcS-Met_分別進(jìn)行活化培養(yǎng)，納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-406在豆芽汁萵筍汁液體培養(yǎng)基 中進(jìn)行活化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為34?36°C，干酪乳桿菌LcS-Met_在MRS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活 化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為36?38 °C。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的選育納豆芽孢桿菌與干酪乳桿菌共發(fā)酵萵筍的方法，其特征 在于，步驟3)中，所述的豆芽汁萵筍汁液體培養(yǎng)基以1L計(jì)，由以下量的組分組成： 萵輿汁 100?150mL ; 鹿糖 4. 0?6. 0g; 豆芽汁 余量； 所述的MRS液體培養(yǎng)基以1L計(jì)，由以下量的組分組成： 蛋白胨 lO.Og; 牛肉膏 lO.Og; 酵母膏 5.0g; 梓檬酸氯二銨 2.0g; 葡萄糖 20.0g; 乙酸鈉 5.0g; 磷酸氫二鉀 2.0g; 硫酸鎂 〇.58g; 硫酸錳 0.25g; 吐溫80 l.OmL； 水 余量； 該MRS液體培養(yǎng)基的pH值保持在6. 2?6. 4。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的選育納豆芽孢桿菌與干酪乳桿菌共發(fā)酵萵筍的方法，其特征 在于，步驟3)中，將納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-406和干酪乳桿菌LcS-Met_共發(fā)酵萵筍， 具體包括：將活化后的納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-406和干酪乳桿菌LcS-Met_混合，形成 混合菌液，將混合菌液接種至含萵筍的發(fā)酵培養(yǎng)基，紗布封口培養(yǎng)后得到富含納豆激酶和 吡咯喹啉醌的發(fā)酵萵筍。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的選育納豆芽孢桿菌與干酪乳桿菌共發(fā)酵萵筍的方法，其特征 在于，步驟3)中，所述的含萵筍的發(fā)酵培養(yǎng)基以1L計(jì)，由以下量的組分組成： 蔗糖 50.0g; 酪氨酸 〇.5g; 谷氨酸 〇.5g; 麥芽糖 20.0g; 豆芽汁 lOOmL; 萵筍 余量。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的選育納豆芽孢桿菌與干酪乳桿菌共發(fā)酵萵筍的方法，其 特征在于，步驟3)中，所述混合菌液中的納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-406和干酪乳桿菌 LcS-Metl勺菌數(shù)密度比為1:2?1:5 ; 所述的混合菌液接種至含萵筍的發(fā)酵培養(yǎng)基的接種量為1%?5% ; 所述的紗布封口培養(yǎng)的條件為：37°C?42°C六層紗布封口培養(yǎng)24h?36h。
【文檔編號(hào)】C12R1/245GK104397620SQ201410751947
【公開日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月10日
【發(fā)明者】吳淵, 李青青, 張哲滔 申請(qǐng)人:杭州元佩特生物科技有限公司