專利名稱：抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的特異性干擾MTA1 mRNA的干擾RNA序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種特異性干擾MTA1mRNA的干擾RNA序列及其用途。
背景技術(shù)：
在現(xiàn)有技術(shù)中，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知MTA1基因是一個在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中表達上調(diào)的基因，文獻報道認為其表達與腫瘤的轉(zhuǎn)移能力相關(guān)。它是Toh等(J Biol Chem，1994，269(37)22958-63)用差異cDNA文庫掃描技術(shù)從高轉(zhuǎn)移大鼠乳腺腺癌細胞系中發(fā)現(xiàn)的，隨后用同源方法發(fā)現(xiàn)了人的同源MTA1基因。該基因產(chǎn)物是核小體重塑與脫乙酰基復(fù)合體(nuclear remodeling and deacetylation complex，NuRD)的成分，通過影響染色質(zhì)的狀態(tài)來調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。可見MTA1能發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的作用廣泛地影響下游基因的表達狀態(tài)。組蛋白乙酰化酶HAT的功能是將組蛋白乙?；?，促進基因轉(zhuǎn)錄；組蛋白去乙?；傅淖饔檬敲撊ソM蛋白的乙?；笵NA結(jié)構(gòu)變得緊密，基因表達受到抑制。組蛋白乙?；?脫乙?；c細胞周期及腫瘤的進展有關(guān)。MTA1過表達在許多人類的腫瘤中與其惡性進程有關(guān)。Toh等研究(Int J Cancer，2004，110(3)362-7)也發(fā)現(xiàn)，MTA1在食管癌中的表達與其H4組蛋白的脫乙?；钚韵嚓P(guān)。經(jīng)典的抑癌基因如p53、p21和Rb基因都受組蛋白乙?；恼{(diào)控。高表達MTA1 mRNA的腫瘤細胞侵襲與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率明顯升高。用反義方法抑制該基因的表達能導致有MTA1基因高表達的人乳腺癌細胞MDA-MB-231，出現(xiàn)生長和轉(zhuǎn)移侵襲抑制。表明該基因可能在腫瘤的轉(zhuǎn)移侵襲中發(fā)揮重要作用。近年來的研究表明，MTA1所屬的組蛋白脫乙?；?histone deacetylase，HDAC)家族在腫瘤發(fā)生中起了關(guān)鍵性作用，成為腫瘤治療中一個重要的目標分子。Toh等研究了食管癌組織標本中MTA1 mRNA的改變，發(fā)現(xiàn)MTA1 mRNA的表達升高與腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)。
RNA干擾是特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默，它既具有廣泛的適用性又具有精確特異性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的基因序列，特別是提供一種能特異性干擾MTA1 mRNA的干擾RNA序列。
所述的雙鏈干擾RNA(siRNA)的序列為正義鏈5’-GAACAUCUACGACAUCUCCTT-3’反義鏈3’-TTCUUGUAGAUGCUGUAGAGG-5’。
本發(fā)明還涉及一種含有本發(fā)明上述的抑制哺乳動物包括人腫瘤轉(zhuǎn)移的特異性干擾MTA1 mRNA的干擾RNA序列的載體，即用化學合成法合成雙鏈干擾RNA(siRNA)和構(gòu)建包含該RNA模板的質(zhì)粒在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄成雙鏈干擾RNA。
在體外培養(yǎng)的腫瘤細胞實驗中，以上兩種形式的MTA1 mRNA的干擾RNA序列均明顯的抑制了腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移相關(guān)生物學行為，如體外遷移、侵襲、粘附、劃痕愈合、克隆形成等；在腫瘤細胞的體內(nèi)成瘤能力及實驗性肺轉(zhuǎn)移實驗中表現(xiàn)出強大的抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的生物學功能。
本發(fā)明涉及的針對人MTA1基因、小鼠MTA1基因的靶序列片段5’-GAACATCTACGACATCTCC-3’(對應(yīng)人MTA1 mRNA序列g(shù)i14141149第787～805堿基；對應(yīng)鼠MTA1 mRNA序列g(shù)i16905112第831～849堿基)，以該序列為基礎(chǔ)化學合成的siRNA和構(gòu)建的siRNA表達載體能產(chǎn)生特異性MTA1基因沉默效應(yīng)，可產(chǎn)生抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的功效，可用于腫瘤的基因治療中。
在腫瘤基因治療中，本發(fā)明的化學合成片段的應(yīng)用可能會經(jīng)多種化學方法的修飾以增加穩(wěn)定性和靶向性等。該靶序列連接入載體后應(yīng)用于腫瘤基因治療，可采用多種現(xiàn)有技術(shù)中使用的病毒和非病毒候選載體，如質(zhì)粒載體、腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等。
因此，本發(fā)明進一步涉及一種藥物組合物，其特征在于含有有效劑量的本發(fā)明所述的抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的特異性干擾MTA1 mRNA的干擾RNA序列，以及藥學上可接受的載體。
本發(fā)明還涉及一種含有本發(fā)明所述的RNA序列的載體。優(yōu)選的是，所述的載體包括pSilencer3.1-H1 neo。


圖1為pSilencer3.1-H1 neo載體結(jié)構(gòu)2MTA1-siRNA和pSilencer3.1-MTA1-siRNA抑制KYSE150與B16F10細胞MTA1蛋白表達。A、C，MTA1-siRNA抑制KYSE150細胞MTA1蛋白表達western blot檢測及定量。B、D，pSilencer3.1-MTA1-siRNA抑制B16F10細胞MTA1蛋白表達westernblot檢測及定量。
圖3MTA1-siRNA和pSilencer3.1-MTA1-siRNA抑制KYSE150與B16F10細胞MTA1 mRNA表達。A、C，MTA1-siRNA抑制KYSE150細胞MTA1 mRNA表達RT-PCR檢測及定量。B、D，pSilencer3.1-MTA1-siRNA抑制B16F10細胞MTA1 mRNA表達RT-PCR檢測及定量。
圖4MTA1-siRNA及pSilencer3.1-MTA1-siRNA轉(zhuǎn)染降低腫瘤細胞的體外遷移及侵襲能力。A，MTA1-siRNA轉(zhuǎn)染降低KYSE150細胞的體外遷移及侵襲能力；B，pSilencer3.1-MTA1-siRNA轉(zhuǎn)染降低B16F10細胞的體外遷移及侵襲能力。
圖5MTA1-siRNA及pSilencer3.1-MTA1-siRNA轉(zhuǎn)染降低腫瘤細胞的細胞外基質(zhì)粘附能力。A，MTA1-siRNA轉(zhuǎn)染降低KYSE150細胞的細胞外基質(zhì)Matrigel粘附能力；B，pSilencer3.1-MTA1-siRNA轉(zhuǎn)染降低B16F10細胞的細胞外基質(zhì)Matrigel粘附能力。
圖6MTA1-siRNA及pSilencer3.1-MTA1-siRNA轉(zhuǎn)染降低腫瘤細胞的劃痕愈合能力。A，MTA1-siRNA轉(zhuǎn)染降低KYSE150細胞的劃痕愈合能力；B，pSilencer3.1-MTA1-siRNA轉(zhuǎn)染降低B16F10細胞的劃痕愈合能力。
圖7MTA1-siRNA及pSilencer3.1-MTA1-siRNA轉(zhuǎn)染降低腫瘤細胞的克隆形成能力。A，MTA1-siRNA轉(zhuǎn)染降低KYSE150細胞的克隆形成能力；B，pSilencer3.1-MTA1-siRNA轉(zhuǎn)染降低B16F10細胞的克隆形成能力。
圖8MTA1-siRNA及pSilencer3.1-MTA1-siRNA轉(zhuǎn)染降低腫瘤細胞的克隆形成能力。食管癌細胞系KYSE150轉(zhuǎn)染MTA1-siRNA及B16F10黑色素瘤細胞轉(zhuǎn)染pSilencer3.1-MTA1-siRNA質(zhì)粒后細胞生長減慢。
圖9用流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染control vector和pSilencer3.1-MTA1-siRNA質(zhì)粒的B16F10細胞周期情況。轉(zhuǎn)染pSilencer3.1-MTA1-siRNA質(zhì)粒的細胞G1期細胞增加，G2/S期細胞比例減少。
圖10pSilencer3.1-MTA1-siRNA轉(zhuǎn)染降低B16F10腫瘤細胞的C57小鼠體內(nèi)成瘤能力。A，處死后的荷瘤鼠；B，解剖后的腫瘤；C，不同的生長時間測量的腫瘤體積。
圖11pSilencer3.1-MTA1-siRNA轉(zhuǎn)染降低B16F10腫瘤細胞的C57小鼠實驗性肺轉(zhuǎn)移能力。A，解剖后的肺，可見黑色的肺結(jié)節(jié)；B，肺重量稱量圖C，肺部形成的腫瘤結(jié)節(jié)計數(shù)。
具體實施例方式
以下將結(jié)合附圖進一步非限定性地詳細說明本發(fā)明。
實施例1、MTA1干擾RNA的化學合成及表達載體的構(gòu)建采用現(xiàn)有技術(shù)公知的化學合成法合成MTA1-siRNA(上海吉凱基因化學技術(shù)有限公司合成)。
化學合成法直接合成雙鏈干擾RNA序列如下，這兩條序列堿基為互補關(guān)系正義鏈5’-GAACAUCUACGACAUCUCCTT-3’反義鏈3’-TTCUUGUAGAUGCUGUAGAGG-5’本發(fā)明以下將化學合成的退火雙鏈稱為MTA1-siRNA。pSilencer3.1-MTA1-siRNA載體的構(gòu)建采用化學合成法合成包含以上反向互補靶序列的DNA模板序列，并合成該模板DNA序列的互補序列，退火形成雙鏈，并連接入Ambion公司pSilencer3.1-H1 neo載體(參見圖1)。連接入載體的DNA模板是由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成的。該載體將在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄出發(fā)夾狀RNA，并經(jīng)細胞內(nèi)修飾后產(chǎn)生具有RNA干擾作用的MTA1-siRNA。模板序列、退火及連接過程如下合成序列正義模板序列5′-GATCCCGAACATCTACGACATCTCCTTCAAGAGAGGAGATGTCGTAGATGTTCTTTTTTGGAAA-3′64bp反義模板序列5′-AGCTTTTCCAAAAAAGAACATCTACGACATCTCCTCTCTTGAAGGAGATGTCGTAGATGTTCGG-3′64bp序列的退火連接1)將每一寡核苷酸稀釋成1μg/μl溶液。
a.將發(fā)夾siRNA模板寡核苷酸稀于約100μl無RNA酶水中。
b.取1μl以1∶100到1∶1000稀釋于TE溶液中，測定260nm處的吸光度，計算寡核苷酸的濃度。
c.將siRNA稀釋至約1μg/μl。
2)將每對寡核苷酸模板退火。
a.按下表配制50μl退火混合物2μl正義siRNA模板寡核苷酸2μl反義siRNA模板寡核苷酸46μl 1×DNA退火緩沖液；b.加熱至90℃，保持3min，然后冷卻至37℃孵育1小時；c.以上退火模板插入片斷可用于連接反應(yīng)。
3)退火模板與pSilencer3.1-H1 neo載體的連接。
a.以45μl無RNA核酶水稀釋5μl已退火的siRNA模板，至終濃度為8ng/μl；b.建立10μl連接反應(yīng)體系，同時進行陰性對照片段的連接，設(shè)置連接反應(yīng)對照。
插入體系連接對照體系加入成分1μl- 稀釋的退火siRNA模板- 1μl1×DNA退火緩沖液
6μl6μl無核酶水1μl1μl10×DNA1連接酶1μl1μlpSilencer3.1-H1 neo載體1μl1μlT4DNA連接酶(5U/μl)c.以T4DNA連接酶的反應(yīng)條件進行連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物備用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌進行擴增。本化學合成的模板序列退火后前后端分別形成BamHI和HindIII內(nèi)切酶的粘性末端，與經(jīng)BamHI和HindIII線性化的pSilencer3.1-H1 neo載體連接。
本發(fā)明將構(gòu)建的包含MTA1干擾靶序列的pSilencer3.1-H1 neo質(zhì)粒命名為pSilencer3.1-MTA1-siRNA。
連接載體的測序結(jié)果(加下劃線部分為連入載體的模板序列)表明與設(shè)計序列完全相同GAATTCATATTTGCATGTCGCTATGTGTTCTGGGAAATCACCATAAACGTGAAATGTCTTTGGATTTGGGAATCTTATAAGTTCTGTATGAGACCACTCGGATCCCGAACATCTACGACATCTCCTTCAAGAGAGGAGATGTCGTAGATGTTCTTTTTTGGAAAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAG實施例2本發(fā)明以MTA1-siRNA和pSilencer3.1-MTA1-siRNA轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞本發(fā)明進一步以化學合成MTA1-siRNA轉(zhuǎn)染食管癌細胞系KYSE150觀察其抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的能力，以構(gòu)建的pSilencer3.1-MTA1-siRNA載體轉(zhuǎn)染黑色素瘤細胞系B16F10觀察載體表達MTA1-siRNA抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的能力。
用Lipofectamine 2000將化學合成的MTA1-siRNA轉(zhuǎn)入哺乳動物細胞進行細胞生物學分析(24孔板)。
1)轉(zhuǎn)染前一天，于培養(yǎng)基內(nèi)種植合適數(shù)量的細胞，不加抗生素，轉(zhuǎn)染時的細胞密度為30～50％。轉(zhuǎn)染前換成無血清培養(yǎng)基(含血清培養(yǎng)基亦可)。
2)準備轉(zhuǎn)染復(fù)合體。
A將稀釋為總量為50pmol的siRNA 3μl加入47μl的無血清培養(yǎng)基，輕輕混勻，室溫孵育。
B用前混勻Lipofectamine 2000。取1μl加入49μl無血清培養(yǎng)基中混勻。輕輕混勻，室溫孵育5min。
C將稀釋好的siRNA與稀釋好的Lipofectamine 2000輕輕混合，室溫孵育20min以使復(fù)合體形成。
3)將復(fù)合體加入細胞培養(yǎng)孔中，輕輕混勻。
4)孵育48～96小時后觀察基因沉默效應(yīng)。
用Lipofectamine 2000將構(gòu)建的pSilencer3.1-MTA1-siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)入哺乳動物細胞進行細胞生物學分析(24孔板)。
1)轉(zhuǎn)染前一天在500μl培養(yǎng)基中種植0.5～2×105細胞，不加抗生素，轉(zhuǎn)染時細胞密度達到90～95％；2)準備以下復(fù)合體A將DNA稀釋于50μl無培養(yǎng)基中，輕輕混勻B Lipofectamine 2000用前混勻，取相應(yīng)體積稀釋于50μl無血清培養(yǎng)基，混勻，室溫孵育5min(在30min內(nèi)將稀釋的脂質(zhì)體與稀釋的DNA混合)；3)將稀釋的脂質(zhì)體與稀釋的DNA混合，輕輕混勻，室溫孵育20min(復(fù)合體于室溫6小時內(nèi)會保持穩(wěn)定)；4)將混合后的脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物100μl加入含培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)孔內(nèi)，輕輕混勻。
實施例3.MTA1-siRNA及其表達載體pSilencer3.1-MTA1-siRNA沉默MTA1蛋白及其RNA的鑒定以化學合成的雙鏈干擾RNA轉(zhuǎn)染食管癌細胞KYSE150，證實該片段能有效沉默MTA1蛋白及mRNA表達。以pSilencer3.1-MTA1-siRNA及空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染B16F10細胞，G418篩選，挑選陽性克隆，進行western blot及RT-PCR鑒定，證實了該載體同樣能沉默細胞內(nèi)MTA1蛋白及其mRNA的表達，但沒有對其它蛋白的表達產(chǎn)生影響(參見圖2、3)。
實施例4.MTA1-siRNA對KYSE150、pSilencer3.1-MTA1-siRNA對B16F10細胞體外遷移能力的影響及對侵襲能力的影響以Boyden小室為模型進行了腫瘤細胞體外遷移能力的研究。將轉(zhuǎn)染化學合成干擾片段MTA1-siRNA以及對照siRNA片段的KYSE150細胞各2×104種植于boyden小室上室，培養(yǎng)10小時。細胞經(jīng)fibronectin包被的8μm聚碳酯膜進入膜的下層的能力反映了腫瘤細胞體外遷移能力。計數(shù)聚碳酯膜下表面的細胞數(shù)，進行統(tǒng)計分析。KYSE150-control和KYSE150-MTA1-siRNA細胞遷移至膜下表面的細胞數(shù)分別為442.67±42.55和158.33±27.79。與對照細胞相比，轉(zhuǎn)染MTA1-siRNA的腫瘤細胞的體外遷移能力減弱(圖4)。利用Boyden小室模型，聚碳酯膜經(jīng)Matrigel包被，細胞經(jīng)包被的聚碳酯膜微孔到達膜下表面的能力反映了細胞穿透細胞外基質(zhì)的侵襲能力。將轉(zhuǎn)染MTA1-siRNA和對照siRNA片段的KYSE150細胞各2×104種植于boyden小室上室，培養(yǎng)12小時。計數(shù)聚碳酯膜下表面的細胞，分別為369±44.03和131±19.97。對照細胞相比，轉(zhuǎn)染MTA1-siRNA的腫瘤細胞的體外侵襲能力明顯減弱(參見圖4)。
以同樣方法對B16F10細胞進行的研究中，將轉(zhuǎn)染control vector、pSilencer3.1-MTA1-siRNA的B16F10細胞各2×104種植于boyden小室上室，37℃培養(yǎng)10小時，細胞經(jīng)fibronectin包被的8μm聚碳酯膜進入膜的下層。計數(shù)聚碳酯膜下表面的細胞數(shù)。與對照細胞相比，轉(zhuǎn)染pSilencer3.1-MTA1-siRNA質(zhì)粒的腫瘤細胞的體外遷移能力明顯減弱(圖4)。我們又以Boyden小室為模型，聚碳酯膜包被以Matrigel基質(zhì)，將control vector和pSilencer3.1-MTA-siRNA轉(zhuǎn)染的B16F10細胞各2×104種植上室，37℃培養(yǎng)12小時后觀察通過膜微孔的細胞數(shù)，到達膜下表面的細胞數(shù)分別為423.33±35.64和163.67±33.86。與對照細胞相比，轉(zhuǎn)染pSilencer3.1-MTA1-siRNA的腫瘤細胞的體外侵襲能力明顯減弱。不同處理的細胞體外侵襲能力如圖4所示。
實施例5.MTA1-siRNA對KYSE150、pSilencer3.1-MTA1-siRNA對B16F10細胞粘附能力的影響細胞粘附能力是細胞轉(zhuǎn)移過程中的一個重要特性。細胞表面粘附分子起著直接作用。MTA1-siRNA和對照siRNA轉(zhuǎn)染后的KYSE150細胞種植于Matrigel細胞外基質(zhì)鋪被的96孔板，在不同的時間點進行沖洗，殘留的細胞即發(fā)生粘附的細胞，以MTT法在490nm檢測粘附細胞的比率反映了細胞對細胞外基質(zhì)的粘附能力。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在粘附的早期階段，轉(zhuǎn)染MTA1-siRNA的細胞粘附能力明顯減弱。轉(zhuǎn)染對照RNA和MTA1-siRNA的KYSE150細胞在30min的粘附率分別為42.376％±2.96％、21.63％±5.69％60min的粘附率分別為51.42％±10.75％、32.74％±8.34％；90min的粘附率分別為72.67％±5.68％、45.25％±8.96％。(參見圖5)為了觀察MTA1基因是否也影響了B16F10黑色素瘤細胞的體外粘附能力，將control vector、pSilencer3.1-MTA1-siRNA轉(zhuǎn)染的B16F10細胞種植于Matrigel細胞外基質(zhì)鋪被的96孔板，在不同的時間點進行沖洗，殘留的細胞即發(fā)生粘附的細胞，以MTT法在490nm檢測種植后不同時間點粘附細胞的比率。二種細胞在種植后15min的粘附率分別為15.51％±1.38％、13.17％±4.17％，30min的粘附率分別為29.42％±5.17％、11.40％±4.72％，60min的粘附率分別為45.72％±8.30％、14.68％±8.07％。在粘附的早期階段，細胞轉(zhuǎn)染pSilencer3.1-MTA1-siRNA質(zhì)粒后粘附能力明顯減弱(參見圖5)，差異有顯著性。
實施例6.MTA1-siRNA對KYSE150、pSilencer3.1-MTA1-siRNA對B16F10細胞細胞劃痕愈合能力的影響培養(yǎng)KYSE150細胞，經(jīng)轉(zhuǎn)染MTA1-siRNA及陰性對照siRNA 48小時后，重新種植細胞。在單層培養(yǎng)的細胞表面以tip頭劃一固定寬度的創(chuàng)傷口，創(chuàng)口愈合能力反映了細胞在培養(yǎng)支持物上的遷移能力。在8小時、16小時、24小時觀察其劃痕愈合情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染MTA1-siRNA的細胞愈合速度明顯低于轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA的細胞(見圖6)。
培養(yǎng)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的B16F10細胞，以50×104每皿種植于35mm培養(yǎng)皿培養(yǎng)過夜。在單層培養(yǎng)的細胞表面以tip頭劃一固定寬度的創(chuàng)傷口，在8小時、16小時、24小時觀察其愈合情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染pSilencer3.1-MTA1-siRNA質(zhì)粒的細胞愈合速度明顯低于對照細胞(見圖6)。
實施例7.MTA1-siRNA對KYSE150、pSilencer3.1-MTA1-siRNA對B16F10細胞平板集落形成能力的影響將轉(zhuǎn)染對照siRNA和MTA1-siRNA的KYSE150細胞分別按每孔300個細胞接種35mm培養(yǎng)皿，兩周后觀察形成克隆的數(shù)量和大小，計數(shù)≥50個細胞的克隆數(shù)，計算克隆形成率。轉(zhuǎn)染對照siRNA和MTA1-siRNA的細胞的克隆形成數(shù)分別為53.33±6.51和6.33±3.21。與對照組相比，MTA1-siRNA轉(zhuǎn)染組的克隆形成率明顯下降，差異有顯著性(見圖7)。
將轉(zhuǎn)染control vector、pSilencer3.1-MTA1-siRNA的B16F10細胞分別按每孔300個細胞接種35mm培養(yǎng)皿，兩周后觀察形成克隆的數(shù)量和大小，計數(shù)≥50個細胞的克隆數(shù)，計算克隆形成率。二者的克隆形成數(shù)分別為45±8.89、5.33±2.52。與對照組相比，pSilencer3.1-MTA1-siRNA轉(zhuǎn)染組的克隆形成率下降，差異有顯著性(見圖7)。
實施例8.MTA1-siRNA對KYSE150、pSilencer3.1-MTA1-siRNA對B16F10細胞生長能力的影響以陰性對照siRNA及MTA1-siRNA轉(zhuǎn)染KYSE150細胞48小時后種植于96孔板，分別在種植細胞后1、2、3、4、5天采用MTT法檢測細胞生長情況，畫出生長曲線。與對照細胞相比，食管癌細胞系KYSE150轉(zhuǎn)染MTA1-siRNA后細胞生長減慢。(見圖8)分別在96孔板種植2×103細胞/孔轉(zhuǎn)染control vector與pSilencer3.1-MTA1-siRNA質(zhì)粒的細胞，并于1、2、3、4、5、6天采用MTT法檢測細胞生長情況，畫出生長曲線。與對照細胞相比，B16F10黑色素瘤細胞轉(zhuǎn)染pSilencer3.1-MTA1-siRNA質(zhì)粒后細胞生長減慢。表明MTA1對腫瘤細胞生長有促進作用(見圖8)。
實施例9.pSilencer3.1-MTA1-siRNA對B16F10細胞周期的影響用流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染control vector和pSilencer3.1-MTA1-siRNA質(zhì)粒的B16F10細胞周期情況。與轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒的B16F10細胞相比，轉(zhuǎn)染pSilencer3.1-MTA1-siRNA質(zhì)粒的細胞G1期細胞增加，G2/S期細胞比例減少，差異有顯著性(見圖9)。
實施例10.MTA1基因?qū)16F10細胞C57小鼠致瘤能力的影響為了觀察MTA1基因?qū)δ[瘤細胞體內(nèi)成瘤能力的影響，本發(fā)明用B16F10來源的同系C57BL/6小鼠進行了MTA1基因影響B(tài)16F10細胞體內(nèi)致瘤能力的動物實驗研究。將轉(zhuǎn)染control-vector與pSilencer3.1-MTA1-siRNA質(zhì)粒的B16F10細胞各5×104接種于小鼠右腋下，飼養(yǎng)24天。分別于12、15、18、21、24天測量腫瘤體積，并于最后一天處理荷瘤鼠，剝?nèi)∧[瘤，稱重并拍照，觀察轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒的B16F10腫瘤細胞的體內(nèi)成瘤能力。與轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒的細胞相比，轉(zhuǎn)染MTA1-siRNA質(zhì)粒的細胞成瘤能力明顯下降。對照組的成瘤率為100％，而轉(zhuǎn)染pSilencer3.1-MTA1-siRNA質(zhì)粒的實驗組成瘤率為66.7％，6只實驗小鼠有2只未形成可見的腫瘤，形成腫瘤的體積與重量均明顯小于對照組細胞。對照組的平均瘤體積及平均瘤重分別為9052.97±3743.85(mm3)和9.67±2.70(g)，而pSilencer3.1-MTA1-siRNA轉(zhuǎn)染組的平均瘤體積和平均瘤重分別為416.59±274.15(mm3)、0.41±0.22(g)。與對照組相比，轉(zhuǎn)染pSilencer3.1-MTA1-siRNA質(zhì)粒的實驗組腫瘤重抑制率為95.75％。經(jīng)統(tǒng)計學分析，轉(zhuǎn)染pSilencer3.1-MTA1-siRNA質(zhì)粒實驗組形成的腫瘤體積及腫瘤重量均明顯小于對照組，差異顯著(參見表1，圖10)，pSilencer3.1-MTA1-siRNA干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染抑制了腫瘤細胞的體內(nèi)成瘤能力與生長。
表1B16F10細胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后C57BL/6皮下種植模型結(jié)果

實施例11.MTA1基因?qū)16F10腫瘤細胞實驗性肺轉(zhuǎn)移能力的影響為了進一步研究MTA1基因?qū)δ[瘤細胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的影響，發(fā)明人對轉(zhuǎn)染過的B16F10腫瘤細胞進行了實驗性肺轉(zhuǎn)移的動物實驗研究。將25×104不同處理的B16F10細胞經(jīng)C57BL/6小鼠尾靜脈注射建立腫瘤細胞實驗性肺轉(zhuǎn)移模型。經(jīng)飼養(yǎng)21天后處理小鼠，取肺稱重，計數(shù)肺部腫瘤轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的數(shù)目，并拍照。
參見表2以及圖11，可見轉(zhuǎn)染pSilencer3.1-MTA1-siRNA質(zhì)粒的實驗組肺結(jié)節(jié)形成的數(shù)目明顯少于對照組。對照組小鼠的肺已經(jīng)全被黑色素瘤結(jié)節(jié)布滿，肺體積變大，而轉(zhuǎn)染pSilencer3.1-MTA1-siRNA的實驗組的肺，黑色素瘤結(jié)節(jié)少見，且結(jié)節(jié)也明顯小得多，肺葉仍保持肉粉色。經(jīng)計數(shù)對照組形成的肺結(jié)節(jié)數(shù)為64.6±27.25(個)，轉(zhuǎn)染pSilencer3.1-MTA1-siRNA質(zhì)粒的實驗組形成肺結(jié)節(jié)數(shù)為10.8±11.88(個)。與對照組相比較，轉(zhuǎn)染pSilencer3.1-MTA1-siRNA質(zhì)粒組的肺結(jié)節(jié)形成抑制率為和83.28％，差異十分顯著。實驗后肺重量分別為對照組1.08±0.32(g)，轉(zhuǎn)染pSilencer3.1-MTA1-siRNA組0.51±0.05(g)，差異有顯著性，可見轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒pSilencer3.1-MTA1-siRNA對肺部轉(zhuǎn)移灶的形成有抑制作用。
表2B16F10細胞實驗性肺轉(zhuǎn)移模型結(jié)果

權(quán)利要求
1.一種抑制哺乳動物包括人腫瘤轉(zhuǎn)移的特異性干擾MTA1 mRNA的干擾RNA序列，其包括正義鏈5’-GAACATCTACGACATCTCCTT-3’反義鏈3’-TTCTTGTAGATGCTGTAGAGG-5’。
2.一種含有如權(quán)利要求1所述的RNA序列的載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的載體，其特征在于所述的載體包括pSilencer3.1-Hl neo。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的RNA序列，其特征在于所述的腫瘤包括食管癌，肺癌，黑色素瘤，胃癌，結(jié)腸癌，宮頸癌以及其它高表達MTA1的惡性腫瘤。
5.一種藥物組合物，其特征在于含有治療有效劑量的如權(quán)利要求1所述的抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的特異性干擾MTA1 mRNA的干擾RNA序列，以及藥學上可接受的載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物組合物，其特征在于所述的載體為病毒表達載體和非病毒表達載體，
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其特征在于所述的病毒表達載體包括腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其特征在于所述的非病毒表達載體包括各種質(zhì)粒載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的RNA序列，其特征在于所述的干擾RNA序列為化學合成法合成雙鏈干擾RNA(siRNA)和構(gòu)建包含該RNA模板的質(zhì)粒在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄成雙鏈干擾RNA。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種特異性干擾MTA1 mRNA的干擾RNA序列及其用途，尤其是涉及一種抑制哺乳動物包括人腫瘤轉(zhuǎn)移的特異性干擾MTA1 mRNA的干擾RNA序列，其包括正義鏈5’－GAACATCTACGACATCTCCTT－3’和，反義鏈3’－TTCTTGTAGATGCTGTAGAGG－5’。
文檔編號C12N15/63GK1924014SQ200510093698
公開日2007年3月7日 申請日期2005年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月1日
發(fā)明者林晨, 錢海利, 詹啟敏, 孫文欣, 張雪燕, 付明, 梁蕭 申請人:中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所